(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCTA/S94/11837

RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19)PL (11)178652 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 314590 (22) Data zgłoszenia: 25.10.1994 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 25.10.1994, PCTA/S94/11837 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: 01.06.1995, W095/14784, PCT Gazette nr 23/95 (51) IntCl6: C12N 15/82 C12N 15/53 A01H 1/00 (54)Zrekombinowana cząsteczka dwuniciowego DNA, ( 5 4 ) sposób wytwarzania genetycznie stransformowanych, odpornych na choroby roślin, oraz genetycznie stransformowana komórka roślinna ziemniaka lub pszenicy (30) Pierwszeństwo: 24.11.1993,US,08/161041 (73) Uprawniony z patentu: Monsanto Company, St.Louis, US (43) Zgłoszenie ogłoszono: 16.09.1996 BUP 19/96 (72) Twórcy wynalazku: Eilen B. Lawrence, Creve Coeur, US Elaine B. Levine, St.Louis, US Dilipkumar M. Shah, Chesterfield, US (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 31.05.2000 WUP 05/00 (74) Pełnomocnik: Płotczyk Leokadia, POLSERVICE PL 178652 B1 (57)1. Zrekombinowana cząsteczka dwuniciowego DNA, znam ienna tym, że obejmuje w kolejności zapewniającej działanie a ) promotor, który działa w komórkach roślinnych powodując wytwarzanie sekwencji R NA, przy czym rzeczony promotor wybiera się spośród promotorów FM V 35S 1 C am V 35S, b) strukturalną sekwencję kodującą, która koduje wytw arzaną oksydazę g lukozow ą Aspergillus, przy czym rzeczoną sekw encją struktu ralną D NA jest sekwencja o numerze identyfikacyjnym. 2,1 c) 3'-końcowy region nie ulegający translacji, który działa w komórkach roślinnych powodując dołączanie nukleotydów poliadenylo wych do końca 3' sekwencji RNA. 2. Sposób wytwarzania genetycznie stransformowanych, odpornych na choroby roślin, znam ienny tym, że obejmuje etapy a) wstawiania do genomu komórki roślinnej zrekombinowanej, dwuniciowej cząsteczki D N A, zawierającej (i) promotor, który działa w komórkach roślinnych powodując w ytwarzanie sekwencji R N A, przy czym rzeczony promotor wybiera się spośród promotorów FM V35S i CaM V35S, (ii) strukturalną sekwencję kodującą, która pow oduje wytwarzanie oksydazy glukozow ej A spergillu s, przy czym rzeczoną sekwencją strukturalną D N A jest sekwencja o numerze identyfikacyjnym. 2; i (iii) 3'-końcow y region nie ulegający translacji, który działa w rzeczonych komórkach roślinnych powodując dołączanie nukleotydów poliadenylowych do końca 3' sekwencji RNA b) otrzymywania stransformowanych komórek roślinnych, 1 c) regeneracji ze stransformowanych komórek roślinnych genetycznie stransformowanych roślin ziemniaka lub pszenicy, w których zachodzi ekspresja oksydazy glukozowej Aspergillus w ilości skutecznej w obniżaniu uszkodzeń spowodowanych infekcją patogenem bakteryjnym lub grzybowym. 3 G enetycznie stransform owana komórka roślinna ziem niaka lub pszenicy, zn am ien n a tym, że zawiera zrekom binow aną cząsteczkę dw uniciowego DNA, która obejmuje w kolejności zapewniającej działanie a) promotor, który działa w komórkach roślinnych powodując wytwarzanie sekwencji R NA, przy czym rzeczony promotor w ybiera się spośród promotorów FM V35S, CaM V35S, b) strukturalną sekwencję kodującą, która koduje w ytw arzaną oksydazę g\u kozow ąa spergillu s, przy czym rzeczoną sek w encją strukturalną DNA jest sekwencja o numerze identyfikacyjnym 2, 1 c) 3'-końcowy region nie ulegający translacji, który działa w komórkach roślinnych powodując dołączanie nukleotydów poliadenylowych do końca 3' sekwencji RNA.

Zrekombinowana cząsteczka dwuniciowego DNA, sposób wytwarzania genetycznie stransformowanych, odpornych na choroby roślin, oraz genetycznie stransformowana komórka roślinna ziemniaka lub pszenicy Zastrzeżenia patentowe 1. Zrekombinowana cząsteczka dwuniciowego DNA, znamienna tym, że obejmuje w kolejności zapewniającej działanie: a) promotor, który działa w komórkach roślinnych powodując wytwarzanie sekwencji RNA, przy czym rzeczony promotor wybiera się spośród promotorów FMV35S i CaMV35S; b) strukturalną sekwencję kodującą, która koduje wytwarzaną oksydazę glukozową Aspergillus, przy czym rzeczoną sekwencją strukturalną DNA jest sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 2; i c) 3'-końcowy region nie ulegający translacji, który działa w komórkach roślinnych powodując dołączanie nukleotydów poliadenylowych do końca 3' sekwencji RNA. 2. Sposób wytwarzania genetycznie stransformowanych, odpornych na choroby roślin, znamienny tym, że obejmuje etapy: a) wstawiania do genomu komórki roślinnej zrekombinowanej, dwuniciowej cząsteczki DNA, zawierającej: (i) promotor, który działa w komórkach roślinnych powodując wytwarzanie sekwencji RNA, przy czym rzeczony promotor wybiera się spośród promotorów FMV35S i CaMV35S; (ii) strukturalną sekwencję kodującą, która powoduje wytwarzanie oksydazy glukozowej Aspergillus, przy czym rzeczoną sekwencją strukturalną DNA jest sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 2; i (iii) 3'-końcowy region nie ulegający translacji, który działa w rzeczonych komórkach roślinnych powodując dołączanie nukleotydów poliadenylowych do końca 3' sekwencji RNA. b) otrzymywania stransformowanych komórek roślinnych; i c) regeneracji ze stransformowanych komórek roślinnych genetycznie stransformowanych roślin ziemniaka lub pszenicy, w których zachodzi ekspresja oksydazy glukozowej Aspergillus w ilości skutecznej w obniżaniu uszkodzeń spowodowanych infekcją patogenem bakteryjnym lub grzybowym. 3. Genetycznie stransformowana komórka roślinna ziemniaka lub pszenicy, znamienna tym, że zawiera zrekombinowaną cząsteczkę dwuniciowego DNA, która obejmuje w kolejności zapewniającej działanie: a) promotor, który działa w komórkach roślinnych powodując wytwarzanie sekwencji RNA, przy czym rzeczony promotor wybiera się spośród promotorów FMV35S i CaMV35S; b) strukturalną sekwencję kodującą, która koduje wytwarzaną oksydazę glukozową Aspergillus, przy czym rzeczoną sekwencją strukturalną DNA jest sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 2; i c) 3'-końcowy region nie ulegający translacji, który działa w komórkach roślinnych powodując dołączanie nukleotydów poliadenylowych do końca 3' sekwencji RNA. * * * Wynalazek ten dotyczy metody zwalczania patogenów roślinnych przez zastosowanie białka, które dostarcza się przez genetyczną modyfikację rośliny, w wyniku której wytwarza ona to białko, oraz genów i roślin użytecznych w tej metodzie.

