Walidacja metod analitycznych

Transkrypt

1 Kierunki rozwoju chemii analitycznej Walidacja metod analitycznych Raport z walidacji Małgorzata Jakubowska Katedra Chemii Analitycznej WIMiC AGH oznaczanie coraz niŝszych stęŝeń w próbkach o złoŝonej matrycy przy bardzo małej objętości próbki Problem: kontrola i zapewnienie jakości uzyskiwanych wyników Rola systemu kontroli jakości wyników analitycznych w chemii analitycznej Cykliczny charakter postępowania analitycznego Systemy zapewnienia jakości pracy laboratoriów analitycznych W celu osiągnięcia moŝliwie najszerszej akceptacji wyników oznaczeń laboratoria podejmują liczne działania dla osiągnięcia wysokiej jakości uzyskiwanych rezultatów. Systemy zapewnienia jakości: normy PN-EN ISO serii 9000 norma PN-EN ISO/IEC 17025:2005 Dobra Praktyka Laboratoryjna Elementy systemów jakości stosowanie odpowiedniej atestowanych metod analitycznych (walidacja metod) prowadzenie analiz w profesjonalny sposób (laboratoria akredytowane) stosowanie wzorców i materiałów odniesienia o znanym składzie i czystości systematyczna kontrola uzyskiwanych wyników pomiarów. 1

2 Przykłady rozrzutu wyników analitycznych obserwowane w porównaniach międzylaboratoryjnych na przestrzeni kilkunastu lat Materiał Liczba Pierwiastek Rozstęp wyników laboratoriów Rok Olej opałowy Ag 0,006 0,1 µg/g Hg 0,005 0, µg/g 1973 Węgiel K µg/g 197 Mleko w proszku IAEA A-11 Cd Co Cr , ng/g 0,00 51,5 µg/g 0, µg/g 1980 Mleko w proszku IAEA A-11 Liście tytoniu typu Oriental CTA-OTL-1 Ni Pb Cr Cs Na Pb ,1 500 ng/g ng/g ,038 11,6 µg/g 0,117 11,6 µg/g 8, µg/g 0,051 19,5 µg/g 1992 Wnioski rozstęp wyników dostarczonych przez laboratoria uczestniczące w porównaniach międzylaboratoryjnych często sięga kilku rzędów wielkości za tak znaczny rozrzut wyników odpowiedzialne są błędy analityczne. Ilustracja pojęć: zasada pomiaru, metoda analityczna oraz postępowanie analityczne Norma ISO 17025:2005 Norma PN-EN ISO/IEC 17025:2005 pt. Ogólne wymagania dotyczące laboratoriów badawczych i wzorcujących przedstawia kryteria dotyczące laboratoriów, które: zamierzają wykazać, Ŝe są kompetentne technicznie stosują skuteczny system zarządzania są zdolne do przedstawienia miarodajnych wyników wzorcowań oraz badań. Norma ta stanowi podstawę do akredytacji laboratorium przez jednostkę akredytacyjną (w Polsce - Polskie Centrum Akredytacji). Wśród metod zapewnienia wysokiej jakości świadczeń akredytacja jest najszerzej sprawdzoną na świecie i najskuteczniejszą. Walidacja metod analitycznych (według normy PN-EN ISO/IEC 17025) Rozdział pt. Wymagania techniczne personel warunki lokalowe i środowiskowe metody i procedury badań oraz ich walidacja wyposaŝenie spójność pomiarowa pobieranie próbek postępowanie z obiektami do badań i wzorcowań zapewnienie jakości wyników badania i wzorcowania przedstawianie wyników Walidacja metod analitycznych (według normy PN-EN ISO/IEC 17025) Metody i procedury badań oraz ich walidacja naleŝy preferować metody opublikowane w aktualnych normach międzynarodowych, regionalnych lub krajowych, zalecane przez renomowane organizacje techniczne lub fachowe czasopisma naukowe albo metody podane przez producenta wyposaŝenia moŝna wykorzystać metody opracowane lub zaadoptowane przez laboratorium, jeŝeli zostały poddane procesowi walidacji procedury badawcze powinny być aktualne i stale uaktualniane, a ich opisy udokumentowane i łatwo dostępne dla personelu 2

