WYSOKOSPRAWNA CHROMATOGRAFIA CIECZOWA

WYSOKOSPRAWNA CHROMATOGRAFIA CIECZOWA materiały do ćwiczeń seminaryjnolaboratoryjnych Materiały zebrała i przygotowała do druku: dr inŝ. Agata Kot-Wasik, Katedra Chemii Analitycznej, Politechnika Gdańska

SPIS TREŚCI Ćwiczenie 1 Dobór warunków rozdzielania w układzie faz odwróconych dla warunków elucji izokratycznej i gradientowej. Dr inŝ. B. Makuch, mgr inŝ. J. Wilga, mgr inŝ. E. Gilgenast, Ćwiczenie 2 Rozwiązywanie problemów technicznych w HPLC. Retencja, selektywność, sprawność i rozdzielczość w układzie faz normalnych. Prof. dr hab. inŝ. M. Kamiński, mgr inŝ. G. Romanik Ćwiczenie 3 Walidacja metody analitycznej wykorzystującej HPLC w praktyce. Dr inŝ. P. Konieczka, Dr M. Ślebioda Ćwiczenie 4 Rozdzielanie, identyfikacja i oznaczenie ilościowe związków pochodzenia farmaceutycznego w próbkach. Dr inŝ. A. Kot-Wasik

ĆWICZENIE 1 DOBÓR WARUNKÓW ROZDZIELANIA W UKŁADZIE FAZ ODWRÓCONYCH DLA WARUNKÓW ELUCJI IZOKRATYCZNEJ I GRADIENTOWEJ mgr inŝ. J. Wilga, mgr inŝ. E. Gilgenast Pani Joanna Wilga, Ewelina Gilgenast są doktorantkami na Studium Doktoranckim przy Wydziale Chemicznym Politechniki Gdańskiej; jawil@wp.pl Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest przeprowadzenie dobór optymalnych warunków rozdzielenia substancji w układzie faz odwróconych, na przykładzie ekstraktu z liści z Ginkgo bilobae. Rysunek 1. Liście Ginkgo bilobae JuŜ przed wiekami odkryto, Ŝe liście Ginkgo bilobae, tej najstarszej na świecie rośliny zawierają związki flawonoidowe i terpenoidowe, które potrafią stymulować procesy pamięciowe mózgu, wpływają pomocniczo w zwalczaniu zaburzeń obwodu krąŝenia krwi, a takŝe w zaburzeniach pracy mózgu spowodowanych zaburzeniami krąŝenia mózgowego, a rozmaite produkty zawierające Ginkgo robią obecnie zawrotną karierę i są stosowane w postaci tabletek lub w roztworze. Ekstrakty roślinne są złoŝonymi, wieloskładnikowymi mieszaninami związków znacznie róŝniących się właściwościami chemicznymi. Dobór warunków rozdzielania moŝe być procesem trudnym i pracochłonnym. Na ogół bywa, Ŝe nie jest moŝliwe rozdzielenie w układzie izokratycznym (stały skład fazy ruchomej) i naleŝy stosować gradient (zmiana skokowa bądź ciągła składu fazy ruchomej). Obecnie najczęściej stosowanymi układami rozdzielania metodą Wysokosprawnej Chromatografii Cieczowej (HPLC) jest tzw. układ faz odwróconych (RP) i moŝna zaryzykować stwierdzenie, Ŝ e90% wszystkich rozdzielań wykonuje się w tych układach z zastosowaniem fazy stacjonarnej typu RP 18 tzn. Ŝel krzemionkowy modyfikowany grupą oktadecylową. W praktyce laboratoryjnej doboru faz rozdzielania dokonuje się przez: a zmianę składu fazy ruchomej - zmiana ilościowego udziału rozpuszczalników, b zmianą ph fazy ruchomej, c- zastosowanie pary jonowej, e zmiana typu fazy ruchomej.

