dr hab. Beata Krawczyk Katedra Mikrobiologii PG Publikacja współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Transkrypt

1 Wk Wykrywanie polimorfizmów i mutacji Badania przesiewowe mutacji Wykrywanie znanych mutacji punktowych dr hab. Beata Krawczyk Katedra Mikrobiologii PG Publikacja współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

2 Różnica pomiędzy polimorfizmem a mutacją Analiza DNA Badanie właściwości zmienionych produktów genów

3 Polimorfizm genetyczny wynika z: Różnic w sekwencji Wielkości fragmentu DNA spowodowanej różną liczbą powtórzeń

4 Mutacja u podstaw chorób genetycznych i nowotworów Zakres zastosowania metod wykrywanie punktowych insercji, delecji i substytucji wykrywanie insercji, delecji bądź translokacji fragmentów DNA badanie ekspresji genów związanych z chorobą mutacje związane z opornością ś wielolekową l MDR1

5 Korzyści wynikające z zastosowania metod molekularnych możliwość wykrycia choroby przed pojawieniem się objawów fenotypowych eliminacja elementu subiektywnego z diagnozy potencjalne zwiększenie pewności diagnozy MUTACJA MOŻE WYSTĘPOWAĆ TYLKO NA MUTACJA MOŻE WYSTĘPOWAĆ TYLKO NA JEDNYM ALLELU I NIE MUSI DOTYCZYĆ WSZYSTKICH KOMÓREK BADANEGO ORGANIZMU

6 Materiał do analizy mutacji Korzyści i wady Strony dodatnie Genomowe DNA - łatwo pozyskiwany materiał (krew); - w przypadku autosomalnych loci oba allele są reprezentowane na równi; -są wykrywalne mutacje w sekwencjach promotorowych i miejscach łączenia intronów ; - do analizy wybieramy autosomalne cechy dominujące. mrna - można analizować długie regiony kodujące peptydy - nie jest potrzebna informacja o strukturze genu - widoczne są abberacje w rozmiarze mrna Strony ujemne - potrzebna informacja o sekwencji genomu i strukturze genu - analizie poddawane są małe segmenty kodujące (egzony) - nie zawsze zachodzi ekspresja genu w badanej próbce - autosomalne loci reprezentują tylko jeden allel - nie wykrywamy mutacji w sekwencjach promotorowych i łącznikach intronów

7 Metody przesiewowe identyfikacji zmian w sekwencjach nukleotydów Oparte są na porównaniu wielkości lub/i konformacji badanych dwu- lub jednoniciowych fragmentów kwasów nukleinowych

8 Techniki cytogenetyczne Dla ekstremalnie dużych delecji i insercji ( >1 Mb) np. FISH (Fluorescent in situ hybridization) - stosuje się fluorescencyjnie wyznakowane sondy DNA, metoda ta pozwala na wykrycie mutacji i jej lokalizację. Można stosować jednocześnie wiele sond wyznakowanych różnymi związkami fluorescencyjnymi. Zastosowanie do wykrywania ywa a aneuploidów, mikro - delecji, duplikacji, utraty heterozygotyczności (nowotwory).

9 RFLP - polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych To dziedziczne warianty sekwencji DNA, które objawiają się utworzeniem lub zanikiem miejsca rozpoznawanego przez endonukleazy restrykcyjne yj lub zmianę liczby nukleotydów między takimi miejscami

10 Metody przesiewowe identyfikacji zmian w sekwencjach nukleotydów Hybrydyzacja y y Southern blot wykrywa y duże mutacje, jak i mutacje punktowe po uprzednim zastosowaniu enzymu restrykcyjnego, obecność lub nieobecność miejsca restrykcyjnego świadczy i d o mutacji i może być wykryta sondą (zmieniony wzór restrykcyjny )

11 Miejsce wiązania sondy blisko polimorficznego miejsca (+/_) 6 kpz kpz Dziki allel 6 Zmutowany allel 2 2 kpz (+/_) 4 kpz Southern blot Specyficzne zmiany w rozmiarze i liczbie prążków jako wynik obecności/nieobecności choroby

12 RFLP/PCR From: Medical Biomethods Handbook Edited by: J. M. Walker and R. Rapley Humana Press, Inc., Totowa, NJ

13 Restriction Site Mutation (RSM) Kontrola 1 2 Marker Nietrawione Trawione HT HO From: Medical Biomethods Handbook Edited by: J. M. Walker and R. Rapley Humana Press, Inc., Totowa, NJ