3 Walidacja metod analitycznych (według normy PN-EN ISO/IEC 17025) walidacja jest potwierdzeniem, przez zbadanie i przedstawienie obiektywnego dowodu, Ŝe zostały spełnione szczególne wymagania dotyczące konkretnego zamierzonego zastosowania metody laboratorium powinno przeprowadzić walidację metod nieznormalizowanych, metod zaprojektowanych lub rozwijanych w laboratorium, metod znormalizowanych wykorzystywanych poza przewidzianym dla nich zakresem oraz metod znormalizowanych, które zostały rozszerzone lub zmodyfikowane, aby potwierdzić, ze metody te są właściwe do zamierzonego zastosowania walidacja jest na tyle obszerna, na ile jest to konieczne przy danym zastosowaniu lub obszarze zastosowania Walidacja metod analitycznych (według ISO Przewodnik WyraŜanie niepewności pomiarów ) to proces ustalania parametrów charakteryzujących sprawność działania i ograniczeń metody oraz sprawdzenie jej przydatności do określonych celów. Podczas wykonywania walidacji naleŝy: określić, które parametry powinny być wyznaczone wyznaczyć wartości tych parametrów charakteryzujące metodę na tej podstawie określić czy metoda spełnia stawiane jej wymagania związane z zamierzonym zastosowaniem wyników analitycznych. W efekcie wykonania walidacji moŝna uzyskać pewność, Ŝe proces analizy przebiega w sposób rzetelny i precyzyjnie oraz daje wiarygodne wyniki. Walidację wykonujemy gdy: opracowywana jest nowa metoda analityczna prowadzone są próby rozszerzenia zakresu stosowalności znanej metody analitycznej (np. do oznaczania znanego analitu do próbek o innej matrycy) kontrola jakości stosowanej metody wykazała zmienność jej parametrów w czasie dana metoda analityczna ma być wykorzystywana w innym laboratorium przeprowadza się porównanie danej metody z inną metoda odniesienia. Warunki uzyskania wiarygodnych wyników walidacji: stosowanie substancji porównawczych i pomocniczych o odpowiedniej, znanej czystości (certyfikowane) stosowanie sprawdzonej aparatury wykonanie badań przez personel o odpowiednich kwalifikacjach dokumentowanie kaŝdego etapu procesu walidacyjnego. Proces walidacji składa się zazwyczaj z następujących etapów: określenie przeznaczenia metody analitycznej i jej zakresu, definicja testowanych parametrów analitycznych oraz kryteria akceptacji, opracowanie planu eksperymentów walidacyjnych, sprecyzowanie charakterystyki sprzętu, przygotowanie wzorców oraz odczynników, eksperymenty walidacyjne z ewentualną korektą parametrów metody, obliczenia, interpretacja wyników, sprawdzenie kryteriów akceptacji, opracowanie standardowej procedury operacyjnej dla badanej metodyki, określenie kryteriów rewalidacji, sporządzenie raportu. 3