178 652 3 Podstawa wynalazku Dobrze wiadomo, że enzymatyczne działanie oksydazy glukozowej ma charakter przeciwbakteryjny. W obecności tlenu oksydaza glukozowa katalizuje utlenianie glukozy do δ-glukonolaktonu i nadtlenku wodoru. Działanie przeciwbakteryjne jest wynikiem zarówno utleniających właściwości nadtlenku wodoru, jak również obecności δ-glukonolaktonu, który jest znanym inhibitorem glikozylotransferaz. Przeciwbakteryjne działanie produktów tego enzymu spowodowało jego szerokie zastosowanie w przemyśle spożywczym, gdzie jest on uważany za związek GRAS [powszechnie uznawany jako bezpieczny]. Jako taką, oksydazę glukozową stosuje się do zapobiegania bakteryjnemu psuciu gotowej żywności. W medycynie stosuje się ją jako enzymatyczny środek bakteriobójczy jako część preparatu do stosowania w materiałach opatrunkowych na rany, wykałaczkach dentystycznych, niciach dentystycznych i miniaturowych szczoteczkach do zębów. Uważa się również, że stosowanie oksydazy glukozowej jest sposobem zwalczania kamienia nazębnego. Ostatnie doniesienia wykazały, że oksydaza glukozowa zaangażowana jest, jako część mechanizmu biokontroli wykorzystywanej przez Penicillium dangeari, w zwalczaniu patogennego dla roślin grzyba Verticillium dahliae [Kim i in., 1988, 1990], Jednakże sądzono, że użycie oksydazy glukozowej jako środka dla roślin do ich ochrony przed organizmami patogennymi ma małe możliwości z powodu charakteru działania enzymatycznego. Po pierwsze, w roślinach jest mało obecnej glukozy. Enzym mógłby mieć niewystarczającą ilość substratu do wytwarzania dostatecznej ilości nadtlenku wodoru i/lub 5-glukonolaktonu do zwalczenia ataku patogenów. Po drugie, można oczekiwać, że obecność takiego enzymu, zużywającego glukozę i wytwarzającego nawet małe ilości nadtlenku wodoru, w komórce roślinnej, będzie szkodliwa dla żywotności komórki. Można spodziewać się, że rośliny transgeniczne, w których zachodzi ekspresja oksydazy glukozowej, nie będą rozwijać się normalnie, albo jako zregenerowane rośliny, albo w następnych pokoleniach. Przedmiotem niniejszego wynalazku jest dostarczenie oksydazy glukozowej, której ekspresję można bezpiecznie prowadzić w komórkach roślinnych i zapewnienie tym komórkom odporności na choroby. Dalszym przedmiotem niniejszego wynalazku jest dostarczenie metody transformowania roślin, tak aby zachodziła w nich ekspresja oksydazy glukozowej, której ekspresję można bezpiecznie prowadzić w roślinach, i zapewnienie tym roślinom odporności na choroby. Podsumowanie wynalazku Nieoczekiwanie stwierdzono, że gen oksydazy glukozowej z Aspergillus niger można stosować do transformowania roślin, które są normalne pod względem rozwoju i oporne na atak patogenów. Dlatego też, przedmiotem niniejszego wynalazku jest dostarczenie użytecznych do wprowadzania do komórek roślinnych konstrukcji genetycznych zawierających gen oksydazy glukozowej Aspergillus (AGO). Innym przedmiotem niniejszego wynalazku jest dostarczenie stransformowanych, opornych na patogeny roślin zawierających taki materiał genetyczny. Dodatkowo, rośliny można także transformować, aby zachodziła w nich koekspresja innych białek przeciwgrzybowych lub białek owadobójczych, na przykład stosując geny Bacillus thuringiensis (B.t.). Przykłady roślin tak stransformowanych, aby zachodziła w nich ekspresja genów B.t. ujawniono w publikacji europejskiego opisu patentowego numer 0 385 962, która odpowiada opisowi patentowemu Stanów Zjednoczonych Ameryki numer kolejny 07/476 661, złożonemu 12 lutego 1990 r. [Fischhoff i in.], włączonej do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy. Gen B.t. można wprowadzić do rośliny według niniejszego wynalazku przez jednoczesną transformację, kolejne transformacje lub przez krzyżowanie. Zgodnie z aspektem wynalazku, dostarcza się zrekombinowaną, dwuniciową cząsteczkę DNA, zawierającą w kolejności zdolnej do działania: a) promotor, który działa w komórkach roślinnych powodując wytwarzanie sekwencji RNA; i b) strukturalną sekwencję kodującą, która koduje wytwarzaną AGO;

4 178 652 c) 3'-końcowy region nie ulegający translacji, który działa w komórkach roślinnych powodując dołączanie nukleotydów poliadenylowych do końca 3' sekwencji RNA. Zgodnie z innym aspektem wynalazku, dostarcza się metodę wytwarzania genetycznie stransformowanych roślin, w których zachodzi ekspresja przeciwpatogennych ilości AGO, obejmują etapy: a) wstawiania do genomu komórki roślinnej zrekombinowanej, dwuniciowej cząsteczki DNA, zawierającej: (i) promotor, który działa w komórkach roślinnych powodując wytwarzanie sekwencji RNA; (ii) strukturalną sekwencję kodującą, która koduje wytwarzaną AGO (iii) 3'-końcowy region nie ulegający translacji, który działa w rzeczonych komórkach roślinnych powodując dołączanie nukleotydów poliadenylowych do końca 3' sekwencji RNA. b) otrzymywania stransformowanych komórek roślinnych; i c) regeneracji ze stransformowanych komórek roślinnych genetycznie stransformowanych roślin, w których zachodzi ekspresja hamującej ilości AGO. Dostarcza się również, zgodnie z innym aspektem niniejszego wynalazku, stransformowane rośliny, które zawierają DNA złożony z wymienionych powyżej elementów (i), (ii) i (iii). W znaczeniu tu stosowanym, termin oksydaza glukozowa Aspergillus lub AGO oznacza oksydazę glukozową naturalnie wytwarzaną przez Aspergillus sp., bądź posiadającą 80% homologii, korzystnie 90%, do takiego enzymu, na przykład enzymu kodowanego przez sekwencję o numerze