WYSOKOSPRAWNA CHROMATOGRAFIA CIECZOWA

Transkrypt

1 WYSOKOSPRAWNA CHROMATOGRAFIA CIECZOWA materiały do ćwiczeń seminaryjnolaboratoryjnych Materiały zebrała i przygotowała do druku: dr inŝ. Agata Kot-Wasik, Katedra Chemii Analitycznej, Politechnika Gdańska

2 SPIS TREŚCI Ćwiczenie 1 Przygotowanie chromatografu cieczowego do pracy przygotowanie fazy ruchomej, instalacja kolumny; zasady postępowania dla efektywnego stosowania aparatu. Dr inŝ. A. Kot-Wasik Ćwiczenie 2 Dobór warunków rozdzielania w układzie faz odwróconych. Dr inŝ. B. Makuch, mgr inŝ. J. Wilga Ćwiczenie 3 Rozwiązywanie problemów chromatograficznych problemy związane z dozowaniem próbki, kolumną, detektorem, pompą. Prof. dr hab. inŝ. M. Kamiński, mgr inŝ. E. Gilgenast, mgr inŝ. G. Romanik Ćwiczenie 4 Analiza ilościowa związków w próbkach. Dr inŝ. A. Kot-Wasik

3 ĆWICZENIE 1 PRZYGOTOWANIE CHROMATOGRAFU CIECZOWEGO DO PRACY PRZYGOTOWANIE FAZY RUCHOMEJ, INSTALACJA KOLUMNY; ZASADY POSTĘPOWANIA DLA EFEKTYWNEGO STOSOWANIA APARATU. Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest przygotowanie chromatografu cieczowego do pracy. Przygotowanie aparatu obejmuje przygotowanie fazy ruchomej, instalację kolumny chromatograficznej, przygotowanie detektora i stabilizaja warunków chromatograficznych. Schemat blokowy chromatografu cieczowego, którego elementy poddawane będą omówieniu i przygotowaniu do pracy analitycznej przedstawiono na Rysunku. Nastrzyk Pompa Kolumna Detektor Faza ruchoma Termostat Rejestrator Schemat blokowy chromatografu cieczowego W celu przygotowania aparatu do pracy naleŝy: 1. przygotować fazę ruchomą, 2. zainstalować kolumnę chromatograficzną, 3. przygotować detektor, 4. przygotować wzorzec i próbkę do analizy, 5. ustabilizować warunki chromatograficzne, 6. zdiagnozować ewentualne problemy chromatograficzne. ad.1 Fazą ruchomą w chromatografii cieczowej są pojedyncze rozpuszczalniki lub ich dwu- lub więcej składnikowe mieszaniny. Faza ruchoma, która zostaje wprowadzona do kolumny to eluent, który bezwzględnie musi być pozbawiony rozpuszczonego w cieczy powietrza (zaprezentowane zostaną róŝne sposoby usuwania powietrza z fazy ruchomej: odgazowanie próŝniowe, helem lub za pomocą ultradzwięków). Rodzaj i stosunek ilościowy mieszaniny rozpuszczalników w fazie ruchomej ma bardzo duŝy wpływ na proces chromatografowania. Omówione zostaną sposoby przygotowania faz ruchomych składających się z dwóch (lub więcej) składników, zawierające dodatki (kwasy nieorganiczne, organiczne i bufory). Przedstawiony zostanie sposób wymiany eluentu. Przez cały czas trwania wymiany eluentu kolumna powinna być odłączona i zastąpiona łącznikiem (dwójnikiem). Kolejna kolumna potrzebna do wykonania oznaczeń, powinna zostać przyłączona w miejsce dwójnika dopiero po upewnieniu się, Ŝe cały aparat został poprawnie przepłukany i zawiera eluent, który aktualnie będzie wykorzystywany do analizy. Zawór dozujący w pozycji powinien być w pozycji inject.

