Zasady wykonania walidacji metody analitycznej

Transkrypt

1 Zasady wykonania walidacji metody analitycznej Walidacja metod badań zasady postępowania w LOTOS Lab 1. Metody badań stosowane w LOTOS Lab należą do następujących grup: 1.1. Metody zgodne z uznanymi normami krajowymi, albo międzynarodowymi, wykonywane w zakresie zastosowań i zgodnie z procedurą podaną w normie; 1.2. Metody opracowane przez uznanych producentów aparatury badawczej, albo opisane w renomowanych czasopismach naukowych, albo opracowane przez uznane instytuty branżowe, lub przez uczelnie wyższe i poddane walidacji przez opracowującego oraz stosowane w LOTOS Lab w zakresie objętym udokumentowanymi danymi z walidacji; 1.3. Metody generalnie zgodne z uznanymi normami krajowymi, albo międzynarodowymi lecz zmodyfikowane w LOTOS Lab i wykonywane w sposób skorygowany, albo w zmienionym zakresie zastosowania; 1.4. Metody opracowane, albo zaadoptowane przez LOTOS Lab i wykonywane zgodnie z procedurą opracowaną w Laboratorium. 2. Dla metod z grupy 1.1. i 1.2. może zostać wykonana uproszczona walidacja, natomiast zastosowanie do badań metod należących do grupy 1.3. i 1.4. wymaga wykonania, uprzednio, pełnej walidacji. Zgodnie, jednak, z wymaganiami p normy PN-EN ISO/IEC 17025:2001, "walidacja powinna być na tyle obszerna, na ile jest to konieczne przy danym zastosowaniu, albo obszarze zastosowania" metody badań Walidacja metod badań stosowanych w LOTOS Lab obejmuje, co najmniej, następujące etapy postępowania (p ) oraz wymaga zbadania następujących parametrów (p w przypadku walidacji uproszczonej i p oraz w przypadku walidacja pełnej) Etapy postępowania walidacyjnego: Określenie zakresu stosowania metody badań, tzn. określenie zakresu zmienności parametrów badanych próbek oraz zakresu zmienności tzw. "matrycy" badanych próbek; Opracowanie programu badań walidacyjnych z podaniem odpowiednich wartości kryterialnych, wymaganych dla walidowanej metody badań; Zatwierdzenie programu walidacji przez Dyrektora LOTOS Lab; Wykonanie badań walidacyjnych zgodnie z zatwierdzonym programem walidacji; Opracowanie wyników badań walidacyjnych i przygotowanie pisemnego raportu walidacji, uwzględniającego przede wszystkim stwierdzenia dotyczące spełnienia wymagań, określonych w programie walidacji; Zatwierdzenie raportu walidacji przez Dyrektora LOTOS Lab, równoznaczne z wprowadzeniem metody do bieżącego stosowania w Laboratorium Parametry i właściwości metody badań, które powinny zostać zbadane podczas walidacji uproszczonej: Laboratoryjna precyzja metody badań (odchylenie standardowe pojedynczego wyniku, odchylenie standardowe wartości średniej, przedział ufności wartości średniej dla poziomu ufności 0.95), określona dla zakresu stosowania metody badań w laboratorium, Strona 1 z 6

2 tzn. dla przeciętnych, najniższych i najwyższych wartości mierzonego parametru / właściwości badanych próbek; Laboratoryjna powtarzalność metody badań, wyznaczona na poziomie ufności 0.95, z zastosowaniem rezultatów otrzymanych przy wyznaczaniu laboratoryjnej precyzji, z uwzględnieniem założenia, że z reguły będą wykonywane dwa kolejne oznaczenia badanego parametru i obliczona zgodnie z zasadą opisaną w "Zapewnienie jakości analiz chemicznych", IMP 1998, pod red. M. Dobeckiego. Obliczenie laboratoryjnej powtarzalności może też zostać wykonane z zastosowaniem wszystkich kombinacji hipotetycznych rozstępów między poszczególnymi wynikami otrzymanymi w serii oznaczeń, po odrzuceniu - z zastosowaniem testu Q - Dixona - wyników obarczonych błędem grubym. Laboratoryjna niepewność wyników badań, określona / oszacowana ilościowo poprzez wykorzystanie, co najmniej, jednej z poniżej wymienionych grup parametrów i metod postępowania: - Odchylenia standardowe i przedziały ufności pojedynczego wyniku, odchylenia standardowe i przedziały ufności wartości średniej oraz laboratoryjne powtarzalności metody; - Przedział