JAK WYZNACZYĆ PARAMETRY WALIDACYJNE W METODACH INSTRUMENTALNYCH

Transkrypt

1 JAK WYZNACZYĆ PARAMETRY WALIDACYJNE W METODACH INSTRUMENTALNYCH dr inż. Agnieszka Wiśniewska EKOLAB Sp. z o.o. agnieszka.wisniewska@ekolab.pl

2 DZIAŁALNOŚĆ EKOLAB SP. Z O.O. Akredytowane laboratorium badawcze Ekolab Sp. z o.o. prowadzi następujące badania i pomiary: 1) badania laboratoryjne (wody, ścieków, gleby, osadów ściekowych, odpadów, próbek powietrza itp.), 2) pomiary środowiska pracy, 3) pomiary emisji zanieczyszczeń, 4) pomiary hałasu w środowisku, 5) pomiary skuteczności wentylacji, 6) badania czystości powietrza, 7) badania sprężonego powietrza.

3 AKREDYTACJA LABORATORIUM Akredytacja to uznanie przez jednostkę akredytującą kompetencji laboratorium do wykonywania określonych działań. W przypadku laboratoriów badawczych jest to uznanie kompetencji do wykonywania poszczególnych badań. W Polsce jedyną jednostką akredytacyjną jest Polskie Centrum Akredytacji (PCA). Akredytacja jest udzielana przez PCA na wniosek laboratorium, po dokonaniu jego oceny i potwierdzeniu, że spełnia określone wymagania. Ocena dokonywana jest podczas audytu z udziałem audytorów PCA.

4 AKREDYTACJA LABORATORIUM Laboratoria badawcze muszą spełniać wymagania normy PN-EN ISO/IEC 17025:2005 Ogólne wymagania dotyczące kompetencji laboratoriów badawczych i wzorcujących

5 AKREDYTACJA LABORATORIUM Punkt 5 normy przedstawia wymagania techniczne, jakie powinno spełnić laboratorium badawcze, aby uzyskać akredytację. Czynniki wpływające na prawidłowość i wiarygodność badań: - czynnik ludzki (personel); - warunki lokalowe i środowiskowe; - metody badań oraz ich walidacja; - wyposażenie; - spójność pomiarowa; - pobieranie próbek; - postępowanie z obiektami badania (badanymi próbkami).

6 AKREDYTACJA LABORATORIUM Metody badań oraz ich walidacja - stosowanie w laboratorium właściwych metod znormalizowanych i/lub metod własnych, - prawidłowe przeprowadzenie walidacji metod badawczych (procedura walidacji i protokół z walidacji), - szacowanie niepewności metod badawczych, - kontrola jakości wykonywanych badań.

7 AKREDYTACJA LABORATORIUM Spójność pomiarowa - stosowanie certyfikowanych wzorców i certyfikowanych materiałów odniesienia (CRM), - opracowanie procedur kalibracji wyposażenia pomiarowego, - upoważnienie personelu do przeprowadzania kalibracji, - stosowanie wywzorcowanych przyrządów pomiarowych ze świadectwami wzorcowania, - zachowanie spójności z jednostkami SI.

8 WALIDACJA Walidacja jest potwierdzeniem, przez zbadanie i przedstawienie obiektywnego dowodu, że zostały spełnione szczególne wymagania dotyczące konkretnie zamierzonego zastosowania. Walidacja ma zatem na celu sprawdzenie, czy w warunkach danego laboratorium jesteśmy w stanie wykonać oznaczenie daną metodą analityczną z założoną precyzją, dokładnością i niepewnością. Procedura pomiarowa szczegółowy opis sposobu postępowania prowadzącego do przeprowadzenia pomiarów za pomocą zastosowanej metody pomiarowej

9 KIEDY PRZEPROWADZAMY WALIDACJĘ? Walidacja powinna być przeprowadzona kiedy: 1) opracowujemy nową procedurę analityczną, 2) rozszerzamy zakres już zwalidowanej metodyki np. zakres oznaczanych stężeń, oznaczenie danego analitu w innej matrycy, 3) przeprowadzamy porównanie nowej metody analitycznej z inną znaną i zwalidowaną metodą, 4) stwierdzamy w wyniku kontroli jakości stosowanej metodyki zmienność jej parametrów walidacyjnych w czasie, 5) planujemy wykorzystanie danej metodyki w innym laboratorium, z zastosowaniem innej aparatury, lub oznaczenia rutynowe za pomocą danej metodyki mają być wykonywane przez innego analityka.

