PL 222513 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 222513 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 395180 (51) Int.Cl. C12Q 1/68 (2006.01) C12N 9/22 (2006.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 08.06.2011 (54) Sposób określania sekwencji preferowanych przez białko lub jego domeny wiążące specyficznie sekwencje w hybrydzie DNA-RNA (43) Zgłoszenie ogłoszono: 17.12.2012 BUP 26/12 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 31.08.2016 WUP 08/16 (73) Uprawniony z patentu: MIĘDZYNARODOWY INSTYTUT BIOLOGII MOLEKULARNEJ I KOMÓRKOWEJ W WARSZAWIE, Warszawa, PL (72) Twórca(y) wynalazku: JANUSZ MAREK BUJNICKI, Warszawa, PL AGATA KAMASZEWSKA, Warszawa, PL KRZYSZTOF JERZY SKOWRONEK, Hornówek, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Andrzej Witek
2 PL 222 513 B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest sposób ustalania sekwencji preferowanych przez białko lub jego domeny wiążące specyficznie sekwencje w hybrydzie DNA-RNA, prezentowany wynalazek ma zastosowanie w genetyce. Opisana poniżej metoda znajduje zastosowanie do ustalania preferencji substratowych wszelkich białek wiążących specyficzne sekwencje w hybrydzie DNA-RNA. Metoda może stanowić uzupełnienie procedury inżynierii specyficzności takich białek. Białka wiążące hybrydy DNA-RNA w sekwencyjnie specyficzny sposób mogą znaleźć zastosowanie w diagnostyce niektórych wirusów RNA (np. wirusy onkogenne, retrowirusy, zapalenia wątroby typu B, grypy), które replikują się przez przejściowe utworzenie nici DNA na matrycy RNA. Takie białka mogą znaleźć zastosowanie również w inżynierii białek do uzyskiwania enzymów o nowych nieznanych specyficznościach np. w fuzji z nukleazą. W dokumencie WO2011022427 wskazano metodę (SELEX ) polegającą na tym, że w celu identyfikacji preferowanych sekwencji, kolejno przeprowadza się etapy: kontaktowania mieszaniny kwasów nukleinowych z cząsteczką docelową, np. białkiem; oddzielania niezwiązanych kwasów nukleinowych od kwasów nukleinowych wiążących się z cząsteczką docelową; amplifikacji związanych kwasów nukleinowych; i opcjonalnie powtarzania poprzedzających etapów. Przedmiotem wynalazku jest sposób określenia sekwencji preferowanych przez białko lub domenę białka, które to białko lub domena wiążąca obejmuje palec cynkowy, wiążący specyficznie sekwencje w hybrydach DNA-RNA, charakteryzujący się tym, że obejmuje: a) kontaktowanie oczyszczonego białka lub jego domeny z mieszaniną substratów stanowiącą bibliotekę cząsteczek hybryd DNA-RNA zawierających zróżnicowane sekwencje w części centralnej, korzystnie randomizowany fragment 9 lub 10 nukleotydowy, oflankowane stałymi, znanymi sekwencjami i umożliwienie testowanemu białku lub domenie na związanie się z sekwencją, do której ma powinowactwo; b) oddzielanie niezwiązanych hybryd DNA-RNA poprzez imobilizowanie białka lub jego domeny, ze związaną hybrydą DNA-RNA. na złożu, korzystnie agarozie z glutationem; c) usuwanie niezwiązanych hybryd; d) izolowanie rekombinowanego białka wraz ze związanymi z nimi hybrydami DNA-RNA, korzystnie poprzez dodanie buforu zawierającego glutation; e) amplifikowanie wyizolowanych hybryd za pomocą PCR, korzystnie RT-PCR, przy czym do amplifikacji używa się startery komplementarne do niezmiennych sekwencji znajdujących się na flankach randomizowanego regionu a w trakcie reakcji PCR na jednym starterze dodawana jest sekwencja promotora polimerazy RNA do uzyskania dwuniciowego DNA do transkrypcji in vitro z wykorzystaniem polimerazy RNA; f) odwrotną transkrypcję z użyciem odwrotnej transkryptazy z usuniętą aktywnością rybonukleazy H oraz startera DNA komplementarnego do końca 3 matrycy RNA w celu uzyskania hybryd DNA-RNA do zawracania do etapu a). Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że sekwencja promotora obejmuje sekwencję promotora dla polimerazy RNA T7, a polimerazą RNA jest polimeraza RNA T7. Korzystnie, białkiem lub jego domeną wiążącą jest białko rekombinowane lub domena rekombinowana, którą jest fuzja rybonukleazy HI oraz palca cynkowego Korzystnie, białkiem lub jego domeną wiążącą jest fuzja domeny palca cynkowego i domeny transferazy-s glutationowej (GST). Korzystniej sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że jako palec cynkowy stosuje się Zf-QQR. Aby ustalić pełny zakres sekwencji rozpoznawanych przez białko wiążące specyficzną sekwencję w hybrydzie DNA-RNA, opracowano modyfikację metody SELEX, przedstawioną w prezentowanym wynalazku, umożliwiającą wielokrotne powtarzanie cykli selekcji sekwencji preferencyjnie wiązanej przez badany ligand (fig. 1). Nowym elementem tego procesu jest sposób amplifikacji i odtworzenia wyselekcjonowanych hybryd DNA-RNA, tak aby można je było wykorzystać w kolejnym cyklu. Polega on na amplifikacji przy użyciu PCR biblioteki oligonukleotydów DNA zawierających w części centralnej sekwencję zdegenerowaną, którą po obu stronach otaczają sekwencje niezmienne, w tym
PL 222 513 B1 3 sekwencja promotora dla polimerazy RNA T7. Otrzymane DNA służy jako matryca do syntezy nici RNA z wykorzystaniem polimerazy T7. Na uzyskanej w ten sposób puli jednoniciowego RNA przeprowadzana jest odwrotna transkrypcja, w celu uzyskania biblioteki hybryd DNA-RNA. Odwrotna transkryptaza wydłuża starter komplementarny do stałej sekwencji obecnej na końcu 3' RNA. Użycie enzymu z usuniętą aktywnością rybonukleazy H powoduje, że matrycowe RNA nie jest degradowane, co pozwala na powstanie hybrydy składającej się z w pełni komplementarnego RNA i DNA. Uzyskiwana jest w ten sposób biblioteka hybryd DNA-RNA, gdyż wyjściowa matryca RNA składa się z heterogennych pod względem sekwencji (w centralnej części) cząsteczek. Skuteczność opracowanej modyfikacji metody SELEX potwierdzono z wykorzystaniem palca cynkowego Zf-QQR jako ligandu wiążącego hybrydę DNA-RNA. Zf-QQR jest uzyskanym w wyniku inżynierii palcem cynkowym, który wiąże sekwencję 5'-GGGGAAGAA-3' w nici DNA hybrydy DNA-RNA (Shi i Berg. Specific DNA-RNA hybrid binding by zinc finger proteins. 1995. Science, vol. 268). Do niniejszego przykładu użyto fuzję Zf-QQR z domeną GST (ang. Glutathione S-transferase). Przykładowe realizacje wynalazku przedstawiono na rysunku, na którym: Fig. 1 przedstawia schemat reprezentujący poszczególne etapy jednej rundy zmodyfikowanej procedury SELEX według wynalazku, Fig. 2 prezentuje sekwencje oligonukleotydowych matryc DNA służących do otrzymywania jednoniciowego RNA w procesie transkrypcji in vitro przy użyciu polimerazy RNA bakteriofaga T7, sekwencja oznaczona literą A nie zawiera miejsca wiązania dla palca cynkowego Zf-QQR i posiada unikalne miejsce trawienia dla enzymu restrykcyjnego XhoI, sekwencja oznaczona literą B zawiera sekwencję wiązania dla palca cynkowego Zf-QQR., sekwencja oznaczona jako 9N, w miejscu wiązania przez palec cynkowy zawiera dziewięcionukleotydowy region zdegenerowany (pojedynczy zdegenerowany nukleotyd oznaczono N ), Fig. 3 ilustruje sekwencje starterów 1 i 2 DNA stosowanych