ufności pojedynczego wyniku oraz przedział ufności wartości średniej, określone na podstawie rezultatów badań ; - Standardowa niepewność złożona certyfikowanego materiału odniesienia (CRM), albo materiału odniesienia Urzędu Miar, zbadana doświadczalnie z zastosowaniem walidowanej metody analitycznej; - Obliczenie (oszacowanie) "standardowej i rozszerzonej niepewności złożonej", według zasady "addytywności propagacji wariancji zdarzeń niezależnych" Podczas walidacji pełnej powinny zostać zbadane i wyznaczone, dodatkowo, następujące parametry / właściwości metody badań dla zakresu przewidywanego stosowania metody w LOTOS Lab: - granica detekcji i granica oznaczalności, - zakres liniowości oraz parametry odpowiedniej linii / funkcji korelacyjnej, - selektywność i specyficzność, - wpływ zamierzonych i niezamierzonych zmian warunków pobierania próbek, zmian składu "matrycy' próbek oraz zmian warunków wykonywania badań na otrzymywane wyniki, ich precyzję, powtarzalność oraz na niepewność pomiarową, - korelacja wyników badań otrzymanych metodą walidowaną i ogólnie uznaną metodą / metodami odniesienia 3. Inne zasady postępowania oraz dodatkowe zalecenia 3.1. Każda walidacja powinna zostać poprzedzona analizą czynników wpływających na błąd pomiaru oraz dokonaniem na tej podstawie - w praktyce analitycznej w LOTOS Lab w takim zakresie, na ile to możliwe - minimalizacji czynników wpływających na wartość błędu wyników badania Sposoby wyznaczenia / szacowania niepewności pomiaru, podane w p mogą być traktowane na razie jako równoważne, jednak, należy w możliwie jak najkrótszym okresie czasu wyznaczyć dla poszczególnych metod badań niepewność złożoną, określoną wg zasady Strona 2 z 6

3 "propagacji wariancji zdarzeń niezależnych", z wyjątkiem tych metod badań, gdy można udokumentować z wysokim poziomem ufności, że inny spośród w/w sposobów określenia / oszacowania niepewności pomiaru jest dla tej metody bardziej właściwy W przypadku nie zautomatyzowanych metod badań, gdy stopień wyszkolenia pracownika i stopień staranności wykonania przez niego czynności laboratoryjnych ma wpływ na otrzymane wyniki, należy w ustalonym okresie czasu wyznaczyć laboratoryjną powtarzalność, z uwzględnieniem wykonywania pomiarów przez różnych pracowników Laboratorium Ważnymi danymi walidacji są wyniki badań tych samych próbek, wykonane różnymi metodami analitycznymi, szczególnie, gdy dotyczy to metod badań zakwalifikowanych do grupy 1.3. i 1.4. i istnieje uznana normowa metoda oznaczania odpowiedniego parametru Za wykonanie dla poszczególnych metod badań: "programu walidacji z określeniem wymaganych kryteriów", "analizy czynników wpływających na niepewność wyników badań", "minimalizacji czynników najważniejszych", "wykonanie badań walidacyjnych" oraz za "opracowanie wyników badań walidacyjnych, wraz z określeniem zgodności z przyjętymi kryteriami" odpowiada pracownik opiekujący się odpowiednią metodą badań (dawniej, "pracownik wiodący" w zakresie określonej metody badań). Ponieważ, jednak, wykonanie znacznej części walidacji metody badań jest skomplikowane, kierownicy odpowiednich Laboratoriów oraz Pracowni, a także Specjaliści zatrudnieni w LOTOS Lab są zobowiązani do udzielenia na bieżąco potrzebnej pomocy. Praca tego typu powinna być, jednocześnie, traktowana jako realizacja podstawowych obowiązków pracownika LOTOS Lab. Opracował: Zatwierdził: Zasady przygotowania programu walidacji metody badawczej Przykład instrukcji wykonania walidacji metody analitycznej znajduje się w Instrukcja walidacji metody analitycznej 1. Zakres zastosowań metody w laboratorium LOTOS Lab Metoda badawcza... (np. "Oznaczanie zawartości azotu całkowitego" w zakresie od..., do... mg/l ) ma w LOTOS Lab następujący zakres zastosowania: do oznaczania zawartości... w zakresie stężeń od..., do..., w rafineryjnych wodach i ściekach procesowych, w kontroli procesu oczyszczania ścieków rafineryjnych oraz w wodach powierzchniowych. Orientacyjny zakres zmienności składu matrycy badanych próbek, dla którego metoda jest właściwa, został podany w p Zasada metody oznaczania Próbka badanej wody, po ewentualnym przygotowaniu na drodze usunięcia substancji przeszkadzających, zostaje dodana do naczynia zawierającego potrzebne reagenty i po ustalonym okresie czasu potrzebnym dla zakończenie chemicznych reakcji analitycznych, zostaje zmierzona absorbancja przy długości fali światła... nm, z zastosowaniem fotometru Strona 3 z 6