14 Analiza RSM w wykrywaniu mutacji p53 w kodonie 248 (msc cięcia dla enzymu MspI) Mutacja w p53 K+ Wykrywanie stanu przedrakowego przełyku Wt From: Medical Biomethods Handbook Edited by: J. M. Walker and R. Rapley Humana Press, Inc., Totowa, NJ

15 PCR - RFLP Analiza pośrednia polimorfizmów, tzn. identyfikuje zmutowany gen bez określenia położenia mutacji (analiza sprzężeń w danej rodzinie markera RFLP z chorobą) Analiza bezpośrednia ś di konieczne dobranie enzymu rozpoznającego miejsce mutacji Sztuczne wprowadzenie miejsca restrykcyjnego

16 Utrata miejsca restrykcyjnego / pojawienie się miejsca restrykcyjnego Utrata miejsca restrykcyjnego wskutek mutacji A T Normalny Mutant Utworzenie miejsca restrykcyjnego wskutek mutacji T C Normalny Mutant --T CCT GAG GAG A GGA C TC C TC T CC T GTG GAG A GGA CAC C TC --G ACC TGG AC G AC C G GG AC C TGG ACC TG C TGG CCC TG Trawienie Mst II Trawienie Nci I C CT NAG G GGA NTC C X X CC GGG GG CCC Fragmenty restrykcyjne Fragmenty restrykcyjne yj

17 PCR-RFLPRFLP znalazło zastosowanie do wykrywania CFTR mukowiscydozy (400 wariantów mutacji) Fenyloketonuria Anemia sierpowata Hemofilia Dystrofia mięśniowa Zespół łamliwego chromosomu

18 OKREŚLENIE NOSICIELSTWA DYSTROFII W RODZINIE Z JEDNYM DZIECKIEM CHORYM DMD PCR/TAQ Wykrywanie zmutowanego genu metodą PCR-RFLPRFLP O SII SI B Ch M K 416 pz Taq (-) Taq (+) 234 pz 182 pz Rys. Analiza DNA red. Słomski

19 Analiza heterodupleksów (HA) ang. Heteroduplex analysis Polega na wychwyceniu powstającego w wyniku mutacji braku parowania pomiędzy pojedynczymi nukleotydami w komplementarnych (dwuniciowych) fragmentach kwasów nukleinowych. Struktury wytwarzane w zależności od typu mutacji: pęcherzyki pęcherzyki (substytucje), zgięcia nici DNA, wybrzuszenia jednostronne (insercje lub delecje) Na skuteczność wykrywanych zmian wpływa ich rodzaj oraz położenie względem końca. Heterodupleksy w natywnym żelu poliakryloamidowym migrują z inną szybkością niż homodupleksy charakteryzujące się komplementarnością na całej swej długości. Istotna rozdzielczość żeli; barwienie srebrem lub fluorescencyjna detekcja PCR-HD Metoda przesiewowa do produktów o wielkości poniżej 200 pz i powyżej 400 pz Zmutowane fragmenty można poddawać bezpośredniemu sekwencjonowaniu metodą cykliczną

20 Technika SSCP ang. Single Strand Conformation Polymorphism (= SSC A) DZIKI TYP SEKWENCJI MUTANT ds DNA denaturacja ss DNA oparta o analizę zmiany szybkości migracji jednoniciowych fragmentów na niedenaturującym żelu poliakryloamidowym l id wykrywa zmiany w strukturze II rzędowej ssdna, wykrywa, ale nie lokalizuje mutacji - + Mutant DZIKI Dla fragmentów pz 70 95% wykrywalności Dla fragmentów >400 pz <50% wykrywalności Warunki elektroforezy: 20 C z glicerolem lub /i 4 C

21 Technika dideoksy-fingerprinting (ddf ddf) Metoda polega na połączeniu analizy SSC i DS. (ang. direct sequencing) tj. po amplifikacji produkt PCR jest sekwencjonowany np. z ddctp otrzymujemy drabinkę prążków;

22 PCR na matrycy genomowego DNA Dideoksy - fingerprinting Oczyszczanie produktu PCR na kolumienkach Sk Sekwencjonowanie ze starterem t znakowanym fluorochromem i jednym z dd nukleotydów Denaturacja produktów sekwencjonowania Rozdział elektroforetyczny na sekwenatorze DNA i analiza komputerowa Sekwencje typu dzikiego i zmutowanego są rozdzielane na żelu niedenaturującym (SSCP). Mutacje są wykrywane jako przesunięcia indywidualnych prążków w drabince; Metoda pozwala na wykrycie i lokalizację zmienionej sekwencji