do amplifikacji dwuniciowego DNA w reakcji PCR, starter 2 był również stosowany w reakcji odwrotnej transkrypcji, Fig. 4 przedstawia rozdział fragmentów DNA przeprowadzony w 15% denaturującym żelu poliakrylamidowym zawierającym 6 M mocznik, koniec 5 nici DNA o długości 55 nukleotydów oraz startera 2 wyznakowano radioaktywnie izotopem fosforu 33, opis poszczególnych torów w żelu: Tor 1: 0,5 mola wyznakowanego radioaktywnie izotopem fosforu 33 startera 2, Tor 2: 0,25 mola produktu odwrotnej transkrypcji, Tor 3: 0,25 mola oligonukleotydu DNA o długości 55 nukleotydów, Fig. 5. prezentuje rozdział fragmentów DNA przeprowadzony w 15% natywnym żelu poliakrylamidowym, koniec 5 nici DNA oligonukleotydu o długości 55 oraz startera 2 wyznakowano radioaktywnie izotopem fosforu 33, opis poszczególnych torów w żelu:tor 1: 0,5 mola wyznakowanego radioaktywnie izotopem fosforu 33 startera 2, Tor 2: 0,25 mola produktu odwrotnej transkrypcji, Tor 3: 0,25 mola produktu odwrotnej transkrypcji trawione 5 jednostkami rybonukleazy H, Tor 4: 0,25 mola produktu odwrotnej transkrypcji trawione 1 jednostką rybonukleazy H, Tor 5: 0,25 mola oligonukleotydu DNA o długości 55 nukleotydów, Fig. 6 ilustruje sekwencje starterów wykorzystywanych do przygotowania konstruktu DNA fuzji genu kodującego domenę GST z genem kodującym palec cynkowy Zf-QQR, Fig. 7 przedstawia sekwencje genu kodującego fuzję domeny GST z palcem cynkowym Zf-QQR, Fig. 8. prezentuje wykres słupkowy ilustrujący zmianę proporcji pomiędzy dwuniciowym DNA zawierającym sekwencję miejsca wiązania dla palec cynkowy Zf-QQR (A), a niezawierającym sekwencji wiązanej przez Zf-QQR (B) w kolejnych rundach procedury SELEX ( O oznacza materiał wyjściowy mieszaninę hybrydy A z B w stosunku 1:10000, I-V numery kolejnych rund), Fig. 9 przedstawia listę 40 sekwencji uzyskanych po zsekwencjonowaniu DNA uzyskanego na matrycy hybrydy DNA-RNA po zakończeniu pięciu rund zmodyfikowanej procedury SELEX przeprowadzonej na ligandzie palcu cynkowym Zf-QQR i sekwencji zawierającej 9-nukleotydowy rejon zdegenerowany i uzyskane sekwencje regionu zmiennego, Fig. 10. prezentuje logo sekwencyjne uzyskane na podstawie 40 sekwencji przy użyciu programu WebLogo, Fig. 11 ilustruje sekwencje hybryd DNA-RNA wykorzystywanych do oznaczania stałej KD dla palca cynkowego Zf-QQR, gdzie fig. 11a to hybryda z miejscem opisywanym w literaturze, a fig 11b, to Hybryda z sekwencją konsensusową po 5 rundach SELEX, a
4 PL 222 513 B1 Fig. 12 to wykres zależności ilości, wyrażanej w procentach, zatrzymywanego na filtrze nitrocelulozowym wyznakowanego radioaktywnie fosforem 33 substratu od stężenia palca cynkowego Zf-QQR w mieszaninie reakcyjnej. P r z y k ł a d 1 Przygotowanie substratu hybrydy DNA-RNA Zsyntetyzowano trzy jednoniciowe DNA o długości 78 nukleotydów (fig. 2). Oligonukleotydy posłużyły jako matryca do utworzenia dwuniciowego DNA przy użyciu techniki PCR. Reakcję prowadzono w 50 l, w buforze od producenta, z końcowym stężeniem 200 M dntp mix, po 10 moli każdego startera 1 i 2 (fig. 3), ok. 0,1 mola matrycy i 1 jednostką Phusion polimerazy (New England Biolabs). Warunki reakcji: wstępna denaturacja 98 C 1 min, następnie 15 cykli po 15 s denaturacji w 98 C, 15 s renaturacji w temp. 72 C (co 1 cykl obniżana temperatura renaturacji o 1 C aż do 58 C) i 2 s wydłużania w 72 C, po czym 10 cykli po 15 s denaturacji w 98 C, 15 s renaturacji w temp. 58 C i 2 s wydłużania w 72 C. Mieszaninę reakcyjną ekstrahowano fenolem i fazę wodną