4 ... Wartość absorbancji zostaje przeliczona na stężenie azotu całkowitego z zastosowaniem współczynnika kalibracyjnego zawartego w pamięci fotometru, albo wprowadzonego do pamięci przez użytkownika fotometru. Reakcja chemiczna, powodująca sygnał analityczny, polega na Powszechnie stosowana metoda / y odniesienia oraz najważniejsze wzajemne odniesienia między tymi metodami Za metodę odniesienia należy uznać metodę PN-ISO... Niniejsza, metoda badań, będąca przedmiotem walidacji powinna dawać rezultaty zgodne z wynikami, otrzymywanymi metodą.... W przypadku niektórych badanych próbek metoda walidowana powinna prowadzić do otrzymywania rezultatów bardziej poprawnych, ponieważ,.... Jednocześnie walidowana metoda powinna być bardziej precyzyjna i bardziej odporna na czynniki zakłócające od metody odniesienia. Albo temu podobne informacje dotyczące charakterystyki walidowanej metody badań i metody odniesienia. 4. Cel ogólny i cele szczegółowe walidacji Wykazać, na podstawie badań i poprzez zdobycie obiektywnych dowodów, że walidowana metoda badań jest właściwa w zastosowaniach podanych w p.1. W związku z tym dla zakresu zastosowań tej metody w LOTOS Lab postanowiono zbadać, wyznaczyć lub oszacować i ocenić jej: - Dokładność; - Precyzję; - Liniowość; - Dolną i górną granicą zakresu roboczego, albo zakresu liniowości; - Korelację rezultatów otrzymanych metodą walidowaną i metodą odniesienia (jeżeli taka istnieje i jest uznawana za poprawną); - Odporność na zmianę określonych parametrów i warunków wykonania badań (jeżeli mogą mieć wpływ na otrzymane wyniki i na niepewność pomiarową, albo uzasadnienie, że wykonywanie takich badań nie jest potrzebne) - Niepewność pomiarową. Za kryterium weryfikacji ocen statystycznych przyjmuje się poziom ufności 0.95, albo poziom istotności hipotez statystycznych Do weryfikacji hipotez statystycznych przyjmuje się, z zasady tylko wyniki pomiarów nie obarczone błędem grubym (po weryfikacji surowych danych pomiarowych i po odrzuceniu wszystkich wyników nadmiernie odbiegających z zastosowaniem testu Q Dixona, albo innej odpowiedniej metody weryfikacji przynależności danych pomiarowych do określonej statystyki). W miarę możliwości, badania zostaną wykonane dla niskich, przeciętnych i wysokich zawartości analitu oraz dla ubogich, typowych i bogatych zawartości substancji w tzw. matrycy badanych próbek. Należy umotywować przyjęty do badań zakres zmienności składu matrycy próbek Badania powinny obejmować, co najmniej, 10 niezależnie przygotowanych próbek, korzystnie, przez kilku pracowników uprawnionych do badań. Strona 4 z 6

5 5. Program walidacji Program walidacji metody badawczej p.t. "... ", wymagane wartości parametrów walidacyjnych oraz kryteria akceptacyjne metody badań p.t. L.p. Element celu badań 1 Precyzja 2 Dokładność Badane parametry / właściwości metody badań / metody analitycznej Odchylenie standardowe oraz przedział ufności dla wyniku pojedynczego oznaczenia Odchylenie standardowe oraz przedział ufności wartości średniej Górna granica powtarzalności metody badania, wyznaczona w oparciu o rozstępy między wynikami pomiarów wykonanych przez tę samą osobę, dla tej samej próbki laboratoryjnej (lecz dla różnych próbek analitycznych), uzyskana w krótkim okresie czasu Górna granica odtwarzalności metody oznaczania Błąd bezwzględny i względny wartości średniej