4 ść JeŜeli, eluent poprzedni i następny wzajemnie się nie mieszają, a szczególnie gdy stosowane są roztwory buforowe, lub eluenty zawierające substancje będące w stanie czystym fazą stałą, naleŝy upewnić się, Ŝe kolejna ciecz pompowana przez aparat nie spowoduje wytrącenia się stałego osadu wewnątrz chromatografu, ani powstania emulsji. W takich przypadkach naleŝy zastosować ciecz pośrednią, o której wiadomo, Ŝe jest dobrym rozpuszczalnikiem składników poprzedniego i następnego eluentu, np. wodę destylowaną, gdy ma być stosowany bufor zawierający sole nieorganiczne, albo tetrahydrofuran, aceton lub dioksan, gdy poprzedni i następny eluent są cieczami bez dodatku substancji stałych, ale wzajemnie się nie mieszają. Pomocne moŝe być wprowadzenie strzykawką poprzedniego eluentu do następnego zawartego w probówce w celu sprawdzenia czy nie powstaje osad lub emulsja; Zawsze naleŝy kaŝdą ze stosowanych cieczy pośrednich przepłukać takŝe kanał odniesienia detektora, gdy detektor taki kanał posiada (np. w przypadku detektora refraktometrycznego); Podstawowy problem związany z fazą ruchomą w HPLC: ciśnienie wskazywane przez wyświetlacz na płycie czołowej pompy waha się więcej niŝ +/- 2 bary, a jednocześnie widać okresowe zasysanie małych banieczek z przewodu ssawnego do pompy. Przyczyna: zapowietrzony eluent, albo eluent o zbyt wysokiej pręŝności par, albo/i zatkany zanieczyszczeniami filtr ssawny pompy. (Uwaga! Eluent przed uŝyciem musi być przefiltrowany przez filtr 0,45 um, jeŝeli nie ma pewności, Ŝe wykonał to producent, a takŝe nie wolno dopuścić do powstania Ŝycia biologicznego w eluencie nietoksycznym dla bakterii i grzybów - stosować 0.5 mm azydek sodu). NaleŜy przedmuchać filtr ssawny pompy spręŝonym powietrzem w kierunku odwrotnym do kierunku przepływu cieczy, dodatkowo odpowietrzyć eluent i postawić go powyŝej poziomu głowicy pompy. ad.2 Sposób połączenia kolumny z dozownikiem i detektorem powinien być taki, Ŝeby zminimalizować powstające ewentualne objętości martwe. W ten sposób zmniejsza się udział objętości martwych stosunek rozmyciu pików chromatograficznych. Przez cały czas trwania wymiany eluentu kolumna powinna być odłączona i zastąpiona łącznikiem (dwójnikiem). Kolejna kolumna potrzebna do wykonania oznaczeń, powinna zostać przyłączona w miejsce dwójnika dopiero po upewnieniu się, Ŝe cały aparat został poprawnie przepłukany i zawiera eluent, który aktualnie będzie wykorzystywany do analizy. Zawór dozujący w pozycji powinien być w pozycji inject. JeŜeli klumna chromatograficzna podłączana jest do układu po raz pierwszy lub teŝ nie była uŝywana przez dłuŝszy okres czasu naleŝy - po podłączniu jej do układu chromatograficznego zastosować wzrastający przepływ fazy ruchomej (od najmniejszego do właściwego). Gwałtowne włączenie pompy pompującej fazę ruchomą z duŝym przepływem moŝe zruszyć złoŝe upakowane w kolumnie chromatgraficznej. Przy rozpoczynaniu analizy chromatograficznej jedną z bardzo waŝnych rzeczy jest ustalenie równowagi kolumny chromatograficznej. Jak długo naleŝy kolumnę stabilizować zaleŝy od jej stanu, stęŝenia składników fazy ruchomej oraz ich wskaźnika retencji. Ustalenie stanu równowagi jest uwarunkowane przez prędkość, z którą składniki fazy ruchomej są transportowane do kolumny lub mogą z niej być usunięte. JeŜeli stęŝenie dodatków organicznych w fazie ruchomej jest niskie, ustalenie równowagi zajmie sporo czasu, np.: jeŝeli kolumna wcześniej nie miała kontaktu z metanolem, a jego stęŝenie w fazie ruchomej wynosi 1%, to potrzeba przepuścić przez kolumnę co najmniej 10-krotną jej objętość w celu dostarczenia odpowiedniej ilości metanolu. Na Rysunku poniŝej przedstawiono nieustabilizowaną linię bazową świadczącą o zbyt krótkim czasie stabilizacji kolumny. [j.u.] Intensywno Czas [min] Nieustabilizowana linia podstawowa ze względu na zbyt krótki czas stabilizowania kolumny.