identyfikacyjnym: 1. W znaczeniu tu stosowanym, termin zwalczanie uszkodzeń przez mikroorganizmy oznacza powodowanie zmniejszenia uszkodzeń roślin uprawnych spowodowanych infekcją patogenem bakteryjnym lub grzybowym. W znaczeniu tu stosowanym, termin strukturalna sekwencja kodująca oznacza sekwencję DNA kodującą polipeptyd, który może być wytwarzany przez komórkę po transkrypcji DNA na RNA, a następnie translację pożądanego polipeptydu. W znaczeniu tu stosowanym, termin locus roślinne oznacza obszar bezpośrednio otaczający roślinę i obejmujący roślinę i jej strefę korzeniową. Szczegółowy opis wynalazku Jedno rozwiązanie niniejszego wynalazku obejmuje białko wyizolowane z Aspergillus niger. Białko to, oznaczone AGO, oczyszczono do homogenności. Hamuje ono wzrost ważnych z rolniczego punktu widzenia patogenów grzybowych, włącznie z Verticillum dahliae, jednym z najbardziej rozpowszechnionych i wyrządzających największe szkody patogenów roślin powodującym chorobę wielu roślin, Phytophthora infestans (Pi), patogenem będącym przyczyną zarazy ziemniaczanej ziemniaków i pomidorów, Botryis cinera (BC), źródłem szarej pleśni na różnych owocach i warzywach, Septoria nodorum (Sn), czynnikiem przyczynowym plamistości łusek pszenicy, Pseudocercosporella herpotrichoides (Ph), czynnikiem przyczynowym łamliwości liści pszenicy, i Gaeumannomyces gramininis var tritici (Ggt), czynnikiem przyczynowym zgorzeli podstawy źdźbła zbóż, w ilości tak małej, jak 50 ng w warunkach oznaczenia. Stwierdzono również, że hamuje ono Erwinia carotovora, czynnik przyczynowy mokrej zgnilizny ziemniaków, choroby ziemniaków występującej po zbiorze. W oparciu o produkty aktywności enzymatycznej tego białka, δ-glukonolakton i nadtlenek wodoru, oczekuje się, że jest ono zdolne do zwalczania wielu innych organizmów patogennych dla roślin. Każdy z tych produktów ubocznych jest toksyczny dla takich organizmów. Metodą według niniejszego wynalazku można chronić wiele gatunków roślin. Na przykład, niniejszymi metodami można ochraniać przed patogenami roślin wiele owoców i warzyw, takich jak truskawki, ziemniaki i pomidory. Różne gatunki Phytophtora są patogenne dla wielu innych roślin, takich jak drzewa owocowe lub roślin darniowych, a zatem również te rośliny można ochraniać metodami według niniejszego wynalazku. Ponadto, niniejszymi metodami można ochraniać rośliny pszenicy i jęczmienia przed Ggt, Sn i Ph.

178 652 5 Jak stwierdzono powyżej, białka o aktywności przeciw mikroorganizmom według niniejszego wynalazku można stosować łącznie z innymi białkami przeciwgrzybowymi, tak aby zapewnić szerokie spektrum aktywności, tj. zwalczanie dodatkowych patogenów i/lub zapewnić wiele sposobów działania dla hamowania tego samego patogenu grzybowego. Źródłami takich innych białek przeciwgrzybowych mogą być mikroorganizmy, tak jak białek według niniejszego wynalazku, lub m ogą być nimi rośliny. W literaturze donoszono o wielu takich genach przeciwgrzybowych. Chociaż AGO będzie działać chroniąc rośliny przed atakiem patogenów w obecności naturalnie występujących poziomów glukozy, może być pożądane dostarczenie inwertazy, która będzie powodować hydrolizę sacharozy, uwalniając zatem dodatkową glukozę, na którą może działać AGO. Inwertazą będzie korzystnie inwertaza ze ściany komórkowej, taka jak z drożdży (europejski opis patentowy numer 0 442 592, Willmitzer i in., 1991, także australijski opis patentowy numer AU 70898/91) lub enzym z wakuoli, taki jak z ziemniaków lub innych roślin. W tych dwóch przypadkach można użyć natywną sekwencję sygnałową; jednakże, może być korzystne odizolowanie inwertazy dokąd nie będzie potrzebna w przestrzeni pozakomórkowej lub nie wytwarzanie dokąd nie będzie potrzebna. Pierwszą możliwość można zrealizować przez użycie sekwencji sygnałowej, która będzie kierować enzym do przestrzeni pozakomórkowej. Jedną taką sekwencją sygnałową jest sekwencja sygnałowa inhibitora proteaz z ziemniaka (Keil i in., 1986; Nelson i in., 1980). W ograniczaniu ekspresji inwertazy do momentu aż jest ona potrzebna do wytwarzania glukozy jako substratu AGO mógłby być użyteczny promotor, który jest aktywny tylko w wyniku infekcji patogenem. Podczas przechowywania, gdy infekcja Erwinia może powodować utratę całych pojemników, bulwy ziemniaków będą naturalnie zawierać glukozę z rozkładu skrobi. Dlatego też, dla ochrony przed mokrą zgnilizną nie jest pożądane ani potrzebne włączanie genu inwertazy. OZNACZENIA SKUTECZNOŚCI BIOLOGICZNEJ IN VITRO Oznaczenia aktywności przeciwgrzybowej Oksydazę glukozw ą z Aspergillus niger można otrzymać z Sigma Chemical Co. (St. Louis, nr kat. G-7141). Użyto jej do testowania in vitro aktywności wobec kilku organizmów. Testy wobec Pi i Bc przeprowadzono w podłożu #303, przygotowanym w następujący sposób: jeden litr zawiera 1 gm gs04 7H20 ; 2 gkh2p 0 4,0,5 gnacl, 1 gc ac 03, 1 ml roztworu podstawowego ZnS04 7H20 o stężeniu 1 mg/ml, 1 ml roztworu podstawowego FeSO4 7H2O o stężeniu 1 mg/ml, 0,5 ml roztworu podstawowego FeEDTA o stężeniu 100 mm, 20 g Maltrin M -100,20 g kazeiny, 5 g ekstraktu drożdżowego, 5 g glukozy, 3,02 g Pipes, 10 mm, ph doprowadzono do 6,5 i wyjałowiono przez sączenie. Testy wobec Ggt przeprowadzono w dwukrotnie rozcieńczonym PDA (Difco). Testy wobec Ph przeprowadzono w CDAA. 1% podłoża przygotowano w następujący sposób: 35 g/litr bulionu Czapka Doxa (Difco), 1 g/litr proliny, 500 mg/litr asparaginy, 500 mg/litr cysteiny i 1 g/litr agaru autoklawowano w ciągu 