W trakcie wykonywania ćwiczenia będą uwzględniane punkty a, b, c, e. Rozpuszczalniki stosowane jako fazy ruchomew układach RP wg ich iły elucyjnej to woda (najsłabszy) < MeOH< ACN < EtOH < THF < iproh < chlorek metylenu (najsilniejszy). W praktyce najczęściej stosuje się 4 ry rozpuszczalniki w róŝnych układach tj. wodę, metanol, acetonitryl i tetrahydrofuran, a parametry retencji mogą być regulowane składem fazy ruchomej. Podstawowa zaleŝność to wzrost zawartości rozpuszczalnika bardziej polarnego w fazie ruchomej obniŝa wartość współczynnika retencji (k). Bywają takie problemy rozdzielcze, które moŝna rozwiązać poprzez zamianę rozpuszczalnika w fazie ruchomej; moŝna np. zamienić metanol na tetrehydrofuran. Przy załoŝeniu stałej siły elucyjnej fazy ruchomej korzysta się z prostej zaleŝności: S T = Σ S i θ i gdzie: S T całkowita siła elucyjna fazy ruchomej, S i siła elucyjna rozpuszczalnika θi udział molowy rozpuszczalnika w fazie ruchomej. Przykład: mamy skład fazy ruchomej MeOH : H 2 O w stosunku objętościowym 7:3. Wówczas całkowitą siłę elucyjną fazy ruchomej liczymy wg powyŝszej zaleŝności otrzymując: S T = S MeOH θ + S H2O θ = 2,6 x 0,7 + 0 x 0.3 = 1,82 Gdy zastąpimy metanol tetrahydrofuranem przy załoŝeniu takiej samej siły elucyjnej fazy ruchomej to obliczenie jest następujące: 1,82 = 4,5 x X + 0 x X ok. 40 czyli nowy skład fazy ruchomej będzie następujący THF : H2O 4: 6 (v/v). Innym sposobem doboru warunków rozdzielania jest zmiana ph fazy ruchomej. W przypadku rozdzielania związków o charakterze słabych kwasów, fazę ruchomą zakwaszamy, zaś w przypadku rozdzielania słabych zasad fazę ruchomą alkalizujemy. Efektem takich zabiegów jest wzrost współczynnika retencji co w konsekwencji prowadzi do rozdzielenia związków, które zbyt szybko opuszczają kolumnę chromatograficzna. Zmiana ph powoduje cofnięcie dysocjacji. W układach RP mogą być stosowane równieŝ inne typy faz stacjonarnych np. RP 8, rzadziej RP 2, jak równieŝ Ŝel modyfikowany grupa cyjanową lub fenylową. W kaŝdym przypadku kolejność elucji jest następująca: pierwsze eluują substancje polarne (hydrofilowe)a w dalszej kolejności substancje niepolarne (hydrofobowe). W przypadku rozdzielania węglowodorów czas elucji jest zaleŝny od długości łańcucha fazy związanej z Ŝelem krzemionkowym.

WYKONANIE ĆWICZENIA W trakcie ćwiczenia dobierane będą optymalne warunki rozdzielenia substancji czynnych w ekstrakcie Ginkgo bilobae, w układzie faz odwróconych. Pomiar wykonany zostanie w warunkach izokratycznych,; przy mierzonej długości fali λ = 330 nm. Wykorzystywane kolumny chromatograficzne: - LiChrospher RP-18 - Kolumna cyjanowa Wykorzystywane fazy ruchome: - MeOH : H 2 O (7:3 v/v) - MeOH : H 2 O (9:3 v/v) - MeOH: H 2 O (7:3 v/v) z dodatkiem H 3 PO 4 (1%) - THF:H 2 O (4:6 v/v) - THF:H 2 O (4:6 v/v) z dodatkiem H 3 PO 4 (1%) - MeOH: H 2 O (7:3 v/v) z dodatkiem H 3 PO 4 (0,1%) - THF:H 2 O (4:6 v/v) z dodatkiem H 3 PO 4 (0,1%) Parametry aparatury Detektor UV/DAD L 7450 firmy Merck HITACHI Pętla dozująca 20µl Dozownik Rheodyne 7125 Pompa L 6200 firmy Merck HITACHI

Notatki własne

η dla ĆWICZENIE 3 WALIDACJA METODY ANALITYCZNEJ WYKORZYSTUJĄCEJ HPLC Dr M. Ślebioda, dr inŝ. P. Konieczka Pan Marek Ślebioda jest pracownikiem Perlan Technologies Polska Sp. z o.o. ul. Puławska 303, 02-785 Warszawa; www.perlan.com.pl Pan Piotr Konieczka jest pracownikiem Katedry Chemii Analitycznej Wydziału Chemicznego Politechniki Gdańskiej; kaczor@chem.pg.gda.pl Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest zapoznanie uczestników z moŝliwością automatyzacji przygotowania, wykonania i opracowania testów związanych z walidacją metody chromatograficznej. Przeprowadzone zostanie wyznaczenia granicy oznaczalności (LOQ) i wykrywalności (LOD) kilku związków zawartych w mieszaninie w oparciu o metodę krzywej wzorcowej. Ogólny opis wymagań dotyczących walidacji metod chromatograficznych moŝna znaleźć w odpowiednich artykułach ciał normalizujących ten proces. Skrót zawarty jest w publikacji [1]. Podstawowe definicje Granica wykrywalności jest zdefiniowana jako ilość (lub stęŝenie) analitu dająca odpowiedz y DL znacząco róŝną (trzy odchylenia standardowe s B ) od szumu tła y B : (1) ydl yb = 3sB Pomimo moŝliwosci zastosowania obliczeń elektronicznych bezpośredni pomiar y B oraz s B jest zwykle w metodach chromatograficznych niedogodny i niedokładny ze względu na małe wielkości mierzone. Wartość s B moŝe być zastąpiona przez oszacowanie błędu standardowego s e z krzywej regresji ilość analitu względem odpowiedzi: (2) s e = ( y y ) obs n η est 2 gdzie y obs jest wartością obserwowaną y est jest wartością obliczoną z krzywej kalibracyjnej n jest liczbą punktów kalibracyjnych regresji liniowej wynosi 2 W punkcie odpowiadającym granicy wykrywalności y DL = A C DL + y B, gdzie C DL jest ilością analitu odpowiadającą granicy wykrywalności oraz A jest czułością analityczna (nachyleniem prostej regresji). Łącząc te równania otrzymuje się: 3se (3) CDL = A Jako granicę oznaczalności moŝna uwaŝać najmniejszą ilość analitu, która daje się oznaczyć z wystarczającą precyzją (dziesięć odchyleń standardowych s B ). Stosując oszacowanie błędu na podstawie linii regresji moŝna ją obliczyć jako: 10se (4) CQL = A Program obliczeniowy Do projektowania walidacji, zbierania danych i wykonania obliczeń zastosowany zostanie automatyczny program obliczeniowy Method Validation Pack [i] współpracujący z programem sterującym chromatografem. Po zebraniu danych i ich ocenie moŝna w programie Method Validation Pack wygenerować automatycznie raport końcowy zawierający wyniki analizy statystycznej. Dostępne w programie wzorce walidacji pozwalają na szybką konfigurację testów zgodnie z zaleceniami ICH Q2A/2B, USP, EP, DIN oraz FDA. Istnieje moŝliwość dołączenia do raportu z walidacji elektronicznych wersji standardowych procedur operacyjnych oraz innych dokumentów związanych z procesem walidacji. Sposób działania programu przedstawiony jest schematycznie na rysunku 1.