5 ad.3 Detektor naleŝy włączyć na minut przed rozpoczęciem analiz (wyjątek stanowi detektor refraktometryczny, którego stabilizacja moŝe zająć 24 godziny). Przed rozpoczęciem analiz chromatograficznych detektor naleŝy wyzerować. JeŜeli detektor UV, UV-VIS-DAD lub fluorescencyjny nie daje się wyzerować w całym, albo w części zakresu pomiarowego, zaś balans detektora RI nie daje się sprowadzić do jednej diody świecącej to naleŝy podejrzewać, Ŝe uzyty został eluent o niedostatecznej czystości, albo - co gorzej - na powierzchni wewnętrznej naczyńka przepływowego w detektorze wydzieliła się emulsja, albo depozyt substancji stałej. Jeśli tak to naleŝy wymieć eluent na inny - o wyŝszej czystości, a jeŝeli to nie pomaga, przepłukać naczyńko przepływowe odpowiedniego detektora kolejno: dichlorometanem, acetonem, wodą, acetonem, toluenem i powrócić do stosowanego eluentu. W razie potrzeby zastosować ciecz pośrednią. JeŜeli to nie pomaga zastosować dodatkowo płukanie 5% - owym kwasem azotowym. ad. 4 W chromatografie cieczowym próbka wprowadzana zostaje (pod ciśnieniem atmosferycznym) do kolumny poprzez dozownik. W kolumnie panuje ciśnienie do kilkudziesięciu MPa. Dozowniki są skonstruowane tak, aby nie było w nich przestrzeni martwych, nie przemywanych fazą ruchomą. Zły dozownik lub złe dozowanie mogą być przyczyną pojawienia się źle rozdzielonych, szerokich i niesymetrycznych pików. Najczęściej w HPLC stosuje się objętości nastrzykiwanych próbek w zakresie od 1(5) do 150 µl. Jako optymalną objętość próbki do nastrzyku ustalić moŝna na 5-25µl (najmniej efektów uboocznych związanych z niewłaściwym przygotowanie próbki). Bardzo waŝną kwestią dotyczącą nastrzyku jest skład jakościowy roztworu, w którym nastrzykiwane są anality. Dlaczego? OtóŜ, przy przepływie 0,5 ml/min przeliczając przepływ na µl/s otrzymujemy 8,3µl/s nastrzyk o wielkości 5µl przy załoŝeniu, Ŝe moment nastrzyku trwa sekundę powoduje, Ŝe do układu chromatograficznego wprowadzamy niemalŝe jeszcze raz taką objętość cieczy, jaka w danej chwili przepływa przez kapilary. Spowodować to moŝe znaczne zaburzenie składu ilościowego fazy, a to jak wiadomo ma bardzo duŝy wpływ na parametry retencji analitów. Stąd teŝ roztwór do nastrzyku powinien przygotowywany w fazie ruchomej aby jak największym stopniu zapobiec niepoŝądanym zmianom wcześniej ustalonych parametrów. Istnieje moŝliwość tzw. przeładowania kolumny. W zaleŝności o tego, czy za duŝe okazało się stęŝenie wprowadzanej próbki czy jej objętość, mówi się o przeładowaniu objętościowym lub stęŝeniowym. W trakcie zajęć omówione zostaną takie problemy, jak obecność pików frontujących i ogonujących (patrz rysunki poniŝej). Czas retencji [min] Czas retencji [min]