4 Parametry brane pod uwagę podczas walidacji: specyficzność/selektywność precyzja (powtarzalność, precyzja pośrednia i odtwarzalność) dokładność zakres metody liniowość granica wykrywalności granica oznaczalności elastyczność. Przeprowadzenie procesu walidacji wymaga zastosowania: ślepych próbek ( w tym takŝe ślepych próbek odczynnikowych) roztworów wzorcowych (roztworów kalibracyjnych, próbek testowych) próbek ze znaną ilością dodanego analitu (wzbogaconych w analit) powtórzeń pomiaru analizy statystycznej zbiorów wyników. Selektywność/specyficzność: selektywność odnosi się do metody dającej sygnał od kilku związków, które moŝna albo których nie moŝna rozróŝnić jeŝeli odpowiedź systemu na interesującą substancję moŝna odróŝnić od wszystkich innych sygnałów, metodę uznaje się za selektywną selektywność - zdolność jednoznacznego określenia substancji analizowanej w obecności składników, które mogą być zawarte w próbce, np. substancji pomocniczych, zanieczyszczeń, itd. specyficzność - jedynie analit jest źródłem niezakłóconego sygnału analitycznego, zaś interferencje nie występują Selektywność/specyficzność: ocenę zdolności metody do identyfikacji analitu prowadzimy dla próbki zawierającej testowany składnik (test pozytywny) i próbki nie zawierającej analizowanej substancji (test negatywny) analizujemy takŝe próbki zawierające róŝne moŝliwe interferenty oraz analit w przypadku, gdy nie jest moŝliwe udowodnienie specyficzności/selektywności danej metody analitycznej, naleŝy zastosować kombinację dwu lub więcej metod analitycznych by osiągnąć odpowiedni poziom pewności; muszą to być metody niezaleŝne, dobrze scharakteryzowane. Precyzja: stopień zgodności między pojedynczymi wynikami analizy (rozrzut wyników), gdy dana procedura jest stosowana dla wielokrotnie powtarzanych, niezaleŝnych oznaczeń jednorodnej próbki najczęściej miarą precyzji jest odchylenie standardowe S, względne odchylenie standardowe RSD lub współczynnik zmienności CV obejmuje pojęcia: powtarzalność, precyzja pośrednia i odtwarzalność. Precyzja czynniki podlegające zmianom: operator aparatura odczynniki od róŝnych dostawców kalibracja przyrządów otoczenie (np. temperatura, wilgotność, zanieczyszczenie powietrza) odstępy czasu pomiędzy pomiarami

5 Powtarzalność : wyraŝa precyzję oznaczeń wykonanych w krótkim odstępie czasu, przez tego samego analityka i w tych samych warunkach (te same odczynniki, ten sam sprzęt) naleŝy wykonać minimum 6 powtórzeń dla poziomu stęŝenia 100% lub po trzy powtórzenia dla kaŝdego z minimum trzech poziomów stęŝeń w zakresie metody (zalecane % nominalnego stęŝenia) wyznacza się wartość średnią, przedział ufności, odchylenie standardowe, względne odchylenie standardowe oraz współczynnik zmienności uzyskanych wyników. Precyzja pośrednia : wyraŝa precyzję oznaczeń wykonanych w tym samym laboratorium zmienność wynika z: róŝne dni prowadzenia pomiarów, analitycy, wyposaŝenie badania są prowadzone analogicznie jak w przypadku powtarzalności wyznacza się wartośćśrednią, przedział ufności, odchylenie standardowe, względne odchylenie standardowe oraz współczynnik zmienności uzyskanych wyników. Odtwarzalność: pozwala ocenić, czy metoda prowadzi do tych samych rezultatów w róŝnych laboratoriach z róŝnymi analitykami, na innym sprzęcie i w innych warunkach, z zachowaniem parametrów wymaganych w opisie metody (porównanie międzylaboratoryjne) badania są prowadzone analogicznie jak w przypadku powtarzalności wyznacza się wartośćśrednią, przedział ufności, odchylenie standardowe, względne odchylenie standardowe oraz współczynnik zmienności uzyskanych wyników precyzja w warunkach odtwarzalności jest ok. 2-3 razy mniejsza niŝ w warunkach powtarzalności Precyzja pomiarów - kryteria akceptacji dla powtarzalności (szacunkowe wartości) Precyzja pomiarów fizycznych 10 - % do 10-3 % Precyzja pomiarów chemicznych ok. 5% przemysł farmaceutyczny 1% próbki biologiczne 10-15% próbki środowiskowe, Ŝywność 2-20% Precyzja w funkcji stęŝenia analitu Dokładność: zgodność między wartością rzeczywistą (zawartością, stęŝeniem) a wartością będącą wynikiem analizy miarą dokładności metody analitycznej jest wielkość jej błędu systematycznego metoda niedokładna moŝe być obarczona błędem systematycznym stałym (niezaleŝnym od poziomu zawartości oznaczanego składnika) i zmiennym (zaleŝnym od stęŝenia oznaczanego składnika) powinna być oszacowana na podstawie minimum 9 wyników oznaczeń dla minimum trzech róŝnych poziomów stęŝeń z badanego zakresu (np. trzykrotne oznaczenie dla trzech poziomów) najczęściej wynik przedstawia się jako błąd bezwzględny lub względny lub procent odzysku 5