Rysunek 1. Wymiana informacji w programie Method Validation Pack Sprzęt i odczynniki Aparatura Zestaw do wysokosprawnej chromatografii cieczowej składający się z pompy gradientowej, automatycznego podajnika próbek, termostatu kolumn i detektora UV-Vis [2]. Kolumna chromatograficzna ZORBAX Eclipse XDB-C8, dp=5µm, 4.6x150mm [3]. Zestaw sterujący zawierający programy ChemStation [4], ChemStore [5] oraz Method Validation Pack [6]. Odczynniki Metanol, do HPLC Woda, Mili-Q Próbka testowa Isocratic standard [7] zawierająca 0.15%w/w ftalanu dimetylowego, 0.15%w/w ftalanu dietylowego, 0.01%w/w bifenylu i 0.03%w/w orto-terfenylu w metanolu. Metoda analityczna Oznaczenia zostaną przeprowadzone przy pomocy izokratycznej metody chromatograficznej z detekcją UV-Vis. Faza ruchoma: metanol + woda (80+30)v/v Przepływ fazy ruchomej: 1.5 ml/min Temperatura: 25ºC Objętość próbki: 5 µl Detekcja: 254/10 nm (jednowiązkowa) Przebieg ćwiczenia Planowanie walidacji Zakres badań, jakie podejmuje laboratorium w trakcie walidacji nowej, zmodyfikowanej lub nie stosowanej dotychczas metody, zaleŝy od istniejącego statusu metody i kompetencji laboratorium. W trakcie walidacji metody trzeba zdefiniować parametry, granice akceptacji i częstotliwość rutynowych testów przystawalności lub bieŝącej kontroli jakości analitycznej metody. NaleŜy takŝe określić kryteria wskazujące, kiedy metoda jest poza granica kontroli statystycznej. Laboratorium prowadzące walidacje metody powinno w pełni udokumentować kompletność procesu walidacji. W trakcie ćwiczenia pokazany zostanie sposób dołączania elektronicznych wersji dokumentów do raportu z walidacji generowanego przez program Method Validation Pack. Jako przykładowy dokument zostanie uŝyty opis metody chromatograficznej wydrukowany z programu sterującego ChemStation do pliku w formacie pdf.

Identyfikacja pików chromatograficznych Podstawą działania programu Method Validation Pack jest rozpoznanie pików chromatograficznych związków, dla których mają być prowadzone testy walidacyjne. W tym celu zostanie przeprowadzona analiza wzorca o najmniejszym stęŝeniu (wzorzec 1). Chromatogram z tej analizy będzie podstawą do ustalenia parametrów integracji i identyfikacji pików chromatograficznych. Szczegółowe instrukcje dotyczące sprzętu i programu poda prowadzący ćwiczenie. NaleŜy uruchomić program ChemStation bez podłączenia do bazy danych: Następnie naleŝy wczytać metodę chromatograficzą MV_lab.m, wypełnić dane dotyczące próbki wpisując katalog Grupa_x i nazwę pliku danych Test_x (gdzie x jest numerem grupy ćwiczeniowej). Otrzymany chromatogram powinien być zbliŝony do przedstawionego na rysunku 2. mau 100 DAD1 A, Sig=254,4 Ref=550,100 (DEMO\005-0101.D) 0.747 80 1.021 60 40 będą 20 0 1 2 3 4 5 6 min Rysunek 2. Typowy chromatogram próbki isocratic standard NaleŜy przeprowadzić automatyczny dobór parametrów integracji pików chromatograficznych Ze względu na ramy czasowe, w trakcie ćwiczenia nie omawiane sposoby doboru parametrów integracji i ich wpływ na wyniki ilościowe oznaczenia. Do tabeli kalibracyjnej trzeba wprowadzić nazwy związków i odpowiadające im ilości. 2.565 5.837