6 Notatki własne

7 ĆWICZENIE 2 DOBÓR WARUNKÓW ROZDZIELANIA W UKŁADZIE FAZ ODWRÓCONYCH Dr inŝ. B. Makuch, mgr inŝ. J. Wilga Pani Bogumiła Makuch jest pracownikiem Katedry Chemii Analitycznej Wydziału Chemicznego Politechniki Gdańskiej; Pani Joanna Wilga jest doktorantką na Studium Doktoranckim przy Wydziale Chemicznym Politechniki Gdańskiej; jawil@wp.pl Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest przeprowadzenie dobór optymalnych warunków rozdzielenia substancji w układzie faz odwróconych, na przykładzie ekstraktu z liści z Ginkgo bilobae. Rysunek 1. Liście Ginkgo bilobae JuŜ przed wiekami odkryto, Ŝe liście Ginkgo bilobae, tej najstarszej na świecie rośliny zawierają związki flawonoidowe i terpenoidowe, które potrafią stymulować procesy pamięciowe mózgu, wpływają pomocniczo w zwalczaniu zaburzeń obwodu krąŝenia krwi, a takŝe w zaburzeniach pracy mózgu spowodowanych zaburzeniami krąŝenia mózgowego, a rozmaite produkty zawierające Ginkgo robią obecnie zawrotną karierę i są stosowane w postaci tabletek lub w roztworze. Ekstrakty roślinne są złoŝonymi, wieloskładnikowymi mieszaninami związków znacznie róŝniących się właściwościami chemicznymi. Dobór warunków rozdzielania moŝe być procesem trudnym i pracochłonnym. Na ogół bywa, Ŝe nie jest moŝliwe rozdzielenie w układzie izokratycznym (stały skład fazy ruchomej) i naleŝy stosować gradient (zmiana skokowa bądź ciągła składu fazy ruchomej). Obecnie najczęściej stosowanymi układami rozdzielania metodą Wysokosprawnej Chromatografii Cieczowej (HPLC) jest tzw. układ faz odwróconych (RP) i moŝna zaryzykować stwierdzenie, Ŝ e90% wszystkich rozdzielań wykonuje się w tych układach z zastosowaniem fazy stacjonarnej typu RP 18 tzn. Ŝel krzemionkowy modyfikowany grupą oktadecylową. W praktyce laboratoryjnej doboru faz rozdzielania dokonuje się przez: a zmianę składu fazy ruchomej - zmiana ilościowego udziału rozpuszczalników, b zmianą ph fazy ruchomej, c- zastosowanie pary jonowej, e zmiana typu fazy ruchomej.

8 W trakcie wykonywania ćwiczenia będą uwzględniane punkty a, b, c, e. Rozpuszczalniki stosowane jako fazy ruchomew układach RP wg ich iły elucyjnej to woda (najsłabszy) < MeOH< ACN < EtOH < THF < iproh < chlorek metylenu (najsilniejszy). W praktyce najczęściej stosuje się 4 ry rozpuszczalniki w róŝnych układach tj. wodę, metanol, acetonitryl i tetrahydrofuran, a parametry retencji mogą być regulowane składem fazy ruchomej. Podstawowa zaleŝność to wzrost zawartości rozpuszczalnika bardziej polarnego w fazie ruchomej obniŝa wartość współczynnika retencji (k). Bywają takie problemy rozdzielcze, które moŝna rozwiązać poprzez zamianę rozpuszczalnika w fazie ruchomej; moŝna np. zamienić metanol na tetrehydrofuran. Przy załoŝeniu stałej siły elucyjnej fazy ruchomej korzysta się z prostej zaleŝności: S T = Σ S i θ i gdzie: S T całkowita siła elucyjna fazy ruchomej, S i siła elucyjna rozpuszczalnika θi udział molowy rozpuszczalnika w fazie ruchomej. Przykład: mamy skład fazy ruchomej MeOH : H 2 O w stosunku objętościowym 7:3. Wówczas całkowitą siłę elucyjną fazy ruchomej liczymy wg powyŝszej zaleŝności otrzymując: S T = S MeOH θ + S H2O θ = 2,6 x 0,7 + 0 x 0.3 = 1,82 Gdy zastąpimy metanol tetrahydrofuranem przy załoŝeniu takiej samej siły elucyjnej fazy ruchomej to obliczenie jest następujące: 1,82 = 4,5 x X + 0 x X ok. 40 czyli nowy skład fazy ruchomej będzie następujący THF : H2O 4: 6 (v/v). Innym sposobem doboru warunków rozdzielania jest zmiana ph fazy ruchomej. W przypadku rozdzielania związków o charakterze słabych kwasów, fazę ruchomą zakwaszamy, zaś w przypadku rozdzielania słabych zasad fazę ruchomą alkalizujemy. Efektem takich zabiegów jest wzrost współczynnika retencji co w konsekwencji prowadzi do rozdzielenia związków, które zbyt szybko opuszczają kolumnę chromatograficzna. Zmiana ph powoduje cofnięcie dysocjacji. W układach RP mogą być stosowane równieŝ inne typy faz stacjonarnych np. RP 8, rzadziej RP 2, jak równieŝ Ŝel modyfikowany grupa cyjanową lub fenylową. W kaŝdym przypadku kolejność elucji jest następująca: pierwsze eluują substancje polarne (hydrofilowe)a w dalszej kolejności substancje niepolarne (hydrofobowe). W przypadku rozdzielania węglowodorów czas elucji jest zaleŝny od długości łańcucha fazy związanej z Ŝelem krzemionkowym.