wyznaczony w laboratorium, odniesiony do wartości średniej materiału odniesienia o znanej wartości badanego parametru, wyznaczony doświadczalnie na podstawie wyników pomiarów wykonanych z zastosowaniem sprzętu pomiarowego posiadającego aktualne odniesienie do "oficjalnych" jednostek miar, ze znaną niepewnością Błąd bezwzględny i względny wartości średniej laboratorium odniesiony do wartości średniej z badań Błąd bezwzględny i względny wartości stopnia odzysku przy zastosowaniu metody dodatku wzorca 3 Liniowość Liniowość zakresu roboczego metody określona dla materiału odniesienia, albo / i na podstawie korelacji do rezultatów dla liniowej metody odniesienia: charakter korelacji oraz wartości współczynnika kierunkowego, wyrazu wolnego i współczynnika korelacji linii regresji 4 Granice roboczego zakresu metody Dolna granica oznaczalności, ewentualnie dolna granica detekcji oraz górna granica liniowości i ewentualnie górna granica oznaczalności Wymagania oraz kryteria akceptacji Wyznaczyć wartości parametrów i gdy istnieją odpowiednie dane - porównać z wartościami typowymi dla metody odniesienia. Wartości nie wyższe od typowych dla metody odniesienia - akceptacja metody badań, wartości wyższe - weryfikacja procedury analitycznej i powtórzenie walidacji. Zawieranie się całego przedziału ufności wartości średniej wyników laboratorium w przedziale standardowego błędu rozszerzonego materiału odniesienia, albo w przedziale ufności wartości średniej wyników badań, albo w przedziale odtwarzalności, a szczególnie powtarzalności, walidowanej metody badań - oznacza brak błędu systematycznego. Częściowe rozbieżności w/w przedziałów wymagają weryfikacji hipotezy o niezgodności wartości średnich oraz wariancji. Należy stwierdzić brak błędu systematycznego, albo wyznaczyć wartości poprawek. Średnia wartość stopnia odzysku w zakresie 0.98 do 1.02 i symetria przedziału ufności wartości średniej stopnia odzysku oznacza brak błędu systematycznego. Inne rezultaty wymagają zbadania wartości błędu systematycznego metody badań i wyznaczenia poprawek Wyższa do wartość współczynnika korelacji (R) oznacza liniowość i określa liniowy zakres roboczy metody badań. Niższe od 0.97 i wyższe od 1.03 wartości wykładnika funkcji S=kc x (log S= x (log c) + log k, wyznaczają granice liniowości, gdzie S sygnał pomiarowy c wartość mierzona Jako dolna granica detekcji - trzykrotna wartość średnia dla ślepej próby, albo trzykrotna wartość poziomu szumów wyznaczonego w jednostkach badanego parametru, a jako dolna granica oznaczalności, odpowiednio, pięcio-krotność Badane próbki i zakres zmienności warunków analitycznych Z wykorzystaniem materiałów odniesienia o typowej i o "skrajnych" właściwościach matrycy Zakres zmienności badań Materiał / y odniesienia o niskich, wysokich i typowych wartościach badanego parametru oraz o typowej, ubogiej i bogatej matrycy W zakresie zmienności próbek z badań i ich parametrów statystycznych Dla niskich, wysokich i typowych wartości dodatku oraz dla typowej, ubogiej i bogatej matrycy Z użyciem materiałów odniesienia o odpowiednim zakresie zmienności badanego parametru, dla ubogiej, typowej i bogatej matrycy Uwagi Określić górną granicę powtarzalności dla wykonywania dwu-, albo jednokrotnego oznaczania próbki analitycznej Wyniki badań Sposoby, stosowane alternatywnie, albo łącznie Wartość współczynnika kierunkowego linii regresji określa czułość metody Strona 5 z 6