Na koniec naleŝy zapisać metodę chromatograficzną pod zmienioną nazwą: File -> Save as... -> Method -> Grupa_x.m Utworzenie pliku walidacji w programie Method Validation Pack Przygotowanie testów walidacyjnych oraz dokumentacji zostanie wykonane w programie Method Validation Pack. PoniŜej opisane są skrótowo niezbędne kroki. Dokładnych wskazówek udzieli prowadzący ćwiczenie. NaleŜy uruchomić program Method Validation Pack podłączając się do bazy danych MV_lab.mdb jako uŝytkownik admin (hasło admin). W następnym kroku trzeba utworzyć nową walidację Grupa_x Zaznaczając prawym okiem myszy nazwę walidacji moŝna zmienić jej parametry ogólne. Po pierwsze naleŝy ustalić, czy wymagany jest podpis elektroniczny zgodnie z normą 21CFR 11? W ramach ćwiczeń to wymaganie nie będzie stosowane.

Do projektu walidacji zostanie dołączony przykładowy dokument zewnętrzny (parametry metody chromatograficznej wyeksportowane z programu ChemStation). W rzeczywistości powinny to być odpowiednie dokumenty związane z walidacją, takie jak opis projektu, standardowe procedury operacyjne i inne. Program Method Validation Pack dołączy je automatycznie do raportu końcowego i będzie przechowywał elektronicznie powiązania dokumentów. W tym celu naleŝy wybrać kolejno opcje: External Documents -> Add i wybrać z katalogu Hpchem / 1 /Temp dokument Metoda.pdf. Parametry testów statystycznych stosowanych podczas walidacji moŝna dostosować wybierając opcję Configuration i odpowiednią zakładkę. W trakcie ćwiczenia będą uŝywane ustawienia domyślne. W oknie dialogowym Properties moŝna równieŝ wpisać domyślne nagłówki, które będą obowiązywały dla całej walidacji, wybierając opcję Default Header Data. Węzły walidacji Węzłami walidacji są nazwy związków obecnych w analizowanej mieszaninie, do których będą przyporządkowane testy walidacyjne. Uwaga: nazwy węzłów muszą ściśle odpowiadać nazwom związków w tabeli kalibracyjnej walidowanej metody zadeklarowanym poprzednio w programie ChemStation.

Węzeł moŝna utworzyć zaznaczając prawym okiem myszy nazwę walidacji i wybierając opcję Add Component... Po wpisaniu nazwy węzła trzeba wybrać rodzaj testu walidacyjnego, czyli w tym ćwiczeniu Limit of detection / quantitation W kolejnych krokach moŝna dodać następne węzły. Szczegółowe planowanie kaŝdego testu moŝna rozpocząć po zaznaczeniu tego testu prawym okiem myszy i wybraniu opcji Planning. W czasie ćwiczenia instruktor zasugeruje sposób wypełnienia pojawiającej się tablicy dialogowej. Ustawienia globalne Przed przystąpieniem do eksportowania zadań z programu Method Validation Pack do programu ChemStation sterującego sprzętem dobrze jest sprawdzić i skorygować ustawienia globalne dotyczące sposobu traktowania danych źródłowych oraz wyglądu raportu. Wybierając menu rozwijalne Utilities -> Options oraz odpowiednie zakładki moŝna edytować ogólny sposób działania programu Method Validation Pack. W trakcie ćwiczenia zostanie sprawdzony i odpowiednio ustawiony sposób traktowania danych źródłowych w zakładce C/S (ChemStore).

Eksport badania do bazy danych Ostatnim zadaniem podczas planowania walidacji jest eksport zadań do bazy danych, z której mogą być w dogodnym czasie wczytane do programu ChemStation. Po wybraniu opcji Create Study and MVS for ChemStation Plus w polu MVS Status uruchomiony zostanie kreator eksportu badania. Odpowiednie kroki działania tego kreatora zostaną omówione w czasie ćwiczenia. Import zadania do programu ChemStation Przed rozpoczęciem wczytywania zadania do programu sterującego ChemStation uŝytkownik tego programu musi być podłączony do odpowiedniej bazy danych. W programie ChemStation naleŝy wybrać Database Logon..., wybrać bazę danych MV_lab i wpisać hasło Po podłączeniu do bazy danych moŝna przeprowadzić import sekwencji wygenerowanej w programie Method Validation Pack