9 WYKONANIE ĆWICZENIA W trakcie ćwiczenia dobierane będą optymalne warunki rozdzielenia substancji czynnych w ekstrakcie Ginkgo bilobae, w układzie faz odwróconych. Pomiar wykonany zostanie w warunkach izokratycznych,; przy mierzonej długości fali λ = 330 nm. Wykorzystywane kolumny chromatograficzne: - LiChrospher RP-18 - Kolumna cyjanowa Wykorzystywane fazy ruchome: - MeOH : H 2 O (7:3 v/v) - MeOH : H 2 O (9:3 v/v) - MeOH: H 2 O (7:3 v/v) z dodatkiem H 3 PO 4 (1%) - THF:H 2 O (4:6 v/v) - THF:H 2 O (4:6 v/v) z dodatkiem H 3 PO 4 (1%) - MeOH: H 2 O (7:3 v/v) z dodatkiem H 3 PO 4 (0,1%) - THF:H 2 O (4:6 v/v) z dodatkiem H 3 PO 4 (0,1%) Parametry aparatury Detektor UV/DAD L 7450 firmy Merck HITACHI Pętla dozująca 20µl Dozownik Rheodyne 7125 Pompa L 6200 firmy Merck HITACHI

10 Notatki własne

11 ĆWICZENIE 3 ROZWIĄZYWANIE PROBLEMÓW CHROMATOGRAFICZNYCH PROBLEMY ZWIĄZANE Z DOZOWANIEM PRÓBKI, KOLUMNĄ, POMPĄ I DETEKTOREM. Prof. dr hab. inŝ. M. Kamiński, mgr inŝ. E. Gilgenast, mgr inŝ. G. Romanik Pan Marian Kamiński jest pracownikiem Katedry Chemii Analitycznej Wydziału Chemicznego Politechniki Gdańskiej; mknkj@wp.pl Panie Ewelina Gilgenast i GraŜyna Romanik są doktorantkami na Studium Doktoranckim przy Wydziale Chemicznym Politechniki Gdańskiej; Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z najstępującymi zagadnieniami: geneza oraz sposoby rozwiązywania problemów, spotykanych w praktyce i dotyczących kolumny, dozowania, detekcji, elucji gradientowej; zasady postępowania w celu doboru warunków rozdzielania w układach NP-HPLC; metodyka zastosowania chromatografii Ŝelowej (GPC, SEC) do oznaczania rozkładu masy molekularnej polimerów; obserwacja przebiegu rozdzielania barwnych substancji w kolumnie HPLC. Streszczenie przebiegu ćwiczenia 1. Zapoznanie Uczestników z alternatywnymi sposobami postępowania, zapewniającymi zapobieganie / eliminację problemów spotykanych w praktyce i dotyczących: - doboru/oceny selektywności, sprawności, rozdzielczości i przepuszczalności kolumny, - dozowania bardzo małych i bardzo duŝych objętości próbki oraz doboru odpowiedniego rozpuszczalnika roztworu dozowanego do kolumny, - doboru właściwej metody detekcji oraz najkorzystniejszych warunków pracy najwaŝniejszych detektorów stosowanych w HPLC (UV-VIS, RI, FLD), - problemów spotykanych w warunkach elucji gradientowej i sposobów ich eliminacji / minimalizacji : zanieczyszczenie składników eluentu, obecność rozpuszczonego powietrza w cieczach stanowiących składniki eluentu, niedoskonałość systemu synchronizacji pracy zaworów proporcjujących i cyklicznej pracy pompy, nieodpowiednie parametry mieszalnika, demiksja składników eluentu w warunkach programowania składu cieczy eluującej, wytrącanie się składników próbki w eluencie o niskiej sile elucyjnej i innych. 2. Przykład wpływu składu eluentu na retencję i selektywność rozdzielania: chlorofili i karotenoidów zawartych w ekstrakcie roślinnym, albo produktów naftowych, albo mieszanin innych substancji nisko i średnio polarnych (do wyboru przez uczestników grupy) oraz przedstawienie i przedyskutowanie zakresu zastosowania detektora UV-VIS/DAD do zastosowań jakościowych oraz do określania tzw. czystości pików ; 3. Przedstawienie metodyki zastosowania chromatografii Ŝelowej do oznaczenia rozkładu masy molekularnej polimeru - kalibracja nisko-dyspersyjnymi standardami polimeru, a następnie oznaczenie rozkładu masy cząsteczkowej próbki polimeru (styropian, sztućce, albo fragment obudowy styropianowej). 4. Wizualna obserwacja przebiegu rozdzielania chlorofili i karotenoidów w kolumnie szklanej w warunkach NP-HPLC z detekcją UV-254, rejestracją w trybie Y-t. oraz kolekcją frakcji przykład preparatywnego zastosowania HPLC w skali modelowej.