6 L.p. 5 Element celu badań Korelacja rezultatów w stosunku do metody odniesienia Badane parametry / właściwości metody badań / metody analitycznej Charakter korelacji, wartości współczynnika kierunkowego i wyrazu wolnego oraz współczynnika korelacji linii regresji, o ile możliwe, w całym zakresie roboczym metody analitycznej Wymagania oraz kryteria akceptacji Wyznaczyć parametry linii regresji oraz ocenić stopień zgodności rezultatów otrzymywanych walidowaną metodą badań oraz metodą odniesienia Badane próbki i zakres zmienności warunków analitycznych Z użyciem materiałów odniesienia o odpowiednim zakresie zmienności badanego parametru, dla ubogiej, typowej i bogatej matrycy Uwagi Zbadać, gdy metoda odniesienia jest ogólnie uznana za poprawną 6 Odporność metody na zamierzone i nie zamierzone zmiany warunków wykonania badania 7 Niepewność pomiarowa metody badań Wpływ zmienności właściwości odczynników, materiałów pomocniczych, gazów, kolumn, stosowanych do badań, osoby wykonującej badania, czasu przechowywania próbki itp. czynników na otrzymane wyniki badań i na niepewność pomiarową Odchylenie standardowe i przedział ufności pojedynczego wyniku oraz odchylenie standardowe i przedział ufności wartości średniej wyznaczone w laboratorium (jak w p. 1.); Przedział ufności pojedynczego wyniku oraz przedział ufności wartości średniej określone w czasie badaniach Standardowa niepewność złożona certyfikowanego materiału odniesienia (CRM), albo materiału odniesienia Urzędu Miar, gdy były badane walidowaną metodą analityczną Obliczona (oszacowana) "standardowa i rozszerzona niepewność złożona", według zasady "addytywnej propagacji wariancji zdarzeń niezależnych". 8 Selektywność Stosunek wartości sygnału analitycznego Sy od badanego parametru do sygnału analitycznego Sx od określonego wybranego składnika matrycy próbki (Sel=Sy/Sx) 9 Specyficzność Wpływ zmian łącznego składu matrycy na wartość sygnału analitycznego Wyznaczyć wartości średnie i rozstępy między średnimi wartościami wyników badań tej samej próbki materiału odniesienia, badanej w różnych warunkach. Wartości średnie wraz z przedziałem ufności wartości średniej powinny być zawarte w zakresie rozszerzonego błędu standardowego wartości średniej materiału odniesienia, a rozstępy między wartościami średnimi - w przedziale górnej granicy powtarzalności metody badań Wyznaczyć odpowiednie wartości statystyczne, albo oszacowania i podać je w raporcie walidacji. Porównać z odpowiednimi wartościami dla metody odniesienia. Otrzymanie dla walidowanej metody badań wartości niższych od wyznaczonych dla metody odniesienia jest dodatkowym argumentem dla poprawności wyboru walidowanej metody badań Wartość Sel > 1000 oznacza metodę selektywną, Sel>10000 metodę wysoce selektywną, a wartość Sel<100 metodę nie selektywną Metoda jest specyficzna, gdy składniki obecne potencjalnie w matrycy badanych próbek nie powodują zmiany sygnału analitycznego powyżej 1% względnego. Gdy wpływ składników matrycy jest wyższy, należy przed wykonaniem analizy zastosować odpowiednie metody przygotowania próbki, w celu usunięcia składników zakłócających Z użyciem materiałów odniesienia o typowej wartości badanego parametru oraz dla typowej matrycy Dla niskich, typowych i wysokich wartości badanego parametru, z uwzględnieniem matrycy ubogiej, typowej i bogatej Stężenie składników, dla których jest badana selektywność metody w typowym dla niej zakresie Dla niskich, typowych i wysokich wartości badanego parametru, z uwzględnieniem matrycy ubogiej, typowej i bogatej oraz metody dodatku do próbki składników matrycy mających potencjalnie wpływ na wartość sygnału analit. Wykonać w zakresie niezbędnym, gdy nie można wykluczyć wpływu zmienności warunków badań na wyniki oznaczania Alternatywne sposoby postępowania, o ile możliwe należy zastosować co najmniej dwa, preferując metodę addytywnej propagacji wariancji Wykonywać tylko dla substancji należących do prawdopodobnych składników matrycy Zbadać tylko wtedy, gdy jest określone prawdopodobieństwo obecności w matrycy próbek składników, dla których metoda badań jest niespecyficzna W przypadku niektórych metod analitycznych, opisanych w normach, farmakopei, albo w literaturze naukowej i poddanych uprzednio walidacji, wykonanie pełnego programy nie jest konieczne i wystarczy walidację ograniczyć do pierwszych pozycji powyższej tabeli. Strona 6 z 6