Sekwencja jest wykonywana w programie ChemStation, a wyniki są zapisywane w bazie danych. Import danych do programu Method Validation Pack Program Method Validation Pack moŝe pobierać wyniki oznaczeń z danych programu ChemStation, importować je z róŝnych formatów plików oraz mogą one być wprowadzane ręcznie. W trakcie ćwiczenia zostanie przeprowadzony: Import danych uzyskanych po wykonaniu sekwencji w programie ChemStation Import danych z pliku w formacie Excel Ręczne uzupełnienie danych Szczegóły poda prowadzący ćwiczenia Raport z walidacji metody W ramach ćwiczenia zostanie pokazany sposób generowania ogólnego lub częściowego raportu z walidacji metody w programie Method Validation Pack Literatura 1. M. Ślebioda, Walidacja metod chromatograficznych, Perlan Technologies (2004) 2. Agilent Technologies Inc., numer produktu G2184AA 3. Agilent Technologies Inc., seria 1100 4. Agilent Technologies Inc., numer produktu 993967-906 5. Agilent Technologies Inc., numer produktu G2070AA 6. Agilent Technologies Inc., numer produktu G2181BA 7. Agilent Technologies Inc., numer produktu 01080-68704

Notatki własne

ĆWICZENIE 3 WALIDACJA METODY ANALITYCZNEJ WYKORZYSTUJĄCEJ HPLC dr inŝ. P. Konieczka Pan Piotr Konieczka jest pracownikiem Katedry Chemii Analitycznej Wydziału Chemicznego Politechniki Gdańskiej; kaczor@chem.pg.gda.pl 1. Na podstawie wyników pomiarów dla krzywej kalibracyjnej (wykorzystując program Excel) obliczyć: a. Wartości średnie wyników dla danego poziomu zawartości wraz z wartościami odchyleń standardowych, wyniki umieścić w poniŝszej Tabeli 1. Tabela 1 Roztwór wzorcowy/stęŝenie 1 Sygnał 2 3 Średnia Odchylenie standardowe CV, % Rw 1 Rw 2 Rw 3 Rw 4 Rw 5 Rw 6 Rw 7 b. Podać wartości powtarzalności...... c. Wykreślić krzywą kalibracyjną na podstawie wszystkich punktów pomiarowych (dane wprowadzić do przygotowanego arkusza).

60 50 40 30 20 10 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 d. Przedyskutować liniowość.... e. Na podstawie wykresu wyznaczyć wartość niepewności kalibracji dla średniej wartości stęŝenia.... f. Wykreślić krzywą kalibracyjną na podstawie punktów pomiarowych odpowiadającym trzem najmniejszym stęŝeniom (dane wprowadzić do przygotowanego arkusza). g. Wyznaczyć (w oparciu o parametry krzywej kalibracyjnej) wartość LOD na podstawie odchylenia standardowego: i. Wyrazu wolnego s a... ii. Resztkowego s xy... iii. Dla roztworów wzorcowych o najmniejszym stęŝeniu... h. Podać zakres pomiarowy.... i. Otrzymane wartości parametrów walidacyjnych wprowadzić do Tabeli 2. Tabela.2 Parametr walidacyjny Powtarzalność Liniowość LOD LOQ Zakres pomiarowy Niepewność Wartość