12 Materiały, aparatura, oprogramowanie Składniki eluentu: n-heksan, n-heptan, eter metylowo tertbutylowy (MTBE), czterowodorofuran (THF), acetonitryl (ew.), wszystkie o czystości do HPLC ( HPLC grade ), albo do elucji gradientowej ( gradient grade ); Próbki i rozpuszczalniki próbek: odwodniony ekstrakt z trawy lub z liści do acetonu, przeprowadzony do rozpuszczalnika o składzie eluentu, albo roztwór oleju napędowego lub nafty w n-heptanie, lub w n- heksane o stęŝeniu 0,05g/ml; roztwór polimerów polistyrenowych w THF o stęŝeniach ok. 0.1 g/ml. Aparatura i wyposaŝenie: A) Modułowy chromatograf cieczowy MERCK HITACHI serii LaChrom (pompa HPLC, dozownik Rheodyne, kolumna 250x4mm typu CN um, termostat kolumny, detektor UV-VIS/DAD, detektor RI, interface, komputer, oprogramowanie HSM ; B) Chromatograf cieczowy z pompą strzykawkową, dozownik Rheodyne, detektor RI, rejestrator Y-t ; C) Bezpompowy zbiornikowy moduł zasilania kolumny pod wpływem spręŝonego azotu poprzez reduktor ciśnienia, z dozownikiem membranowym, kolumną szklaną HPLC, detektorem UV-254 i rejestratorem Y-t ; D) Chromatograf cieczowy serii Elite MERCK HITACHI, sterowany komputerem oraz oprogramowanie rejestracji i przetwarzania danych najnowszej generacji. Przydatne w praktyce zaleŝności obliczeniowe 1. Rozdzielczość (R S ) - uzaleŝnia stopień rozdzielenia substancji od sprawności i selektywności układu chromatograficznego i jest wyraŝona następującym równaniem: N α 1 k2 R S = 4 α 1+ k 2. Obliczanie sprawności i innych parametrów na podstawie chromatogramu testowego: LC S1/ 2 2 H = ( ) 5,54 l N = L H C = 5,54( As = 0,1 u = t 0 l S b a L C 1/ 2 2 ) 2 Obliczanie sprawności osiągalnej teoretycznie w chromatografii cieczowej niezaleŝnie od skali rozdzielania równanie Knoxa B 0,33 h teor = + Aν + Cν, gdzie ν H ud p h = ; ν = (dla dobrze wypełnionych i bardzo sprawnych kolumn: A=1, B=2, C=0,1) d p DM