23 minut i dodano wyjałowione przez sączenie witaminy (1 ppm tiaminy i 1 ppm biotyny). Bc i Pi testowano w oznaczeniu płynnym w płytkach 96-studzienkowych. Bc stosowano w ilości 5 x 102 zarodników na studzienkę i umożliwiano inkubację w temperaturze 20 C w ciągu 24-48 godzin. Pi zaszczepiano w ilości 5 x 103 zarodni na studzienkę i inkubowano w temperaturze 18 C w ciągu 24-48 godzin. Ocenę wzrostu przeprowadzano przez pomiar OD przy długości fali 595 nm. Wzrost Pi był w 90% hamowany przy tak niskich stężeniach, jak 3 x 10-5 IU/μl. Wzrost Bc był w 95% hamowany w stężeniu 0,001 IU/μl. Aktywność wobec Gaeumannomyces oceniano na płytkach ze stałym podłożem agarowym. Kawałki agaru o powierzchni około 0,5 cm2 mocno przerośnięte grzybem umieszczano w środku płytek z dwukrotnie rozcieńczonym PDA i umożliwiano wzrost w ciągu kilku dni w temperaturze 22 C. W odległości 1 cm od granicy wzrostu aseptycznie usunięto korkoborem kawałek agaru o średnicy 0,5 cm. Do tych studzienek dodawano bezpośrednio jałowy roztwór podstawowy AGO. Widoczna strefa hamowania pojawiała się przy ilościach tak niskich, jak 0,02 IU/studzienkę. Testy wobec Ph przeprowadzono w 96-studzienkowych płytkach. 14-dniowe hodowle Pseudocercosporella herpotrichoides var tritici na płynnym agarze stosuje się do sporządzenia

6 178 652 zawiesiny zarodników. Płytkę zalewa się 5-10 ml 0,1% podłoża CDAA i zarodniki miesza się w podłożu płynnym przez ostrożne zawirowanie. Stężoną zawiesinę zarodników pobiera się pipetą i dodaje do całkowitej objętości CDAA wymaganej do testu, doprowadzając stężenie zarodników do 100 000 zarodników/ml. Inkubację podczas oznaczenia przeprowadza się w temperaturze 24 C w ciemności. Zawiesinę zarodników rozmieszcza się w ilości 50 μl/studzienkę w 96-studzienkowej płytce do mikromiareczkowania. Następnie płytki te umieszcza się w inkubatorze (10 godzin/dzień światła w temperaturze 12 C) na 24 godziny przed zastosowaniem próbki. 50 μl próbki dodaje się do 50 μl inokulum (przygotowanego 24 godziny wcześniej), co daje całkowitą objętość w studzience 100 μl/traktowaną studzienkę/powtórzenie. Płytki do oznaczania inkubuje się w ciągu 48 godzin i wyniki oznacza się przez odczyt gęstości optycznej (OD) czytnikiem płytek do mikromiareczkowania BioRad, model 3550, przy pojedynczej długości fali 595 nm. Odczytu OD dokonuje się w czasie zero (t0), to jest bezpośrednio po dodaniu próbki i 48 godzin po dodaniu próbki (t48). Oceny wzrostu grzyba dokonuje się na podstawie różnic odczytów OD pomiędzy t0 i t48 pomnożonych przez wartość obliczeniową biomasy grzybowej. (Wartość obliczeniowa biomasy grzybowej jest zależnością pomiędzy wzrostem grzyba, a gęstością optyczną i określono ją w oddzielnych doświadczeniach. Zależność pomiędzy wzrostem grzyba, a gęstością optyczną określono namnażając grzyby w 96-studzienkowych płytkach do miareczkowania i zbierając grzybnię w czasie, co 0,1 jednostki absorbancji. Wartość obliczeniową otrzymuje się z liniowej zależności pomiędzy biomasą grzybową a OD dla konkretnego grzyba. Jest to wartość nachylenia otrzymana z zależności liniowej. Wartość obliczeniowa dla Ph wynosi 4,91). Następnie określa się procent hamowania z różnicy pomiędzy biomasami prób traktowanych i kontrolnych. AGO wykazywała 60% hamowania Ph w stężeniu 1,7 x 10-4 IU/μl. Testy wobec Sn przeprowadzono zasadniczo podobnie jak te dla Ph, z wyjątkiem przygotowywania zawiesiny zarodników. Do przygotowania zawiesiny zarodników używa się siedmiodniowych zarodnikujących hodowli Septoria nodorum na podłożu agarowym YMA. M ałą ilość (< 1 ml) podłoża CDAA nakrapla się na powierzchnię hodowli z m asą różowych zarodników wydostających się z pyknidiów. Zarodniki miesza się z podłożem CDAA przez ich powtarzane wciąganie i wypuszczanie z pipety. Stężoną mieszaninę dodaje się do całkowitej objętości CDAA wymaganej do testu, doprowadzając stężenie zarodników do 50 000 zarodników/ml. Wartość obliczeniowa dla Sn wynosi 0,508. AGO wykazywała,60% hamowania Sn w stężeniu 1,7 x 10-4 IU/ml. Oznaczenie aktywności przeciwbakteryjnej Hodowle bakterii Erwinia carotovora utrzymuje się przez posiew ezą na płytkach PDA i inkubację w temperaturze 24 C w ciemności. W celu przygotowania bulionu inokulacyjnego, ezę aktywnie rosnących bakterii (5-9-dniowych) dodaje się do 50 ml czterokrotnie rozcieńczonego bulionu PD w kolbie Erlenmeyera o objętości 125 ml. Kolbę umieszcza się na wytrząsarce inkubacyjnej (130 obrotów na minutę) w temperaturze 24 C w ciemności. Po 24 godzinach bakterie się osadza, ponownie zawiesza w jałowej wodzie dejonizowanej, i trzy lub cztery próbki o objętości 100 μl umieszcza w studzienkach 96-studzienkowych płytki do mikromiareczkowania do odczytu. Czytnik mikropłytek ustawia się na długość fali 595 nm i określa się średnią gęstość optyczną studzienek. Tę wartość absorbancji (ABS = gęstość optyczna) stosuje się w następującym wzorze do obliczania jednostek koloniotwórczych (CFU) zawartych w bulionie. CFU = (3 x 106) + [(3 x 108) x ABS] + [(5 x 108) ABS2] Do stosowania bulion doprowadza się do 105 CFU. AGO całkowicie znosiła wzrost E. carotovora w stężeniach tak niskich, jak 3 x 10-5 IU/μl. Identyfikacja enzymu Do wykrywania wytwarzania białka w układzie heterologicznym, takim jak komórki roślinne, można stosować liczne metody. Techniki blottingu typu Western można stosować do wykrywania białka immunologicznie, lub można zastosować oznaczenia enzymatyczne lub biologiczne do wykrywania aktywności białka.