precypitowano przy użyciu 0,5 M octanu sodu ph 4,5 oraz 64% etanolu (stężenia końcowe) w -20 C przez 30 min. Następnie próbkę wirowano przez 30 min 20000 g w 4 C, płukano 500 l 70% etanolu i ponownie wirowano przez 5 min 20000g w 4 C. Osad suszono i zawieszano w wodzie. Jednoniciowe RNA uzyskiwano w reakcji transkrypcji wykorzystując obecność sekwencji promotora dla polimerazy RNA bakteriofaga T7 w dwuniciowym DNA matrycowym przy użyciu zestawu do transkrypcji MEGAshortscript T7 (Ambion). Reakcję prowadzono w 10 l, w buforze od producenta, z końcowym stężeniem 7,5 mm NTP mix, 200 500 ng DNA i 0,5 l mieszaniny enzymów przez 8 godz. w 37 C. Rozdział produktów po transkrypcji przeprowadzono w 15% denaturującym żelu poliakrylamidowym zawierającym 6 M mocznik i w buforze TBE (0,1 M Tris ph 8.3, 90 mm kwasu borowego oraz 2 mm EDTA). Po zakończeniu rozdziału żel inkubowano 2 min w roztworze bromku etydyny o końcowym stężeniu 0,5 g/ml. Prążki uwidaczniano w świetle UV. Wycinano prążek odpowiadający oligonukleotydowi o długości 55 nukleotydów. Wycięte fragmenty żelu umieszczano w probówce typu eppendorf i rozdrabniano. Elucję RNA z żelu prowadzono w 4 C, przez noc z wytrząsaniem, po dodaniu 500 l 2 M roztworu octanu amonu ph 5,3 i 1 mm EDTA. Supernatant oddzielano od fragmentów żelu przy użyciu kolumienek Costar Spin X (Corning Life Sciences) i wirowania w temp. pokojowej 1 min 20000 g. Następnie próbkę wtrącano i suszono (opis jak wyżej). Hybrydę DNA-RNA otrzymywano na matrycy jednoniciowego RNA przy użyciu odwrotnej transkryptazy z usuniętą aktywnością rybonukleazy H. 200 moli startera 2 (fig. 3) i 200 moli jednoniciowego RNA inkubowano 2 min w 70 C, a następnie 2 min na lodzie. Tak przygotowaną matrycę poddawano odwrotnej transkrypcji. Reakcję prowadzono w 40 pl, w buforze od producenta, z końcowym stężeniem 1 mm dntp mix, 200 moli matrycy z starterem, 40 jednostek RiboLock (Fermentas) i 400 jednostek RevertAid H Minus Reverse Transcriptase (Fermentas) przez 2 godz. w 42 C. Mieszaninę reakcyjną odczyszczano od buforu oraz dntp przy użyciu złoża G-25 (Sigma Aldrich). W celu potwierdzenia, że opracowany protokół prowadzi do uzyskania hybrydy DNA-RNA wykonano odwrotną transkrypcję (opis jak wyżej) przy użyciu wyznakowanego radioaktywnie izotopem fosforu 33 startera 2. Syntezę właściwej wielkości DNA (spodziewana długość to 55 nukleotydów) potwierdzono na podstawie porównania wielkości uzyskanego DNA i oligonukleotydu kontrolnego o wielkości 55 nukleotydów. Rozdział próbek prowadzono w 15% denaturującym żelu poliakrylamidowym zawierającym 6 M mocznik w buforze TBE (fig. 4). Prawidłowe utworzenie hybrydy DNA-RNA potwierdzono prowadząc rozdział produktu odwrotnej transkrypcji, produktów trawienia uzyskanej hybrydy DNA-RNA przez rybonukleazę H oraz oligonukleotydu kontrolnego o wielkości 55 nukleotydów w 15% natywnym żelu poliakrylamidowym w buforze TBE (fig. 5). Trawienie nici RNA hybrydy DNA-RNA prowadzono w 10 l w buforze od producenta, 1 i 5 jednostek rybonukleazy H (Fermentas) przez 30 min w 37 C. P r z y k ł a d 2 Klonowanie, ekspresja i oczyszczanie białka fuzji GST z palcem cynkowym Zf-QQR W celu uzyskania fuzji palca cynkowego z domeną GST, gen kodujący Zf-QQR wklonowano do wektora ekspresyjnego pgex-4t-1 (Amersham). Zamówiono syntezę genu kodującego palec cynkowy Zf-QQR z firmy Epoch Life Sciences na podstawie sekwencji aminokwasowej z artykułu Shi Y., Berg JM. Specific DNA-RNA hybrid binding proteins. Science. 1995. Vol. 268, 282 284). DNA kodujące Zf-QQR amplifikowano przy użyciu techniki PCR. Reakcję prowadzono w 50 l, w buforze od producenta, z końcowym stężeniem 200 mm dntp mix, po 50 moli każdego startera ZFf i ZFr (fig. 6), ok. 0,1 g matrycy i 1 jednostką Phusion polimerazy (New England Biolabs). Warunki reakcji:
PL 222 513 B1 5 wstępna denaturacja 98 C 1 min, następnie 25 cykli po 15 s denaturacji w 98 C, 15 s renaturacji w temp. 60 C i 1 min wydłużania w 72 C. Mieszaninę reakcyjną ekstrahowano fenolem i precypitowano (opis jak wyżej). DNA kodujące palec cynkowy Zf-QQR oraz DNA wektora pgex-4t-1 zostało strawione enzymami restrykcyjnymi Smal i XhoI (enzymy pochodziły z firmy Fermentas). Reakcje trawienia przy użyciu Smal prowadzono w buforze IX Yellow zgodnie z zaleceniami producenta, 1 jednostkę enzymu na 1 g DNA przez 1 godz. w 30 C. Po tym czasie dodawano buforu do końcowego stężenia w reakcji 2X Yellow, 1 jednostkę enzymu Xhol na 1 g DNA przez 1 godz. w 37 C. Mieszaninę reakcyjną rozdzielano w 0,7% żelu agarozowym w buforze TAE (40 mm Tris-base, 18,8 mm kwas octowy, 1 mm EDTA) i fragmenty odpowiadające oczekiwanym wielkościom reizolowano z żelu przy użyciu zestawu do reizolacji z żelu agarozowego (Gel out, A&A Biotechnology). Następnie 50 ng reizolowanego DNA kodującego palec cynkowy Zf-QQR oraz 25 ng przeciętego wektora pgex-4t-1 poddano działaniu ligazy DNA bakteriofaga T4 (Fermentas, reakcja prowadzona zgodnie z zaleceniami producenta w dostarczonym buforze) w temperaturze pokojowej przez 1 godz. Ligazę dezaktywowano termicznie przez inkubację w 75 C przez 10 min. Następnie używano mieszaniny ligacyjnej do transformacji. 100 l wcześniej przygotowanych bakterii kompetentnych (szczep Escherichia coli Top10: F mcra (mrr-hsdrms-mcrbc) φ801acz M15 lacx74 deor reca1 arad139 (araa-leu)7697 galk PSL enda1 nupg [Invitrogen], metody przygotowania komórek kompetentnych za Sambrook J., Firtsh E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory manual, 2nd edition. 1989. Cold Spring Harbor, N. Y. Cold Spring Harbor laboratory Press rozmrażano w lodzie, dodawano do nich DNA plazmidowy (10 50 ng na 50 l komórek bakteryjnych) i pozostawiono w lodzie na 30 min. Po tym czasie, bakterie poddano szokowi termicznemu inkubując w temp. 42 C przez 1 min, a następnie schładzano w lodzie przez 2 min. Komórki inkubowano w temp. 37 C po dodaniu 800 l płynnego LB (bakto-trypton 1%, ekstrakt drożdżowy 0,5%, NaCl 1%) przez 1 godz. i wysiewano na płytki ze stałym LB (skład jak wyżej, dodatkowo 1,5% (w/v) agar-agar) uzupełnionym końcowym stężeniem 100 g/ml ampicyliny, inkubowano przez noc w 37 C. Selekcja odpowiednich transformantów zawierających pożądane rekombinanty bazowała na analizie mapy restrykcyjnej, a następnie sekwencjonowano próbki w celu potwierdzenia poprawności sekwencyjnej konstruktu. Plazmid pgex-4t-1 z genem kodującym palec cynkowy Zf-QQR transformowano do szczepu E. coli BL21(DE3): F ompt gal dcm lon hsds B (r B m B ) (DE3 [laci lacuv5-t7 gene 1 ind1 sam7 nin5]) [Promega]. Kilkoma koloniami transformantów zaszczepiano 25 ml płynnej pożywki LB, uzupełnioną 100 g/ml ampicyliną i 1% glukozą i inkubowano przez noc w temp. 37 C. Następnie zaszczepiano w stosunku 1:50, 500 ml płynnego LB uzupełnionego 100 g/ml ampicyliną, inkubowano z wytrząsaniem w temp. 37 C przez 2 godz. Po tym czasie dodawano IPTG (końcowe stężenie 1 mm) i inkubowano z wytrząsaniem w 25 C przez 5 godz. Po indukcji hodowle wirowano przy 4000 rpm w temp. 4 C przez 10 