13 Rys. Schemat, przedstawiający chromatogram testowy i sposób wyznaczania parametrów do obliczenia parametrów sprawności kolumny Znaczenie symboli: a, b część szerokości piku w 0,1 wysokości (patrz rys.) α - współczynnik selektywności As 0,1 współczynnik asymetrii piku w 0,1 wysokości A, B, C stałe dla konkretnej kolumny D M współczynnik dyfuzji molekularnej substancji rozdzielanej w eluencie d p średnica ziaren wypełnienia kolumny; wielkość ziaren wypełnienia kolumny h- tzw. zredukowana wysokość półki teoretycznej H wysokość wypełnienia równowaŝna półce teoretycznej h teor wartość h otrzymana z równania Knoxa k 2 współczynnik retencji substancji później eluowanej l odległość mierzona na chromatogramie ( w warunkach elucji izokratycznej i stałego natęŝenia przepływu eluentu) L C długość wypełnienia kolumny N- liczba półek teoretycznych R S stopień rozdzielenia S 1/2 szerokość piku w ½ wysokości t 0 czas martwy kolumny u - liniowa prędkość przepływu eluentu w kolumnie ν - tzw. zredukowana prędkość przepływu eluentu Uwagi i zalecenia Sugeruję, aby Uczestnicy ćwiczenia wykorzystali czas trwania ćwiczenia takŝe dla przedyskutowania z prowadzącymi i z innymi uczestnikami, problemów, z jakimi spotkali się w swojej praktyce stosowania HPLC. Literatura 1. Chromatografia cieczowa praca zbiorowa pod redakcją M. Kamińskiego, CEEAM, Gdańsk Z. Witkiewicz Podstawy chromatografii, WNT, Warszawa 1995 Notatki własne

14 ĆWICZENIE 4. ANALIZA ILOŚCIOWA ZWIĄZKÓW W PROBKACH dr inŝ. A. Kot-Wasik Pani Agata Kot-Wasik jest pracownikiem Katedry Chemii Analitycznej Wydziału Chemicznego Politechniki Gdańskiej; agata@chem.pg.gda.pl Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest przygotowanie krzywej kalibracyjnej metodą wzorca zewnętrznego do oznaczenia zawartości fluoksetyny w próbce. Charakterystyka fluoksetyny Produkcja, leków, choć tak poŝyteczna dla ludzi i zwierząt, moŝe stać się teŝ dla nich zagroŝeniem. Stosowanie ogromnej ilości antybiotyków, hormonów, środków przeciwbólowych czy uspokajających, stanowi powaŝny problem w dzisiejszym świecie. Stąd środki farmaceutyczne podawane ludziom są w dalszej kolejności obecne w mierzalnych stęŝeniach w wodach powierzchniowych, podziemnych jak równieŝ wodzie pitnej. Korzystanie z wody zanieczyszczonej przez pozostałości farmaceutyków, spoŝywanie produktów pochodzenia zwierzęcego zawierających pozostałości śladowe ilości leków, a takŝe ich metabolitów, zaburza równowagę w organizmie, oraz potęguje problem tak juŝ niebezpiecznego zjawiska lekooporności. Do leków antydepresyjnych najnowszej generacji zaliczane są selektywne inhibitory wychwytu zwrotnego serotoniny. Do leków tych naleŝy m.in. fluoksetyna, którą w 1988 roku wprowadziła na rynek firma Eli Lilly pod nazwą handlową Prozac. Jedna kapsułka np.: Prozac, poza wieloma innymi składnikami, zawiera 20 mg fluoksetyny.

15 Oznaczenie chromatograficzne. Techniki chromatograficzne są typowym przykładem technik opartych na pomiarze względnym czyli inaczej mówiąc na porównaniu sygnału detektora uzyskanego dla: próbki wzorcowej, w której znane jest stęŝenie analitu; próbki badanej. W związku z tym konieczne jest przygotowanie krzywych kalibracyjnych dla wszystkich analizowanych związków. Krzywe takie wyznacza się w oparciu o analizę próbek wzorcowych. Analiza jakościowa: Na podstawie zgodności czasów retencji analitów obecnych w próbce badanej i we wzorcu Na podstawie widma UV lub/i MS Na podstawie zgodności stosunku sygnału dla dwóch róŝnych długości fal

16 A1 A2 A 1 /A 2 = constans dla danego analitu Analiza ilościowa Pole pow ierzchni piku [A] metoda wzorca zewnętrznego y = 129,47x - 3,6134 R 2 = 0, StęŜenie [C] W tym celu naleŝy przygotować szereg rozcieńczeń analitu, nastrzyknąć do układu chromatograficznego i wyznaczyć zaleŝność powierzchni piku od stęŝenia. A następnie dokonać analizy chromatograficznej i znaleźć wartość powierzchni piku dla badanego analitu, po czym obliczyć stęŝenie (z krzywej kalibracyjnej y = ax + b lub z proporcji A/C = A x /C x gdzie, C x = C*A x / A ) Chromatogramy wzorcowych roztworów substancji o stęŝeniach róznych stęŝeniach. metoda dodatku wzorca metoda wzorca wewnętrznego metoda normalizacji