178 652 7 Oznaczenie enzymatyczne oksydazy glukozowej Do określenia aktywności GO wykorzystano modyfikację ciągłego oznaczenia spektrofotometrycznego (Frederick i in., 1990). Jako kontrolę dodatnią stosowano GO Aspergillus niger (Sigma). Mieszanina reakcyjna składała się z 20 μg/ml peroksydazy z chrzanu (Sigma), 0,32 mm roztworu o-dianizydyny stabilizowanego Tritonem X-100 (Sigma) i 0,1 M glukozą w 75 mm buforze fosforanów sodowych (ph 5,0). Do tej mieszaniny dodawano 100 μl różnych stężeń GO A. niger dla reakcji kontrolnych lub 100 μ próbki pochodzącej ze l źródła heterologicznego. Oznaczenie to prowadzono w temperaturze pokojowej i monitorowano wzrost absorbancji przy długości fali 460 nm. Kolejne oznaczenie oksydazy glukozowej, wykorzystujące odczynnik 4-amino-antypirynę (4-AAP), zoptymalizowano w oparciu o Galio, 1981. 5X odczynnik 4-AAP przygotowuje się w objętości całkowitej 10 ml z 0,68 g KH2P 04, 8,3 mg 4-AAP (0,82 mm), 25 μl Tritonu X-100, 0,0658 krystalicznego fenolu i 1000 U peroksydazy z chrzanu, z ph doprowadzonym do 5,0 KOH. Oznaczenie przeprowadza się przez zmieszanie 200 (J tego odczynnika 4-AAP, 5 μl 1 mm FAD, 50 μl 1 M glukozy i testowanej próbki (do 750 pi). Wynik odczytuje się jako OD przy fali o długości 508 nm. Oznaczenie aktywności biologicznej oksydazy glukozowej Korek 4-6-dniowego grzyba Ggt przenoszono na płytki z czterokrotnie rozcieńczonym agarem ziemniaczano-dekstrozowym (Difco). Grzyb hodowano w temperaturze 22 C w ciągu czterech dni, lub dopóki nie uzyskano wzrostu o średnicy 2,5 cm. Używając jałowego korkobora, w agarze zrobiono studzienki w odległości 1 cm od kolistej strefy wzrostu i umieszczano w nich 100 μl buforu lub próbki pochodzącej ze źródła heterologicznego. Grzyb hodowano w ciągu 24 godzin w temperaturze pokojowej i sprawdzano pod kątem hamowania wzrostu. Immunologiczne wykrywanie oksydazy glukozowej Poliklonalne przeciwciała skierowane przeciw oksydazie glukozowej wytwarzanej przez Aspergillus niger są komercyjnie dostępne z wielu źródeł, na przykład Rockland, Inc., Gilbertsville, Pensylwania. TRANSFORMACJA GENETYCZNA Klonowanie genu AGO Z Aspergillus niger (ATCC 9029) wyizolowano całkowity DNA i zastosowano jako matrycę do izolacji genu oksydazy glukozowej z wykorzystaniem PCR. Startery PCR były oparte na opublikowanej sekwencji genu (Frederick i in.; Kriechbaum i in.) i zaprojektowano je do wyizolowania całej sekwencji genu, włącznie z sekwencją sygnałową. Ponadto, w celu ułatwienia wbudowywania tego genu do wektorów odpowiednich do ekspresji w heterologicznych układach bakteryjnych, bakulowirusowych i roślinnych, 5'-końcowy starter PCR (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 3) wprowadził przed kodonem startu AGT translacji genu miejsca endonukleaz restrykcyjnych Xbal i Bglll. 3'- końcowy starter PCR (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 4) wprowadził miejsca endonukleaz restrykcyjnych BamHI i KpnI bezpośrednio po kodonie stop. Wytworzony fragment PCR sklonowano w puc 118 w postaci fragmentu Xbal/Kpnl, z utworzeniem pmon22514 i w pełni go zsekwencjonowano. Sekwencja (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 1) dokładnie pokrywała się z sekwencją opublikowaną. Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 2 jest odpowiadającą sekwencją aminokwasową. Konstruowanie genu roślinnego Ekspresja genu roślinnego, który występuje w postaci dwuniciowego DNA obejmuje transkrypcję matrycowego RNA (mrna) z jednej nici DNA przez enzym polimerazę RNA, i następnie procesowanie pierwotnego transkryptu mrna wewnątrz jądra. Procesowanie to dotyczy 3'-końcowego regionu nie ulegającego translacji i polega na dodaniu nukleotydów poliadenylowych do końca 3' mrna. Transkrypcja DNA na mrna jest regulowana przez region DNA zazwyczaj określany jako promotor. Region promotora zawiera sekwencję zasad, która daje sygnał polimerazie RNA do związania się z DNA i rozpoczęcia transkrypcji mrna z wykorzystaniem jednej z nici DNA jako matrycy w celu utworzenia odpowiadającej nici RNA.