min. płukano 2 ml STE, wirowano 10000 g 10 min i osad zamrażano w -20 C. Uzyskany osad z hodowli, zawieszano w 35 ml buforu PBS (140 mm NaCl, 2,7 mm KC1, 10 mm Na 2 HPO 4, 1,8 mm KH 2 PO 4, ph 7,3, 5 mm DTT), a następnie komórki bakteryjne dezintegrowano za pomocą jednokrotnego przepuszczenia przez prasę Frencha (Constant Systems LTD) przy nadciśnieniu 1360 atmosfer. Lizaty klarowano przez odwirowanie nierozpuszczalnego peletu w ultrawirówce przy 20000 g w temp. 4 C przez 20 min. 1000 l złoża Gluthathione Sepharose (GE Healthcare) równoważono buforem PBS w probówce typu falkon, po czym wirowano 30 s, 1000 g, 4 C i usuwano supernatant. Do tak przygotowanego złoża, dodawano supernatant pochodzący z odwirowanego lizatu po dezintegracji i inkubowano z łagodnym mieszaniem w temp. pokojowej przez 30 60 min. Po tym czasie wirowano 5 min, 1000 g, w temp. pokojowej i usuwano supernatant, a złoże ze związanym białkiem płukano trzy razy po 5 ml buforu PBS, za każdym razem wirując 5 min przy 1000 g w temp. pokojowej i usuwając supernatant. Następnym etapem była elucja, którą powtarzano dwa razy, po 200 pl buforu E (50 mm Tris-HCl, 10 mm zredukowanego glutationu ph 8,0, 5 mm DTT), inkubacja 10 min w temp. pokojowej. Po każdej inkubacji wirowano 2 min przy 1000 g w temp. pokojowej i przenoszono supernatant do probówki. Bufor elucyjny zmieniano na bufor do przechowywania (25 mm Tris ph 8,0, 100 mm KCl, 10% glicerol, 2 mm DTT) przy użyciu złoża G-25 (Sigma Aldrich). Tak przygotowane białko przechowywano w temp -20 C.
6 PL 222 513 B1 P r z y k ł a d 3 Wiązanie białka z hybrydą DNA-RNA, odpłukanie niezwiązanych cząsteczek i elucja kompleksu białko-hybryda DNA-RNA ze złoża Reakcję wiązania się palca cynkowego Zf-QQR z hybrydą DNA-RNA przeprowadzano w 40 l i zawierała: 200 pmole hybrydy DNA-RNA, 1 mol fuzji GST z palcem cynkowym Zf-QQR, 25 mm Tris ph 8,0, 100 mm KCl, 20 M ZnSO 4, 2 mm DTT. Reakcję prowadzono w temp. pokojowej przez 30 min. Po tym czasie mieszaninę dodawano do 7,5 l złoża Gluthathione Sepharose i inkubowano przez 30 min w Thermomixer compact (Eppendorf), w 22 C, wytrząsając 1400 rpm. W następnym etapie płukano złoże trzy razy po 100 l buforu P (25 mm Tris ph 8,0, 100 mm KCl, 20 M ZnSO 4, 2 mm DTT), za każdym razem wirując 2 min przy 1000 g w temp. pokojowej i usuwając supernatant. Następnym etapem była elucja, którą powtarzano dwa razy, po 30 l buforu E z inkubacją 10 min w temp. pokojowej. Po każdej inkubacji wirowano 2 min przy 1000 g w temp. pokojowej i przenoszono supernatant do probówki. 5 l eluatu zawierającego fuzję GST z palcem cynkowym ze związaną hybrydą DNA-RNA poddawano reakcji amplifikacji przy użyciu techniki PCR, transkrypcji i odwrotnej transkrypcji (opis jak wyżej). Uzyskana w ten sposób hybryda stanowiła materiał wyjściowy do kolejnej rundy SELEX. P r z y k ł a d 4 Kontrola SELEX Wykonano kontrolę opracowanej modyfikacji metody SELEX na mieszaninie hybrydy DNA-RNA zawierającej miejsce wiązania dla palca cynkowego Zf-QQR (hybryda A, powstaje na matrycy A, fig. 2) i niezawierającej takiego miejsca, w zamian wprowadzono sekwencję trawienie dla XhoI (hybryda B, powstaje na matrycy B, fig. 2). Przeprowadzono pięć rund SELEX na puli sekwencji kontrolnych składających się z mieszaniny, w stosunku 1:10000 hybrydy A do B. W celu rozróżnienia obu sekwencji, 100 ng DNA powstałego w wyniku amplifikacji przy użyciu techniki PCR eluatu po każdej rundzie trawiono 2 jednostkami enzymu Xhol przez 16 godz. w 37 C. Produkty