10 PRZED PRZYSTĄPIENIEM DO PROCESU WALIDACJI Przed przystąpieniem do procesu walidacji należy określić podstawowe cechy procedury analitycznej: czy ma to być analiza jakościowa, czy ilościowa; rodzaj oznaczanego analitu; rodzaj matrycy, w której będzie oznaczany dany analit; poziom i zakres stężeń oznaczanego analitu; obecność substancji przeszkadzających (interferentów) i sposoby ich wyeliminowania; istnienie regulacji prawnych lub innych wymogów, którym powinna sprostać dana procedura analityczna;

11 PRZED PRZYSTĄPIENIEM DO PROCESU WALIDACJI wymagana wartość granicy wykrywalności i granicy oznaczalności; wymagany poziom dla precyzji i poprawności metody; wymagany zakres stosowania; wymagana odporność metody; wymagana aparatura pomiarowa i sprzęt pomocniczy; czy istnieje możliwość zastosowania walidowanej procedury badawczej w innych laboratoriach.

12 ZAŁOŻENIA WALIDACYJNE Przeprowadzenie procesu walidacji wymaga zastosowania: ślepych próbek, wzorców (np. roztworów kalibracyjnych, próbek testowych, gazów wzorcowych, kalibratorów itp.), (certyfikowanych) materiałów odniesienia, powtórzeń, obróbki statystycznej wyników w celu wyznaczenia niepewności walidowanej metody.

13 PARAMETRY WALIDACJYJNE 1) precyzja (powtarzalność, precyzja pośrednia, odtwarzalność), 2) dokładność, 3) poprawność, 4) granica wykrywalności, 5) granica oznaczalności, 6) zakres pomiarowy, 7) liniowość, 8) selektywność, 9) odporność, 10) elastyczność.

14 PRECYZJA Precyzja to stopień zgodności pomiędzy niezależnymi wynikami uzyskanymi w trakcie analizy danej próbki z zastosowaniem danej procedury analitycznej. Precyzja jest miarą rozrzutu uzyskanych wyników oznaczeń wokół wartości średniej. Miarą precyzji jest odchylenie standardowe średniej lub względne odchylenie standardowe RSD: S x n i 1 n n 1 x x i 2 RSD S x x 100% gdzie: n liczba wykonywanych pomiarów x i pojedynczy pomiar _ x - średnia arytmetyczna z pomiarów Precyzja wyrażana jest jako powtarzalność, precyzja pośrednia lub odtwarzalność.

15 PRECYZJA Powtarzalność to precyzja wyników uzyskanych w tych samych warunkach pomiarowych, czyli w danym laboratorium, przez jednego analityka, na jednym aparacie pomiarowym, przy użyciu tych samych odczynników i tej samej próbki oraz w krótkim czasie. Precyzja pośrednia to precyzja wyników otrzymanych w danym laboratorium, ale przy większej zmienności parametrów, np. przez różnych analityków, na różnych aparatach pomiarowych, przy użyciu różnych odczynników (z innych partii lub innych producentów) i różnych próbek oraz w dłuższym czasookresie. Odtwarzalność to precyzja wyników uzyskiwanych dla danej metody pomiarowej, ale przez różnych analityków w różnych laboratoriach, a zatem na różnych aparatach pomiarowych i przy użyciu różnych odczynników.