8 178 652 W literaturze opisano liczne promotory, które są aktywne w komórkach roślinnych. Obejmują one promotory syntazy nopalinowej (NOS) i syntazy oktopinowej (OCS) (które znajdują się na plazmidach indukujących nowotwory Agrobacterium tumefaciens), promotory 19S i 35S wirusa mozaiki kalafiora (CaMV), promotor 35S wirusa mozaiki trędownika (FMV) i indukowany światłem promotor małej podjednostki karbóksylazy rybulozo-1,5-bisfosforanowej (ssru- BISCO, bardzo powszechny polipeptyd roślinny). Wszystkie z tych promotorów stosowano do tworzenia różnych typów konstrukcji DNA, które ulegały ekspresji w roślinach. Zastosowania takie ujawnia opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 034 322 (Fraley i in., 1991), włączony do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy. Istnieją znane promotory które będą ograniczać ekspresję do poszczególnych części roślin w odpowiedzi na poszczególne bodźce. Na przykład, promotory specyficzne dla bulw ziemniaków, takie jak promotory patatyny lub promotory dużej i małej podjednostek pirofosforylazy ADP-glukozy, można zastosować do uzyskania ekspresji przede wszystkim w bulwach, a zatem łącznie z AGO zapewniają one odporność na ataki w bulwach, takie jak przez Erwinia. Promotor specyficzny dla owoców byłby pożądany do nadania odporności na Botrytis truskawkom lub winogronom. Promotor specyficzny dla korzeni byłby pożądany do uzyskania ekspresji AGO w pszenicy i jęczmieniu dla zapewnienia odporności na Ggt. Specjalista w tej dziedzinie będzie znał wiele takich promotorów specyficznych dla części roślin, które mogłyby być użyteczne w niniejszym wynalazku. Alternatywnie, promotory wykorzystywane w cząsteczkach dwuniciowych DNA można wybierać w celu uzyskania specyficznej ekspresji AGO w odpowiedzi na infekcję grzybową. Infekcja roślin patogenami grzybowymi wyzwala indukcję szerokiego szeregu białek, nazywanych białkami związanymi z obroną lub związanymi z patogenezą (PR) [Bowles; Boi i in.; Linthorst], Takie geny związane z obroną lub PR mogą kodować enzymy metabolizmu fenylopropionianowego (takie jak amoniako-liaza fenyloalaninowa, syntaza chalkonowa, ligaza 4-kumaran:CoA, 4-hydroksylaza kwasu kumarynowego), białka, które modyfikują ściany komórek roślinnych (takie jak glikoproteiny bogate w hydroksyprolinę, białka bogate w glicynę, peroksydazy), enzymy (takie jak chitynazy i glukanazy), które degradują ścianę komórek grzybowych, białka podobne do taumatyny lub białka o nieznanej dotąd funkcji. Geny związane z obroną lub PR izolowano i charakteryzowano z licznych gatunków roślin. Promotory tych genów można stosować do uzyskania ekspresji AGO w roślinach transgenicznych po wywołaniu infekcji patogenem, szczególnie patogenem grzybowym, takim jak Pi. Promotory takie mogą pochodzić z genów związanych z obroną lub PR izolowanych z samych ziemniaków [Fritzemeier i in.; Cuypers i in.; Logemann i in.; Matton i Brisson; Taylor i in.; Matton i in.; Schroder i in.]. W celu umieszczenia genu AGO pod kontrolą promotora indukowanego przez infekcję P. infestans, korzystny może być promotor opisany przez Taylora i in. (1990). Konkretny wybrany promotor powinien być zdolny do powodowania dostatecznej ekspresji sekwencji kodującej enzym, a w rezultacie do wytwarzania skutecznej ilości AGO. Promotory stosowane w konstrukcjach DNA (tj. chimerycznych genach roślinnych) według niniejszego wynalazku można, jeśli jest to pożądane, modyfikować, aby wpływać na ich właściwości kontrolujące. Na przykład, promotor 35S CaMV można zligować z częścią genu ssrubisco, która hamuje ekspresję ssrubisco w nieobecności światła, tworząc promotor, który jest aktywny w liściach, ale nie w korzeniach. Otrzymany promotor chimeryczny można stosować w sposób tu opisany. Do celów tego opisu, termin promotor CaMV obejmuje zatem warianty promotora 35S CaMV, tj. promotory otrzymane w wyniku ligacji z regionami operatorowymi, losową lub kontrolowaną mutagenezę, itp. Ponadto, promotory można tak zmieniać, aby zawierały wielokrotne sekwencje wzmacniające wspomagające podwyższanie ekspresji genu. Przykłady takich sekwencji wzmacniających zostały podane przez Kaya i in. Wzmocniony promotor 35S CaMV skonstruowano w następujący sposób. Fragment promotora 35S CaMV zawarty pomiędzy pozycjami -343 a +9 skonstruowano uprzednio w puc13 [Odell i in.]. Odcinek ten zawiera region zidentyfikowany jako konieczny do maksymalnej ekspresji promotora 35S CaMV. Wycięto go w postaci fragmentu Clal-Hindlll, wykonano tępe koń-

178 652 9 ce polimeraządna I (fragment ClaI) i wstawiono do miejsca HincII pucl 8. Ten region leżący przed promotorem 35S wycięto z plazmidu w postaci fragmentu HindIII-EcoRI (rozciągającego się od pozycji -343 do -90) i wstawiono do tego samego plazmidu między miejsca HindIII i Pstl. Wzmocniony promotor 35S CaMV (dalej w niniejszym opisie E35S CaMV ) zawiera zatem duplikację sekwencji pomiędzy -343 a -90 [Kay i in.]. RNA wytwarzany przez konstrukcję DNA według niniejszego wynalazku zawiera także 5'-końcową, nie ulegającą translacji sekwencję liderową. Sekwencja ta może pochodzić z promotora wybranego do ekspresji genu, i można ją specyficznie zmodyfikować, tak aby zwiększyć translację mrna. 5'-końcowe regiony nie ulegające translacji można także otrzymać z wirusowych RNA, z odpowiednich genów eukariotycznych lub z sekwencji syntetycznego genu. Niniejszy wynalazek nie ogranicza się do konstrukcji, w których region nie ulegający translacji pochodzi z 5'-końcowej sekwencji nie ulegającej translacji, która towarzyszy sekwencji promotora. Raczej, nie ulegająca translacji sekwencja liderowa może pochodzić z odmiennego promotora lub sekwencji kodującej. Na przykład, lider taki zawiera białko szoku cieplnego 70 (Hsp70) petunii. [Winter] Jak stwierdzono powyżej, 3'-końcowy region nie ulegający translacji chimerycznych genów roślinnych według niniejszego wynalazku zawiera sygnał poliadenylacji, który działa w roślinach powodując dołączanie nukleotydów adenylowych do końca 3' RNA. Przykładami regionów 3'-końcowych s ą( l) 3'-końcowe, ulegające transkrypcji, nie ulegające translacji regiony zawierające sygnał poliadenylacji genów plazmidów indukujących nowotwory (Ti) Agrobacterium, jak gen syntazy nopalinowej (NOS), i (2) geny roślinne, jak geny białka zapasowego 7s soi i gen E9 ssrubisco grochu [Fischhoff, i in.]. Transformacja roślin i ekspresja Chimeryczny gen roślinny zawierający strukturalną sekwencję kodującą według niniejszego wynalazku można wstawić do genomu rośliny jakąkolwiek odpowiednią metodą. Odpowiednie wektory transformujące rośliny obejmują te pochodzące z plazmidu Ti Agrobacterium tumefaciens, jak również te ujawnione np. przez Herrera-Estrella 1983), Bevana (1983), Klee (1985) i w publikacji europejskiego opisu patentowego numer 0120516 (Schilperoort i in). Poza wektorami transformującymi rośliny z plazmidów Ti lub plazmidów wywołujących chorobę włosowatości korzeni (Ri) Agrobacterium, do wstawiania konstrukcji DNA według tego wynalazku do komórek roślinnych można zastosować alternatywne metody. Metody takie mogą na przykład obejmować zastosowanie liposomów, elektroporację, środki chemiczne zwiększające pobieranie wolnego DNA, dostarczanie wolnego DNA przez bombardowanie mikropociskami i transformację z zastosowaniem wirusów lub pyłku. Rośliny, które można ochraniać sposobem według niniejszego wynalazku obejmują, ale nie ograniczają się do ziemniaków, pomidorów, pszenicy, kukurydzy, truskawek, winogron, jak również różnych roślin ozdobnych. Dla wszystkich tych typów roślin dostępne są metody hodowli tkankowych i regeneracji roślin. Krótkotrwała ekspresja oksydazy glukozowej w roślinach tytoniu Szczególnie użytecznym plazmidowym wektorem kasetki do transformacji roślin dwuliściennych jest pmon999. Kasetka ekspresyjna pmon999 składa się z promotora E35S CamV i końca 3' obejmującego sygnały poliadenylacji z genu NOS. pmon999 zawiera miejsca BgIII, KpnI i EcoRI do wstawiania sekwencji kodujących i miejsca NotI-NotI flankujące kasetkę ekspresyjną genu roślinnego. Zawierający region kodujący AGO fragment BgIII/KpnI pmon22514 wstawiono do pmon999 tworząc pmon22515. pmon22515 poddano elektroporacji do protoplastów tytoniu. Ekspresję oksydazy glukozowej przez stransformowane komórki tytoniu potwierdzono przez analizę poprzez blotting typu Western, jak również oznaczenia enzymatyczne.