Notatki własne

ĆWICZENIE 2 ROZWIĄZYWANIE PROBLEMÓW TECHNICZNYCH W HPLC. RETENCJA, SELEKTYWNOŚĆ, SPRAWNOŚĆ I ROZDZIELCZOŚĆ W UKŁADZIE FAZ NORMALNYCH. Prof. dr hab. inŝ. M. Kamiński, mgr inŝ. G. Romanik Pan Marian Kamiński jest pracownikiem Katedry Chemii Analitycznej Wydziału Chemicznego Politechniki Gdańskiej; mknkj@wp.pl Pani GraŜyna Romanik jest doktorantką na Studium Doktoranckim przy Wydziale Chemicznym Politechniki Gdańskiej. Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z najstępującymi zagadnieniami: geneza oraz sposoby rozwiązywania problemów, spotykanych w praktyce i dotyczących kolumny, dozowania, detekcji, elucji gradientowej; zasady postępowania w celu doboru warunków rozdzielania w układach NP-HPLC; metodyka zastosowania chromatografii Ŝelowej (GPC, SEC) do oznaczania rozkładu masy molekularnej polimerów; obserwacja przebiegu rozdzielania barwnych substancji w kolumnie HPLC. Streszczenie przebiegu ćwiczenia 1. Zapoznanie Uczestników z alternatywnymi sposobami postępowania, zapewniającymi zapobieganie / eliminację problemów spotykanych w praktyce i dotyczących: - doboru/oceny selektywności, sprawności, rozdzielczości i przepuszczalności kolumny, - dozowania bardzo małych i bardzo duŝych objętości próbki oraz doboru odpowiedniego rozpuszczalnika roztworu dozowanego do kolumny, - doboru właściwej metody detekcji oraz najkorzystniejszych warunków pracy najwaŝniejszych detektorów stosowanych w HPLC (UV-VIS, RI, FLD), - problemów spotykanych w warunkach elucji gradientowej i sposobów ich eliminacji / minimalizacji : zanieczyszczenie składników eluentu, obecność rozpuszczonego powietrza w cieczach stanowiących składniki eluentu, niedoskonałość systemu synchronizacji pracy zaworów proporcjujących i cyklicznej pracy pompy, nieodpowiednie parametry mieszalnika, demiksja składników eluentu w warunkach programowania składu cieczy eluującej, wytrącanie się składników próbki w eluencie o niskiej sile elucyjnej i innych. 2. Przykład wpływu składu eluentu na retencję i selektywność rozdzielania: chlorofili i karotenoidów zawartych w ekstrakcie roślinnym, albo produktów naftowych, albo mieszanin innych substancji nisko i średnio polarnych (do wyboru przez uczestników grupy) oraz przedstawienie i przedyskutowanie zakresu zastosowania detektora UV-VIS/DAD do zastosowań jakościowych oraz do określania tzw. czystości pików ; 3. Przedstawienie metodyki zastosowania chromatografii Ŝelowej do oznaczenia rozkładu masy molekularnej polimeru - kalibracja nisko-dyspersyjnymi standardami polimeru, a następnie oznaczenie rozkładu masy cząsteczkowej próbki polimeru (styropian, sztućce, albo fragment obudowy styropianowej). 4. Wizualna obserwacja przebiegu rozdzielania chlorofili i karotenoidów w kolumnie szklanej w warunkach NP-HPLC z detekcją UV-254, rejestracją w trybie Y-t. oraz kolekcją frakcji przykład preparatywnego zastosowania HPLC w skali modelowej.

Materiały, aparatura, oprogramowanie Składniki eluentu: n-heksan, n-heptan, eter metylowo tertbutylowy (MTBE), czterowodorofuran (THF), acetonitryl (ew.), wszystkie o czystości do HPLC ( HPLC grade ), albo do elucji gradientowej ( gradient grade ); Próbki i rozpuszczalniki próbek: odwodniony ekstrakt z trawy lub z liści do acetonu, przeprowadzony do rozpuszczalnika o składzie eluentu, albo roztwór oleju napędowego lub nafty w n-heptanie, lub w n- heksane o stęŝeniu 0,05g/ml; roztwór polimerów polistyrenowych w THF o stęŝeniach ok. 0.1 g/ml. Aparatura i wyposaŝenie: A) Modułowy chromatograf cieczowy MERCK HITACHI serii LaChrom (pompa HPLC, dozownik Rheodyne, kolumna 250x4mm typu CN 100 7 um, termostat kolumny, detektor UV-VIS/DAD, detektor RI, interface, komputer, oprogramowanie HSM ; B) Chromatograf cieczowy z pompą strzykawkową, dozownik Rheodyne, detektor RI, rejestrator Y-t ; C) Bezpompowy zbiornikowy moduł zasilania kolumny pod wpływem spręŝonego azotu poprzez reduktor ciśnienia, z dozownikiem membranowym, kolumną szklaną HPLC, detektorem UV-254 i rejestratorem Y-t ; D) Chromatograf cieczowy serii Elite MERCK HITACHI, sterowany komputerem oraz oprogramowanie rejestracji i przetwarzania danych najnowszej generacji. Przydatne w praktyce zaleŝności obliczeniowe 1. Rozdzielczość (R S ) - uzaleŝnia stopień rozdzielenia substancji od sprawności i selektywności układu chromatograficznego i jest wyraŝona następującym równaniem: N α 1 k2 R S = 4 α 1+ k 2. Obliczanie sprawności i innych parametrów na podstawie chromatogramu testowego: LC S1/ 2 2 H = ( ) 5,54 l N = L H C = 5,54( As = 0,1 u = t 0 l S b a L C 1/ 2 2 ) 2 Obliczanie sprawności osiągalnej teoretycznie w chromatografii cieczowej niezaleŝnie od skali rozdzielania równanie Knoxa B 0,33 h teor = + Aν + Cν, gdzie ν H ud p h = ; ν = (dla dobrze wypełnionych i bardzo sprawnych kolumn: A=1, B=2, C=0,1) d p DM