6 Szacowanie dokładności metody : przez analizę próbki o znanym stęŝeniu (np. certyfikowany materiał odniesienia) i porównanie wyników uzyskanych walidowaną metodą z wartością prawdziwą przez porównanie wyników uzyskanych walidowaną metodą z wynikami otrzymanymi metodą odniesienia, której dokładność jest znana przez dodanie znanej ilości analitu do badanego produktu, a następnie jego oznaczenie sprawdzaną metodą. Szacowanie dokładności metody : Dokładność moŝe być przedstawiona jako procent odzysku, który oblicza się wg wzoru: x i *100%, gdzie µ x i oznaczona ilość analitu w badanej próbce, µ- znana ilość analitu w badanej próbce Średni odzysk w funkcji stęŝenia Precyzja i dokładność metod analitycznych a) metoda dokładna i precyzyjna b) metoda precyzyjna ale mało dokładna c) metoda mało precyzyjna ale dokładna d) metoda mało dokładna i mało precyzyjna Liniowość: zdolność do uzyskiwania wyników pomiaru analitycznego wprost proporcjonalnych do stęŝenia (zawartości) substancji oznaczanej w próbce, w określonym zakresie zgodnie z wyznaczonym równaniem matematycznym y = ax+b zaleŝność między obu zmiennymi charakteryzuje współczynnik korelacji r liniowość wykazuje się przez analizę próbek o stęŝeniach analitu, obejmujących deklarowany zakres stęŝeń metody naleŝy wykonać badanie minimum 5-ciu serii wzorców (3-6 powtórzeń), których stęŝenia obejmują % stęŝenia spodziewanego w próbce. Liniowość: y,zmierzony sygnał 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 y = 0,0085x + 0,00235 r = 0,99662 Kryterium akceptacji: w przypadku oznaczania substancji głównej współczynnik r powinien być większy od 0,995, w przypadku oznaczania śladów powinien być większy od 0,98. 0,05 0, x,odwaŝka badanej próbki [mg] 6

7 Granica wykrywalności (DL) jest to najmniejsza ilość (stęŝenie) badanej substancji w próbce, które moŝe być wykryta, lecz niekoniecznie oznaczona z odpowiednią dokładnością. Granica oznaczalności (QL) jest to najmniejsza ilość (stęŝenie) badanej substancji w próbce, jaka moŝe być ilościowo oznaczona z odpowiednią precyzją i dokładnością. Granica wykrywalności (DL) / granica oznaczalności (QL) - metody wyznaczania w oparciu o ocenę wizualną (metody nieinstrumentalne) przez ocenę stosunku sygnału do szumu (dla DL dopuszczalny 3:1) obliczeniowo: 3.3* S DL = b 10* S QL = b 3.3* S DL = b 10* S QL = b S odchylenie standardowe ślepej próby b nachylenie prostej kalibracji S odchylenie standardowe ślepej próby b nachylenie prostej kalibracji Zakres: przedział między minimalną i maksymalną zawartością (stęŝeniem) substancji aktywnej w badanej próbie, w którym metoda analityczna ma odpowiednią liniowość, dokładność i precyzję. Minimalny zakres stosowania metody analitycznej powinien wynosić (kryteria akceptacji): dla zawartości substancji głównej od 80% do 120% deklarowanej ilości analitu w badanej próbie Elastyczność (stabilność metody): badanie elastyczności metody powinno udowodnić niezawodność analizy po wprowadzeniu niewielkich celowych zmian parametrów metody (warunki robocze, otoczenie) jeśli pomiar jest wraŝliwy na zmianę warunków analitycznych, warunki te powinny być odpowiednio kontrolowane lub dokładnie opisane w procedurze. w przypadku oznaczania substancji na poziomie śladowym zakres powinien wynosić od 10% do 120% maksymalnej dopuszczalnej zawartości tej substancji określonej w specyfikacji. Raport z walidacji metod analitycznych (wykonany po zakończeniu prac laboratoryjnych) powinien zawierać: przedmiot i zakres walidacji rodzaj oznaczanych związków i matrycy opis metody walidacji kryteria akceptacji stosowane odczynniki, substancje porównawcze i wzorce opis aparatury (producent, typ) względy bezpieczeństwa opis przeprowadzonego eksperymentu i parametry pomiaru postępowanie statystyczne i obliczenia reprezentatywne wykresy kryteria rewalidacji podsumowanie i wnioski. 7