trawienia rozdzielano w 15% natywnym żelu poliakrylamidowym w buforze TBE. Po zakończeniu rozdziału żel inkubowano 2 min w roztworze bromku etydyny o końcowym stężeniu 0,5 g/ml. Prążki uwidaczniano w świetle UV przy użyciu zestawu do cyfrowej archiwizacji zdjęć Fluoro-S Multilmager (BioRad). Zmierzono intensywność prążków odpowiadających wielkościom niestrawionego DNA (78 par zasad) oraz produktów trawienia (55 i 23 par zasad) przy użyciu programu Quantity One (BioRad) i obliczono wzajemne proporcje DNA powstającego na matrycy hybrydy DNA-RNA po każdej rundzie (fig. 8). Po pięciu rundach z wykorzystaniem fuzji GST i palca cynkowego Zf-QQR, proporcje DNA z miejscem wiązania i bez takiego miejsca zmieniły się do 1:1,7. Oznacza to, że w wyniku zastosowania SELEX pulę sekwencji kontrolnych wzbogacono 8500 razy w sekwencję specyficznie wiązaną przez Zf-QQR. P r z y k ł a d 5 SELEX na bibliotece hybryd DNA-RNA W następnym etapie, wykorzystano bibliotekę hybryd DNA-RNA zawierającą losową sekwencję centralną (bibliotekę generowano na matrycy 9N, fig. 2) do przeprowadzenia procedury SELEX i ustalenia rzeczywistej preferencji sekwencyjnej palca cynkowego Zf-QQR. 500 ng DNA produktu PCR uzyskanego na matrycy eluatu po piątej rundzie SELEX trawiono 5 jednostkami enzymu Xbal (Fermentas) w buforze od producenta przez 3 godz. w 37 C. Produkty trawienia rozdzielano w 15% natywnym żelu poliakrylamidowym w buforze TBE. Po zakończeniu rozdziału żel inkubowano 2 min w roztworze bromku etydyny o końcowym stężeniu 0,5 g/ml. Prążki uwidaczniano w świetle UV, wycinano prążek odpowiadający fragmentowi o długości 43 par zasad i izolowano z żelu (opis jak wyżej). W celu uzyskania konkatamerów, 100 ng fragmentów DNA poddano działaniu ligazy DNA bakteriofaga T4 (Fermentas) w buforze od producenta w temperaturze pokojowej przez 3 godz. Ligazę dezaktywowano termicznie przez inkubację w 75 C przez 10 min. 200 ng DNA plazmidowe wektora puc18 (Fermentas) trawiono enzymem Xbal w buforze od producenta przez 3 godz. w 37 C. Mieszaninę reakcyjną rozdzielano w 0,7% żelu agarozowym w buforze TAE i fragmenty odpowiadające oczekiwanym wielkościom reizolowano z żelu przy użyciu zestawu do reizolacji z żelu agarozowego (Gel out, A&A Biotechnology). Tak przygotowany wektor oraz konkatamery poddano działaniu ligazy DNA bakteriofaga T4 (opis jak wyżej) a następnie transformowano do 100 l wcześniej przygotowanych bakterii kompetentnych E. coli Top 10 (opis jak wyżej). Komórki wysiewano na płytki ze stałym LB (skład jak wyżej, dodatkowo 1,5% (w/v) agar-agar) uzupełnionym końcowym stężeniem 100 g/ml ampicyliny, 40 g/ml X-gal, ImM IPTG i inkubowano przez noc w 37 C. Selekcja odpowiednich transformantów zawierających pożądane rekombinanty bazowała na analizie koloru kolonii, następnie przeprowadzono
PL 222 513 B1 7 analizę sekwencyjną 12 klonów, które w sumie zawierały 40 fragmentów uzyskanych po procedurze SELEX (fig. 9). Na tej podstawie ustalono, że Zf-QQR wiąże sekwencję konsensusową 5'-GGNCGGNGGG-3', logo sekwencyjne (fig. 10) uzyskano przy użyciu programu WebLogo (Crooks GE, Hon G, Chandonia JM, Brenner SE WebLogo: A sequence logo generator, Genome Research, 14:1188 1190, (2004); Schneider TD, Stephens RM. 1990. Sequence Logos: A New Way to Display Consensus Sequences. Nucleic Acids Res. 18:6097 6100). P r z y k ł a d 6 Wiązanie palca cynkowego Zf-QQR do sekwencji konsensusowej W celu potwierdzenia, że uzyskana po pięciu rundach SELEX sekwencja konsensusową jest wiązana