16 PRZYKŁAD WYZNACZANIA POWTARZALNOŚCI OZNACZANIE JONU AMONOWEGO W WODZIE I ŚCIEKACH 10% zakresu WODA SUROWA 197/02/12-1 [mg/l] METODĄ SPEKTROFOTOMETRYCZNĄ ZAKRES 0,1-400 MG/L Zakres podstawowy 0,10-1,00 mg/l 10% 50% 90% zakresu zakresu zakresu ŚCIEKI WODA ŚCIEKI UZDATNIONA TECHNOLOGICZNE 61/02/12-1 [mg/l] 36/03/12-1 [mg/l] 159/01/12-1 [mg/l] Zakres poszerzony 0,1 400 mg/l 50% 90% zakresu zakresu ŚCIEKI ŚCIEKI 215/02/12-1 [mg/l] 212/02/12-1 [mg/l] 1 0,109 0,152 0,491 0, ,115 0,160 0,500 0, ,108 0,158 0,489 0, ,110 0,150 0,494 0, ,105 0,161 0,490 0, ,110 0,150 0,495 0, ,102 0,152 0,504 0, x śr 0,108 0,155 0,495 0, S sp 0,0041 0,0048 0,0055 0,0070 6,43 6,08 RSD 0,038 0,031 0,011 0,008 0,033 0,017 V m 3,80% 3,10 1,11% 0,85% 3,30% 1,74%

17 PRZYKŁAD WYZNACZANIA PRECYZJI POŚREDNIEJ OZNACZANIE JONU AMONOWEGO W WODZIE I ŚCIEKACH METODĄ SPEKTROFOTOMETRYCZNĄ ZAKRES 0,1-400 MG/L Wyniki dla próbki wody udział różnych analityków w badaniach biegłości: Analityk 1 Analityk 2 Analityk 3 Analityk 4 Analityk 5 0,188 mg/l 0,195 mg/l 0,183 mg/l 0,180 mg/l 0,198 mg/l Średnia wartość: 0,1889 mg/l Odchylenie standardowe średniej: 0,0077 mg/l RSD: 4,06%

18 PRZYKŁAD WYZNACZANIA ODTWARZALNOŚCI OZNACZANIE JONU AMONOWEGO W WODZIE I ŚCIEKACH METODĄ SPEKTROFOTOMETRYCZNĄ ZAKRES 0,1-400 MG/L Wyniki dla próbki ścieków - udział różnych laboratoriów w badaniach biegłości: Laboratorium 1: 0,20 mg/l Laboratorium 2: 0,23 mg/l Laboratorium 3: 0,26 mg/l Laboratorium 4: 0,16 mg/l Laboratorium 5: 0,18 mg/l Laboratorium 6: 0,21 mg/l Średnia wartość: 0,207 mg/l Odchylenie standardowe średniej: 0,036 mg/l RSD: 17,2%

19 POPRAWNOŚĆ, DOKŁADNOŚĆ Dokładność to stopień zgodności pomiędzy uzyskanym wynikiem pojedynczego pomiaru a wartością rzeczywistą. Poprawność (prawdziwość) to zgodność wyniku oznaczenia (jako wartości średniej obliczonej na podstawie serii pomiarów) z wartością rzeczywistą. Poprawność D wyraża się zależnością: gdzie: μ wartość odniesienia (certyfikowana), x śr wartość średnia pomiarów wielkości odniesienia. xsr μ D 100% μ

20 POPRAWNOŚĆ, DOKŁADNOŚĆ Poprawność metody szacowana może być w laboratorium w następujący sposób: a) przez analizę próbki o znanym stężeniu (np. próbki z badań międzylaboratoryjnych, certyfikowany materiał odniesienia, laboratoryjny materiał odniesienia) i porównanie wyników uzyskanych daną metodą z wartością prawdziwą, b) przez porównanie wyników badań uzyskanych daną metodą z wynikami otrzymanymi metodą odniesienia, której dokładność jest znana metoda wcześniej zwalidowana.