23 Technika DGGE ang. denaturing gradient gel electrophoresis - powielone techniką PCR fragmenty DNA nanosi się na żel poliakryloamidowy, w którym uformowany jest rosnący gradient czynnika denaturującego (związek chemiczny) lub temperatura t (TGGE). Wykrywa, ale nie lokalizuje mutacji Zmutowane DNA (m) Dziki typ DNA (wt) Denaturacja i mix Homo i hetrodupleksy DNA Elektroforeza w gradiencie denaturującym wt wt+m Różne zachowanie się cząsteczek Każdy fragment DNA posiada melting domains. Rozdział ł opiera się na spadku elektroforetycznej mobilności w żelu o liniowym gradiencie czynnika denaturującego DNA (mocznik, formamid) lub liniowym gradiencie temperaturowym. Metoda skuteczna dla fragmentów > pz; wykrywalność %; skuteczność wzrasta po dodaniu do końców 5 sekwencji G-C clamp np. Do wykrywania hemofilii Wzrost czynnika denaturującego

24 Metoda CMC (ang. chemical mismatch cleavage)- niesparowane w heterodupleksie nukleotydy y są ą chemicznie modyfikowane (czterotlenek osmu modyfikuje niesparowane tyminy, hydroksylamina zmienione cytozyny),co prowadzi do przecięcia cząsteczki w miejscu ich występowania przez piperydynę Rozdział na żelu denaturującym

25 Metoda EMC ang. Enzyme Mismatch Cleavage Enzymatyczne cięcie niesparowanego regionu EndonukleazaVII faga T7 rozpoznaje niekomplementarności w heterodupleksach DNA, a następnie trawi DNA w obrębie 6 par zasad na końcu 3 od niekomplementarności. Powstające produkty trawienia są następnie rozdzielane na żelach sekwencyjnych. Metoda ta ma możliwość detekcji 98% mutacji zlokalizowanych wewnątrz fragmentów wielkości do czterech tysięcy par zasad, ale endonukleaza VII faga T4 nie pozwala na wykrycie niekomplementarności A:A, T:T; EndonukleazaV faga T4 rozpoznaje fotodimery, odcina zasady zdimeryzowane i trawi DNA w miejscach apurynowych i apirymidynowych, dzięki czemu nadaje się do badania powstawania mutacji pod wpływem promieniowania UV.

26 Metoda ciecia RNAzą A ang. RNAse A Cleavage Method Stosowana do analizy kompleksu DNA-RNA, rybonukleaza A jest wykorzystana do cięcia w niesparowanych miejscach Wykrywanie mutacji punktowych z wykorzystaniem elektroforezy agarozowej zawierającej bisbenzyamid- PEG Bisbenzyamid preferuje wiązanie do motywu bogatego w A+T; agaroza jest związana z długimi i łańcuchami h i PEG 6000, która wykazuje silne powinowactwo do bisbenzyamidu. Możliwość wykrywania mutacji punktowych we fragmentach DNA pz; np. TTcAT TTtAT; wytwarzane jest nowe miejsce wiązania dla bisbenzyamidu, spadek mobilności elektroforetycznej fragmentów spowodowany wzrostem ilości wiązań z PEG;

27 Technika TTP Przedwczesna terminacja transkrypcji (ang.. Protein Truncation Test)

28 Białko MutS Pozwala na bezpośrednie wykrycie mutacji, tworzy kompleksy z heterodupleksami DNA w miejscach niekomplementarnych; zastosowanie barwnika fluorescencyjnego SYBR-Green lub SYBR-Gold do detekcji

29 Rys. Dokumentacja KM PG

30 Mut-Ex Ex-PCR Rys. Dokumentacja KM PG

31 Zastosowanie LCR do wykrywania znanych mutacji

32 ARMS (ang. Amplification-Refractory Mutation System) O obecności mutacji decyduje porównanie wyników dwóch niezależnych reakcji PCR. W reakcjach tych jeden starter jest wspólny (identyczny), drugi zaś jest bądź ą komplementarny do sekwencji prawidłowej, bądź do sekwencji zmienionej w wyniku mutacji.

33 ARMS Homozygota allel 1 Homozygota allel 2 produkt Brak produktu Brak pproduktu produkt Heterozygota produkt produkt