10 178 652 Stabilna transformacja roślin dwuliściennych Wektor wahadłowy dla AGO utworzono przez wycięcie z pmon22515 regionu kodującego AGO w postaci fragmentu BamHI/BgIII. Umieszczono go następnie w wektorze opartym na puc, i otrzymany plazmid, pmon22579, zawiera promotor FMV, region kodujący AGO i koniec 3' włącznie z sygnałami poliadenylacji z genu NOS. Fragment NotI/NotI z tego wektora, zawierający promotor FMV, region kodujący AGO i koniec 3' genu NOS włącznie z sygnałem poliadenylacji przeniesiono do miejsca restrykcyjnego pmon17227 (światowy opis patentowy numer 92/0449, Barry i in.), tworząc ostateczny wektor Ti, pmon22587. Jak dyskutowano powyżej, gen AGO może również ulegać w konkretnych częściach rośliny dzięki użyciu promotorów specyficznych tkankowo. Promotor patatyny ulega ekspresji przede wszystkim w bulwach ziemniaka. Fragment KpnI/XbaI, zawierający region kodujący AGO, wycięto z pmon22514 i wstawiono do opartego na puc wektora zawierającego promotor 1.0 patatyny (Bevan i in., 1986) i koniec 3' włącznie z sygnałami poliadenylacji genu NOS, tworząc pmon22516. Fragment NotI pmon22516, zawierający promotor patatyny, region kodujący AGO i koniec 3' genu NOS włącznie z sygnałem poliadenylacji, przeniesiono następnie do miejsca restrykcyjnego NotI pmon17227, który opisano powyżej, tworząc wektor plazmidowy Ti, pmon22517. Wektory te można wprowadzać do rozbrojonego Agrobacterium ABI i stosować do transformacji wycinków ziemniaków, pomidorów lub innych w hodowli tkankowej. Po selekcji pod kątem oporności na kanamycynę lub glifosat i regeneracji roślin, można uzyskać całe rośliny zawierające gen AGO. Ekspresję genu oksydazy glukozowej można potwierdzić przez analizę poprzez blotting typu Western, oznaczenie enzymatyczne lub oznaczenie biologiczne. Ekspresja AGO przez stransformowane rośliny ziemniaka Z bulw roślin ziemniaka, które stransformowano wektorem plazmidowym Ti pmon22517, wyekstrahowano białko i sprawdzono pod kątem obecności oksydazy glukozowej przez analizę poprzez blotting typu Western. W niektórych roślinach wykryto wysokie poziomy ekspresji oksydazy glukozowej. Te poziomy ekspresji potwierdzono przez oznaczenie enzymatyczne z użyciem układu 4-aminoantypiryny. Z kilku tych bulw wyekstrahowano całkowite białko przez zmielenie w 25 mm buforze fosforanowym, ph 7,0 + 5 mm EDTA + 100 mm KCl. Białko zatężono i przemyto 12,5 mm buforem fosforanowym, ph 7,0. Białko wyekstrahowane z bulw, w których zachodziła ekspresja AGO, testowano wobec P. infestans w oznaczeniu na 96-studzienkowych płytkach w 12,5 mm buforze fosforanowym, ph 7,0. Wyniki przedstawiono w tabeli 1. Przy najwyższym testowanym poziomie białka, 21,2 (μg/ml, zarodniki Pi albo pozostawały niewykiełkowane, albo wzrost z zarodników był znacznie osłabiony w porównaniu z ekstraktami roślin kontrolnych, transformowanych pustym wektorem (pmon 17227) lub buforem. Tabela 1 Traktowanie Hamowanie grzybów * Kontrola z buforem 0 Kontrola z pustym wektorem 2 pmon22517, linia 9 3 pmon22517, linia 30 3 *Skala: 0 = brak hamowania, 1 = nieznaczne hamowanie, 2 = umiarkowane hamowanie, 3 = silne hamowanie. Liście roślin ziemniaka stransformowanych wektorem plazmidowym Ti pmon22587 testowano pod kątem obecności AGO wykorzystując oznaczenia enzymatyczne. Wyniki podano w tabeli 2. Jak powyżej, rośliny ziemniaka stransformowane pmon 17227 użyto jako rośliny kontrolne transformowane pustym wektorem.