21 Stężenie [mg/l] OCENA BADAŃ BIEGŁOŚCI OZNACZANIE CHLORU WOLNEGO METODĄ SPEKTROFOTOMETRYCZNĄ 0,55 Chlor wolny 0,5 0,45 0,454 0,46 0,451 0,433 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 Wartość przypisana Wartość otrzymana ANALITYK 1 Wartość otrzymana ANALITYK 2 Wartość otrzymana ANALITYK 3

22 POPRAWNOŚĆ, DOKŁADNOŚĆ, PRECYZJA μ mała precyzja, mała poprawność, mała dokładność μ mała precyzja, duża poprawność, mała dokładność μ duża precyzja, mała poprawność, mała dokładność μ duża precyzja, duża poprawność, duża dokładność

23 PRZYKŁADY Sytuacja I (mała precyzja, mała dokładność i mała poprawność) Stężenie azotu azotanowego w ściekach 15 mg/l Uzyskane wyniki: 20 mg/l (dokładność: 33,3%) 25 mg/l (dokładność: 66,7%) 30 mg/l (dokładność: 100%) 40 mg/l (dokładność: 167%) 35 mg/l (dokładność: 133%) Wartość średnia: 30 mg/l Odchylenie standardowe: 7,91 mg/l RSD: 26,4% Poprawność: 100% μ mała precyzja, mała poprawność, mała dokładność

24 PRZYKŁADY Sytuacja II (duża precyzja, mała dokładność i mała poprawność) Stężenie azotu azotanowego w ściekach 15 mg/l Uzyskane wyniki: 31 mg/l (dokładność: 107%) 32 mg/l (dokładność: 113%) 30 mg/l (dokładność: 100%) 28 mg/l (dokładność: 86,7%) 29 mg/l (dokładność: 93,3%) Wartość średnia: 30 mg/l Odchylenie standardowe: 1,58 mg/l RSD: 5,27% Poprawność: 100% μ duża precyzja, mała poprawność, mała dokładność

25 PRZYKŁADY Sytuacja III (mała precyzja, mała dokładność i duża poprawność) Stężenie azotu azotanowego w ściekach 15 mg/l Uzyskane wyniki: 20 mg/l (dokładność: 33,3%) 10 mg/l (dokładność: 60%) 25 mg/l (dokładność: 66,7%) 7 mg/l (dokładność: 53,3%) 15 mg/l (dokładność: 0%) Wartość średnia: 15,4 mg/l Odchylenie standardowe: 7,30 mg/l RSD: 47,4% Poprawność: 2,67% μ mała precyzja, duża poprawność, mała dokładność

26 PRZYKŁADY Sytuacja IV (duża precyzja, duża dokładność i duża poprawność) Stężenie azotu azotanowego w ściekach 15 mg/l Uzyskane wyniki: 15,5 mg/l (dokładność: 3,33%) 15,0 mg/l (dokładność: 0%) 14,5 mg/l (dokładność: 3,33%) 15,7 mg/l (dokładność: 4,67%) 14,8 mg/l (dokładność: 1,33%) Wartość średnia: 15,1 mg/l Odchylenie standardowe: 0,49 mg/l RSD: 3,28% Poprawność: 0,67% μ duża precyzja, duża poprawność, duża dokładność

27 GRANICA WYKRYWALNOŚCI Granica wykrywalności (LOD) danej metody analitycznej jest to najmniejsza ilość (stężenie) badanej substancji w próbce, która może być wykryta za pomocą danej procedury analitycznej, lecz niekoniecznie oznaczona z odpowiednią dokładnością. Jest to najmniejsze stężenie analitu, przy którym istnieje pewność jego obecności w próbce. LOD 0 3 s Granica oznaczalności danej metody analitycznej jest to najmniejsza ilość (stężenie) badanej substancji w próbce, jaka może być oznaczona z odpowiednią precyzją i dokładnością. LOQ 3 LOD LOQ 2 LOD

28 LINIOWOŚĆ Liniowość to zależność wprost proporcjonalną sygnału do stężenia substancji oznaczanej w próbie w określonym zakresie, wyznacza nam równanie krzywej regresji: y bx a gdzie: y wartość mierzona x stężenie analitu b czułość (nachylenie krzywej kalibracyjnej) a wartość sygnału odpowiadającej próbce ślepej (dla x=0)

29 LINIOWOŚĆ Współczynnik korelacji liniowej krzywej kalibracyjnej zależność między obu zmiennymi charakteryzuje współczynnik korelacji liniowej krzywej kalibracyjnej r: r n i 1 n i 1 (x (x i i x)(y x) 2 n i 1 i y) (y i y) 2 gdzie: x i stężenie wzorca i-tego y i odpowiedź wzorca i-tego Wyznaczona wartość r powinna być większa niż 0,995 w przeciwnym razie funkcja jest nieliniowa.