8 1. Walidowana metoda analityczna ogólne informacje o metodzie i zastosowanej aparaturze z podaniem jej typu odczynniki roztwory wzorcowe rozwory badane wykonanie pomiaru. 2. Wybór optymalnych warunków pomiaru badania jakie wykonano w celu określenia optymalnych warunków pomiaru parametry podlegające modyfikacji wyniki osobno dla kaŝdego zmienianego parametru (w tabeli wartość parametru, wyniki np. 7 powtórzeń, średnia, odchylenie standardowe) wnioski. Przykład: Dobór optymalnego przepływu acetylenu (fragment tabeli wyników) Numer poziomu 2 Absorbancja Średnia absorbancja Odchylenie standardowe 3. ZałoŜenia walidacyjne 3.1. Specyficzność/selektywność opis pomiarów jakie naleŝy wykonać wymagane wzorce wraz z określeniem stęŝeń sposób obliczenia wyniku kryterium akceptacji Powtarzalność 3.3. Precyzja pośrednia 3.. Dokładność 3.5. Liniowość 3.6. Zakres metody 3.7. Granica oznaczalności..1. Specyficzność/selektywność opis pomiarów jakie wykonano lista wzorców jakie wykorzystano wraz z podaniem stęŝeń wyniki pomiarów wyniki obliczeń Przykład. Badanie wpływu Na na wynik oznaczenia Ca metodą ASA. Stosunek stęŝeń Na:Ca 0:1 1:10 1:5 1:2 Średnia absorbancja RóŜnica średnich absorbancji wzorca bez dodatku Na i wzorca z dodatkiem Na Kryterium akceptacji :1 10:

9 .2. Powtarzalność opis pomiarów jakie wykonano lista wzorców jakie wykorzystano wraz z podaniem stęŝeń wyniki pomiarów wyniki obliczeń Przykład. Badanie powtarzalności oznaczania Ca metodą ASA. StęŜe nie [mg/l] A A A A A A A A S CV [%] Precyzja pośrednia tak jak powtarzalność ale dwóch róŝnych dniach.. Dokładność opis pomiarów jakie wykonano lista wzorców jakie wykorzystano wraz z podaniem stęŝeń wyniki pomiarów obliczony wynik wraz z podaniem poziomu niepewności pozostałe wyniki obliczeń Przykład. Badanie dokładności oznaczeania Ca metoda ASA. StęŜenie [mg/l] Absorbancja Średnia absorbancja Średnie stęŝenie Prosta kalibracji: y=0.085x Stopień odzysku [%].5. Liniowość opis pomiarów jakie wykonano lista wzorców jakie wykorzystano wraz z podaniem stęŝeń wyniki pomiarów wyniki obliczeń (współczynniki prostej kalibracji, współczynnik korelacji) wykres prostej kalibracji 9

10 Przykład. Badanie liniowości oznaczania Ca metodą ASA. StęŜenie [mg/l] Średnia absorbancja Zakres metody informacja jak obliczono zakres metody uzyskany wynik (tj. zakres) Granica oznaczalności informacja jak obliczono granicę oznaczalności uzyskany wynik (tj. DL) 5. Wnioski końcowe informacja czy walidacja została zakończona wynikiem pozytywnym i metoda moŝe być stosowana. Wykonał: xxx KONIEC RAPORTU Korzyści wynikające z walidacji podczas walidacji laboratorium uzyskuje informacje na temat czynników wpływających na wynik (moŝe doskonalić i optymalizować metodę) laboratorium jest w stanie wybrać metodę adekwatną do rozwiązywanego problemu w przypadku otrzymania zapytania od klienta laboratorium moŝe niezwłocznie zaproponować metodę badawczą, której wartości parametrów są znane Dziękuję za uwagę! 10