Rys. Schemat, przedstawiający chromatogram testowy i sposób wyznaczania parametrów do obliczenia parametrów sprawności kolumny Znaczenie symboli: a, b część szerokości piku w 0,1 wysokości (patrz rys.) α - współczynnik selektywności As 0,1 współczynnik asymetrii piku w 0,1 wysokości A, B, C stałe dla konkretnej kolumny D M współczynnik dyfuzji molekularnej substancji rozdzielanej w eluencie d p średnica ziaren wypełnienia kolumny; wielkość ziaren wypełnienia kolumny h- tzw. zredukowana wysokość półki teoretycznej H wysokość wypełnienia równowaŝna półce teoretycznej h teor wartość h otrzymana z równania Knoxa k 2 współczynnik retencji substancji później eluowanej l odległość mierzona na chromatogramie ( w warunkach elucji izokratycznej i stałego natęŝenia przepływu eluentu) L C długość wypełnienia kolumny N- liczba półek teoretycznych R S stopień rozdzielenia S 1/2 szerokość piku w ½ wysokości t 0 czas martwy kolumny u - liniowa prędkość przepływu eluentu w kolumnie ν - tzw. zredukowana prędkość przepływu eluentu Uwagi i zalecenia Sugeruję, aby Uczestnicy ćwiczenia wykorzystali czas trwania ćwiczenia takŝe dla przedyskutowania z prowadzącymi i z innymi uczestnikami, problemów, z jakimi spotkali się w swojej praktyce stosowania HPLC. Literatura 1. Chromatografia cieczowa praca zbiorowa pod redakcją M. Kamińskiego, CEEAM, Gdańsk 2004 2. Z. Witkiewicz Podstawy chromatografii, WNT, Warszawa 1995 Notatki własne

ĆWICZENIE 4. ROZDZIELANIA, IDENTYFIKACJA I OZNACZANIE ILOŚCIOWE ŚLADOWYCH ILOŚCI ZWIĄZKÓW POCHODZENIA FARMACEUTYCZNEGO W PRÓBKACH. dr inŝ. A. Kot-Wasik Pani Agata Kot-Wasik jest pracownikiem Katedry Chemii Analitycznej Wydziału Chemicznego Politechniki Gdańskiej; agata@chem.pg.gda.pl Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest przygotowanie krzywej kalibracyjnej metodą wzorca zewnętrznego i wewnetrzengo do oznaczenia zawartości fluoksetyny w próbce. Charakterystyka fluoksetyny Produkcja, leków, choć tak poŝyteczna dla ludzi i zwierząt, moŝe stać się teŝ dla nich zagroŝeniem. Stosowanie ogromnej ilości antybiotyków, hormonów, środków przeciwbólowych czy uspokajających, stanowi powaŝny problem w dzisiejszym świecie. Stąd środki farmaceutyczne podawane ludziom są w dalszej kolejności obecne w mierzalnych stęŝeniach w wodach powierzchniowych, podziemnych jak równieŝ wodzie pitnej. Korzystanie z wody zanieczyszczonej przez pozostałości farmaceutyków, spoŝywanie produktów pochodzenia zwierzęcego zawierających pozostałości śladowe ilości leków, a takŝe ich metabolitów, zaburza równowagę w organizmie, oraz potęguje problem tak juŝ niebezpiecznego zjawiska lekooporności. Do leków antydepresyjnych najnowszej generacji zaliczane są selektywne inhibitory wychwytu zwrotnego serotoniny. Do leków tych naleŝy m.in. fluoksetyna, którą w 1988 roku wprowadziła na rynek firma Eli Lilly pod nazwą handlową Prozac. Jedna kapsułka np.: Prozac, poza wieloma innymi składnikami, zawiera 20 mg fluoksetyny.

Oznaczenie chromatograficzne. Techniki chromatograficzne są typowym przykładem technik opartych na pomiarze względnym czyli inaczej mówiąc na porównaniu sygnału detektora uzyskanego dla: próbki wzorcowej, w której znane jest stęŝenie analitu; próbki badanej. W związku z tym konieczne jest przygotowanie krzywych kalibracyjnych dla wszystkich analizowanych związków. Krzywe takie wyznacza się w oparciu o analizę próbek wzorcowych. Analiza jakościowa: Na podstawie zgodności czasów retencji analitów obecnych w próbce badanej i we wzorcu Na podstawie widma UV lub/i MS Na podstawie zgodności stosunku sygnału dla dwóch róŝnych długości fal

A1 A2 A 1 /A 2 = constans dla danego analitu Analiza ilościowa Pole pow ierzchni piku [A] 700 600 500 400 300 200 100 0 metoda wzorca zewnętrznego y = 129,47x - 3,6134 R 2 = 0,9998 0 1 2 3 4 5 6 StęŜenie [C] W tym celu naleŝy przygotować szereg rozcieńczeń analitu, nastrzyknąć do układu chromatograficznego i wyznaczyć zaleŝność powierzchni piku od stęŝenia. A następnie dokonać analizy chromatograficznej i znaleźć wartość powierzchni piku dla badanego analitu, po czym obliczyć stęŝenie (z krzywej kalibracyjnej y = ax + b lub z proporcji A/C = A x /C x gdzie, C x = C*A x / A ) Chromatogramy wzorcowych roztworów substancji o stęŝeniach róznych stęŝeniach. metoda dodatku wzorca metoda wzorca wewnętrznego Jest to metoda polegająca na dodaniu do próbki znanej ilości składnika, tzw. wzorca wewnętrznego (IST), który jest jednak inny od substancji oznaczanych i nie moŝe być obecny w analizowanych próbkach przed jego dodaniem. W celu uzyskania krzywej kalibracyjnej do kilku roztworów wzorcowych o róŝnych stęŝeniach substancji oznaczanej dodaje się najczęściej stałą i znaną ilość wzorca wewnętrznego. Na podstawie uzyskanych chromatogramów roztworów wzorcowych wykreśla się zaleŝność stęŝenia analitu w funkcji stosunku powierzchni piku analitu i wzorca wewnętrznego metoda normalizacji