30 WZRASTAJĄCE SYGNAŁY ANALITYCZNE OZNACZANIE PCB W WODZIE I ŚCIEKACH METODĄ GC

31 WZRASTAJĄCE SYGNAŁY ANALITYCZNE OZNACZANIE OLEJU MINERALNEGO W POWIETRZU METODĄ SPEKTOMETRII ATOMOWEJ W PODCZERWIENI (IR)

32 LINIOWOŚĆ y = x R² =

33 ZAKRES POMIAROWY Zakres pomiarowy jest to przedział między minimalną i maksymalną zawartością (np. stężeniem) substancji w badanej próbce, w którym metoda analityczna ma odpowiednią liniowość, dokładność i precyzję. Zakres pomiarowy określa się na podstawie wyników uzyskanych w części: liniowość, dokładność i precyzja. Określa się go przez porównanie zakresów, w których spełnione są kryteria akceptacji dla powyższych badań.

34 SELEKTYWNOŚĆ Selektywność to możliwość dokładnego i precyzyjnego oznaczenia badanej substancji w obecności innych składników w próbce rzeczywistej w danych warunkach pomiarowych. Selektywność metody badana jest poprzez pomiary zawartości danego analitu z dodatkiem wzorca i bez jego dodatku i wyznaczenie odzysku. x 1 2 % x R x 100 gdzie: 3 x 1 - średnia wartość próbki z dodatkiem określonej ilości wzorca, x 2 - średnia wartość próbki nie wzmocnionej, x 3 - dodana ilość wzorca.

35 PRZYKŁAD Oznaczanie fosforu ogólnego w ściekach metodą atomowej spektrometrii emisyjnej ze wzbudzeniem w palmie indukcyjnie sprzężonej (ICP-OES) 88/06/ /06/ mg/l 88/06/ mg/l 88/06/ mg/l Pomiar 1 1,89 10, Pomiar 2 1,92 11, Pomiar 3 1,95 11, Pomiar 4 1,99 12, Pomiar 5 2,08 13, Pomiar 6 2,12 13, Pomiar 7 2,15 13, Średnia 2,01 12, RSD 5,1% 10,4% 6,31% 1,34% Odzysk 102,8% 109,9% 100,8%

36 ODPORNOŚĆ Odporność (niewrażliwość) metody określa wpływ niewielkich wahań warunków, w których prowadzi się pomiary, na wartość wyniku końcowego oznaczenia. Jest to parametr odnoszący się do zmian warunków wewnątrz laboratorium. Jeśli pomiar jest wrażliwy na zmianę warunków analitycznych, warunki te powinny być odpowiednio kontrolowane i utrzymywane w miarę możliwości na stałym poziomie.

37 ELASTYCZNOŚĆ Elastyczność (tolerancyjność) to parametr określający przydatność danej metody analitycznej w przypadku różnych warunków. Przykłady typowych zmian to: stabilność badanych roztworów (np. po 24 godzinach), wpływ wahań temperatury, wpływ wahań ciśnienia, wpływ zmian czystości i rodzaju stosowanych odczynników, wpływ wahań ph, wpływ temperatury i czasu mineralizacji próbki, wpływ czasu poboru pyłu z powietrza, stabilność wagi prób pyłów (np. po 24 i 48 godzinach) itp. Wartość tych parametrów obliczana jest na podstawie badania zmian wartości odchylenia standardowego serii pomiarów przy niewielkich zmianach parametrów stosowanej metody analitycznej.

38 DZIĘKUJĘ ZA UWAGĘ