17 Warunki analizy chromatograficznej umozliwiającej oznaczenie zawartości fluksetyny Elementy układu pomiarowego Rodzaj elementu i parametry pracy Chromatograf cieczowy HPLC-UV-DAD, Agilent seria 1100 Faza ruchoma Składniki fazy ruchomej Skład Prędkość przepływu A: MeOH (0,1% TFAA) oraz B: H 2 O (0,1% TFAA) 40% MeOH : 60% H 2 O 0.5 ml/min Kolumna Discovery RP Amide 15cm x 3mm, 5µm Detektor UV 226nm Wielkość nastrzyku 20µl Czas trwania analizy 20 min Przebieg ćwiczenia: Przygotować wzorzec fluoksetyny o stęŝeniu 100mg/mL i nastrzyknąć. W kolbce miarowej o objętości 50 ml umieścić 5 mg wzorca fluoksetyny [FLU]. PoniewaŜ związek ten dobrze rozpuszcza się w metanolu, dopełnić kolbkę do kreski tymŝe rozpuszczalnikiem, a tym samym otrzyma się wzorzec o stęŝeniu 100µg/ml.

18 A B mau DAD1, (0.6 mau,bln) of CHECKV15.D DAD1, (1.0 mau, - ) of CHECKV15.D DAD1, (291 mau, - ) of CHECKV15.D Długość fali [nm] mau Długość fali [nm] DAD1, (1.5 mau, - ) of CHECKV15.D DAD1, (4.1 mau, - ) of CHECKV15.D DAD1, (686 mau, - ) of CHECKV15.D Chromatogram HPLC-DAD-MS uzyskany w trakcie analizy roztworu wzorcowego fluoksetyny (maprotylina jest tutaj wzorcem wewnętrznym) wraz z widmami UV i MS.

19 Sporządzenie rozcieńczeń roztworu wzorcowego fluoksetyny; Metodą serii rozcieńczeń w kolbkach o pojemności 10 ml wyposaŝonych w nakrętki z tworzywa sztucznego przygotować roztwory wzorcowe o stęŝeniach: 30, 20, 10, 5, 2, 0.7, 0.3, 0.2, 0.02, µg/ml. Z tak przygotowanych próbek do chromatografu cieczowego wprowadzić po 20µl kaŝdego roztworu. Nastrzyknąć ( 3 razy) roztwór wzorcowy o najwyŝszym stęŝeniu; Nastrzyknąć (3 razy) roztwór o niŝszym stęŝeniu; Potraktować tą analizę jako analizę próbki i policzyć stęŝenie na podstawie jednego punktu (z analizy pierwszej); zastanowić się nad źródłami błędu; Na podstawie analizy nr 1 oraz analizy nr 2 narysować krzywą kalibracyjną; określic jej parametry; Nastrzyknąć mieszaninę o trzecim stęŝeniu (3 razy) traktując ją jako analizę próbki i policzyć stęŝenie na podstawie dotąd otrzymanych wyników; zastanowić się nad źródłami błędów; Uzupełnić krzywą kalibracyjną o kolejny punkt; Powtórzyć schemat postępowania aŝ do uzyskania 5-7 punktowej krzywej kalibracyjnej; Krzywa wzorcowa dla fluoksetyny otrzymana na podstawie analiz z wykorzystaniem detektora DAD Wyznaczyć stęŝenie fluoksetyny w roztworze o nieznanym stęŝeniu.

20 Notatki własne

21 Wszelkie prawa zastrzeŝone. Nieautoryzowane rozpowszechnianie całości lub fragmentów niniejszych materiałów jest zabronione. Utwór nie moŝe być powielany ani rozpowszechniany za pomocą urządzeń elektronicznych, mechanicznych, kopiujących, nagrywających i innych bez pisemnej zgody posiadacza praw autorskich. Wykonywanie kopii jakąkolwiek metodą powoduje naruszenie praw autorskich do niniejszej publikacji.