przez palec cynkowy, wykonano pomiar stałej K D przy wykorzystaniu metody wiązania na filtrze nitrocelulozowym. Wykonano pomiar dla substratu opisanego w literaturze i sekwencji konsensusowej (fig. 11) wyznakowanych radioaktywnie izotopem fosforu 33. Reakcja wiązania zawierała: 2 nm wyznakowanego substratu, 2 g poli dl-dc niespecyficznego kompetytora, 25 mm Tris ph 8,0, 100 mm KCl, 20 pm ZnSO 4 2 mm DTT. Mieszaninę inkubowano przez 30 min w temperaturze pokojowej, po czym niezwłocznie przesączano przez filtr nitrocelulozowy i płukano 8 objętościami mieszaniny reakcyjnej buforu 25 mm Tris ph 8,0, 100 mm KCl, 20 M ZnSO 4, 2 mm DTT. Pomiar intensywności zatrzymanego sygnału pochodzącego od radioaktywnie wyznakowanego substratu dokonywano na audioradiogramie filtru nitrocelulozowego przy użyciu skanera Typhoon Trio oraz oprogramowania ImageQuant TL. Stałe wiązania K D dla obydwu substratów są zbliżone, 188±38 nm dla hybrydy posiadającej miejsce wiązania opisane w literaturze oraz 155±32 nm dla sekwencji konsensusowej (fig. 12). Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób określania sekwencji preferowanych przez białko(a) lub jego(ich) domeny wiążące, które to białko lub domena wiążąca obejmuje palec cynkowy wiążący specyficznie sekwencje w hybrydach DNA-RNA, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy: a) kontaktowanie oczyszczonego białka lub jego domeny z mieszaniną substratów stanowiącą bibliotekę cząsteczek hybryd DNA-RNA zawierających zróżnicowane sekwencje w części centralnej, korzystnie randomizowany fragment 9 lub 10 nukleotydowy, oflankowane stałymi sekwencjami i umożliwienie testowanemu białku lub domenie na związanie się z sekwencją, do której ma powinowactwo; b) oddzielanie niezwiązanych hybryd DNA-RNA poprzez immobilizowanie białka lub jego domeny ze związaną hybrydą DNA-RNA na złożu, korzystnie agarozie z glutationem; c) usuwanie niezwiązanych hybryd; d) izolowanie rekombinowanego białka razem ze związanymi z nim hybrydami DNA-RNA, korzystnie poprzez dodanie buforu zawierającego glutation; e) amplifikowanie wyizolowanych hybryd za pomocą PCR, korzystnie RT-PCR, przy czym do amplifikacji używa się starterów komplementarnych do niezmiennych sekwencji znajdujących się na flankach randomizowanego regionu, a w trakcie reakcji PCR na jednym starterze dodawana jest sekwencja promotora polimerazy RNA do uzyskania dwuniciowego DNA do transkrypcji in vitro z wykorzystaniem polimerazy RNA; f) odwrotną transkrypcję z użyciem odwrotnej transkryptazy z usuniętą aktywnością rybonukleazy H oraz startera DNA komplementarnego do końca 3 matrycy RNA w celu uzyskania hybryd DNA-RNA, korzystnie do zawracania do etapu a). 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencja promotora obejmuje sekwencję promotora dla polimerazy RNA T7, a polimerazą RNA jest polimeraza RNA T7. 3. Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że białkiem lub jego domeną wiążącą jest białko rekombinowane lub domena rekombinowana, którą jest fuzja rybonukleazy HI oraz palca cynkowego. 4. Sposób według dowolnego z zastrz. 1 3, znamienny tym, że białkiem lub jego domeną wiążąca jest fuzja domeny palca cynkowego i domeny transferazy-s glutationowej (GST). 5. Sposób według dowolnego z zastrz. 1 4, znamienny tym, że palcem cynkowym jest Zf-QQR.
8 PL 222 513 B1 Rysunki
PL 222 513 B1 9
10 PL 222 513 B1
PL 222 513 B1 11
12 PL 222 513 B1
PL 222 513 B1 13
14 PL 222 513 B1 Departament Wydawnictw UPRP Cena 4,92 zł (w tym 23% VAT)