Warunki analizy chromatograficznej umozliwiającej oznaczenie zawartości fluksetyny Elementy układu pomiarowego Rodzaj elementu i parametry pracy Chromatograf cieczowy HPLC-UV-DAD, Agilent seria 1100 Faza ruchoma Składniki fazy ruchomej Skład Prędkość przepływu A: MeOH (0,1% TFAA) oraz B: H 2 O (0,1% TFAA) 40% MeOH : 60% H 2 O 0.5 ml/min Kolumna Discovery RP Amide 15cm x 3mm, 5µm Detektor UV 226nm Wielkość nastrzyku 20µl Czas trwania analizy 20 min Przebieg ćwiczenia: Przygotować roztwór wzorcowy fluoksetyny i maprotyliny o stęŝeniu 100mg/mL i nastrzyknąć. W kolbce miarowej o objętości 50 ml umieścić 5 mg wzorca fluoksetyny [FLU] i maprotyliny [MAP]. PoniewaŜ oba związki dobrze rozpuszczają się w metanolu, dopełnić kolbkę do kreski tymŝe rozpuszczalnikiem, a tym samym otrzyma się wzorzec o stęŝeniu 100µg/ml. Po uzyskaniu chromatogramu zidentyfikować związki (na podtsawie czasu retencji i widm UV).

220 240 260 280 300 320 340 360 380 A 220 240 260 280 300 320 340 360 380 B mau DAD1, 9.541 (0.6 mau,bln) of CHECKV15.D DAD1, 12. 074 (1.0 mau, - ) of CHECKV15.D DAD1, 10. 474 (291 mau, - ) of CHECKV15.D Długość fali [nm] mau Długość fali [nm] DAD1, 6.034 (1.5 mau, - ) of CHECKV15.D DAD1, 7.981 (4.1 mau, - ) of CHECKV15.D DAD1, 6.714 (686 mau, - ) of CHECKV15.D 250 600 200 500 400 150 300 100 200 50 100 0 0 Chromatogram HPLC-DAD-MS uzyskany w trakcie analizy roztworu wzorcowego fluoksetyny (maprotylina jest tutaj wzorcem wewnętrznym) wraz z widmami UV i MS.

Sporządzenie wewnętrzny; rozcieńczeń roztworu wzorcowego fluoksetyny i maprotyliny (wzorzec Metodą serii rozcieńczeń w kolbkach o pojemności 10 ml wyposaŝonych w nakrętki z tworzywa sztucznego przygotować roztwory wzorcowe o stęŝeniach: 30, 20, 10, 5, 2, 0.7, 0.3, 0.2, 0.02, 0.001 µg/ml. Z tak przygotowanych próbek do chromatografu cieczowego wprowadzić po 20µl kaŝdego roztworu. Nastrzyknąć ( 3 razy) roztwór wzorcowy o najwyŝszym stęŝeniu; Nastrzyknąć (3 razy) roztwór o niŝszym stęŝeniu; Potraktować tą analizę jako analizę próbki i policzyć stęŝenie na podstawie jednego punktu (z analizy pierwszej); zastanowić się nad źródłami błędu; Na podstawie analizy nr 1 oraz analizy nr 2 narysować krzywą kalibracyjną; określic jej parametry; Nastrzyknąć mieszaninę o trzecim stęŝeniu (3 razy) traktując ją jako analizę próbki i policzyć stęŝenie na podstawie dotąd otrzymanych wyników; zastanowić się nad źródłami błędów; Uzupełnić krzywą kalibracyjną o kolejny punkt; Powtórzyć schemat postępowania aŝ do uzyskania 5-7 punktowej krzywej kalibracyjnej; Krzywa wzorcowa dla fluoksetyny otrzymana na podstawie analiz z wykorzystaniem detektora DAD Wyznaczyć stęŝenie fluoksetyny w roztworze o nieznanym stęŝeniu.

Notatki własne

Wszelkie prawa zastrzeŝone. Nieautoryzowane rozpowszechnianie całości lub fragmentów niniejszych materiałów jest zabronione. Utwór nie moŝe być powielany ani rozpowszechniany za pomocą urządzeń elektronicznych, mechanicznych, kopiujących, nagrywających i innych bez pisemnej zgody posiadacza praw autorskich. Wykonywanie kopii jakąkolwiek metodą powoduje naruszenie praw autorskich do niniejszej publikacji.