178 652 11 Poziom ekspresjia Tabela 2 Aktywność oksydazy glukozowejb Równoważnac Numer linii (%) (U/10 ng x 10-4) (U/gŚM) Rus. Bur. 0 0 0 22587-2 0,075 72,2 7,22 22587-3 0,150 126,4 12,64 22587-4 0,007 6,0 0,6 22587-12 0,125 88,2 8,82 22587-31 0,350 144,4 14,04 22587-32 0,350 121,0 12,10 22587-33 0,450 181,8 18,18 22587-34 0,003 1,2 0,12 a Poziom ekspresji wyrażano jako procent oksydazy glukozowej w całkowitym ekstrahowalnym białku liści. b Aktywność oksydazy glukozowej w ekstraktach liści określano przez oznaczenie aktywności enzymatycznej i obliczano jako jednostki aktywności enzymu w białku całkowitym. c Jednostki aktywności oksydazy glukozowej na gram świeżej masy tkanki liści (U/gŚM) obliczano z aktywności w całkowitym białku przeliczając 10 (μg całkowitego białka na gram świeżej masy tkanki liści. Liście roślin ziemniaka stransformowanych wektorem plazmidowym Ti pmon22587 testowano również pod kątem poziomów H2O2 przez wytrącanie chlorkiem tytanu. Stwierdzono, że w dwóch liniach liście miały dwu- lub czterokrotnie wyższe poziomy H2O2 niż liście niestransformowanych roślin kontrolnych. Ziemniaki odporne na choroby Bulwy, w których zachodziła ekspresja AGO, testowano wobec Erwinia carotovora w oznaczeniu na krążkach bulw. Bulwy z 34 linii stransformowanych pmon22517 testowano pod kątem odporności na uszkodzenia przez mokrą zgniliznę. Testowano również poziomy ekspresji w liniach przez analizę poprzez blotting typu Western. Bulwy wyjałowiono powierzchniowo zgodnie z metodą Yanga i in. (1989). Dwie lub trzy bulwy z każdej linii aseptycznie pocięto na krążki o grubości 7-10 mm, otrzymując od sześciu do dwudziestu krążków z każdej linii. Krążki umieszczono na zwilżonej jałowej bibule filtracyjnej Whatman #1 w szalkach Petri'ego. Środek każdego krążka zaszczepiono 50 000 CFU bakterii w 10 μl. Krążki utrzymywano w środowisku o wysokiej wilgotności w ciągu 3 dni w temperaturze 23 C. Oceny choroby obejmowały pomiar długości, promienia i głębokości powstałych uszkodzeń. Rozcieńczenia zmacerowanej tkanki z rejonów uszkodzeń zastosowano do określenia końcowej liczby bakterii na uszkodzenie. Wyniki tego oznaczenia przedstawiono w tabeli 3. Dla linii, które okazały się najbardziej chronione, wszystkie z mierzonych parametrów były lepsze niż te dla bulw kontrolnych transformowanych pustym wektorem i buforem. Bulwy, dla których stwierdzono ekspresję AGO na najwyższym poziomie, na ogół mają najniższy poziom bakterii w uszkodzeniach. Tabela 3 Numer linii Poziomy ekspresjib CFU x 109 1 2 3 Kontrola z buforem ZERO 16,76 Kontrola z pustym wektorem ZERO 14,32 22517-10 ZERO 20,7

12 178 652 tabela 3 (ciąg dalszy) 1 2 3 22517-24 ZERO 20,09 22517-13 ZERO 16,3 22517-12 ZERO 19,26 22517-9 NISKI 9,34 22517-28 NISKI 13,56 22517-33 NISKI 9,57 22517-14 NISKI 8,22 22517-17 NISKI 8,36 22517-19 NISKI 9,37 22517-32 NISKI 7,17 22517-20 NISKI 7,4 22517-21 NISKI 6,25 22517-34 NISKI 4,44 22517-11 NISKI 3,06 22517-8 NISKI 1,5 22517-7 ŚREDNI 12,88 22517-31 ŚREDNI 12,06 22517-1 ŚREDNI 7,54 22517-15 ŚREDNI 6,7 22517-25 ŚREDNI 12,25 22517-35 ŚREDNI 6,81 22517-2 ŚREDNI 3,52 22517-3 ŚREDNI 1,26 22517-5 ŚREDNI 1,4 22517-6 WYSOKI 15,74 22517-18 WYSOKI 2,675 22517-26 WYSOKI 4,55 22517-29 WYSOKI 4,35 22517-4 WYSOKI 4,2 22517-30 WYSOKI 3,92 22517-16 WYSOKI 1,12 22517-23 WYSOKI 2,67 22517-36 WYSOKI 0,855 a CFU = jednostki koloniotwórcze b Poziomy ekspresji określone przez analizę poprzez blotting typu Western

178 652 13 Liście z roślin stransformowanych pmon22587 i w których zachodziła ekspresja AGO testowano pod kątem oporności na Pi. W pełni rozwinięte liście (-20 cm2) zaszczepiono przez dodanie kropelkami 100μl zawiesiny zarodni Phytophthora infestans na środek odosiowej powierzchni liścia. Inokula miały gęstość 105-106 zarodni na ml, zebranych z 2-3 -tygodniowych płytek zawierających podłoże LB-V8. Zaszczepione liście utrzymywano w płytkach Nunc Bio-Assay (243 x 243 x 18 cm), zapewniając wilgotność przez umieszczenie na dnie wilgotnej bibuły filtracyjnej i inkubowano w komorze hodowlanej w temperaturze ~19 C z 16-godzinnym fotoperiodem. Obserwowano rozwój objawów i zainfekowane obszary na liściach mierzono przez nałożenie na każdy liść przezroczystej siatki 5 mm x 5 mm. Dla każdej linii liści obliczono średnią zainfekowanej powierzchni i odchylenie standardowe. Transgeniczne linie, w których zachodziła ekspresja AGO, wykazywały znaczące osłabienie objawów powodowanych przez infekcję Phytophthora infestans na liściach. Wyniki z dwóch linii przedstawiono w tabeli 4. Obniżenie objawów wynosiło 47 i 57 procent w porównaniu z kontrolami (zarówno niestransformowaną, jak i transformantów pustym wektorem). Tabela 4 Powierzchnia infekcjia(cm2) Numer linii 3 dpzb 4 dpz 5 dpz 6 dpz Russet Burbank 1,2 2,1 4,2 7,1 17227-1c 1,6 2,7 4,7 8,7 22587-3d 0,4 0,8 1,1 3,0 22587-12d 0,5 1,3 2,3 3,7 a Powierzchnię infekcji podano jako średnią dla pięciu liści. b Dni po zaszczepieniu. c Linia kontrolna stransformowana tylko wektorem. d Linie transgeniczne, w których zachodzi ekspresja oksydazy glukozowej. Stabilna transformacja roślin jednoliściennych Do transformacji jednoliściennych skonstruowano wektor z AGO i intronem szczególnie użytecznym w zwiększaniu częstości otrzymywania roślin stransformowanych, w których zachodzi ekspresja pożądanego białka na wysokim poziomie. Zastosowano intron hsp70, ujawniony w europejskim opisie patentowym numer 602 193 (odpowiednik opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki numer kolejny 08/1821 364, Brown i in., włączonym do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy). Ujawniony w nim pmon19477 strawiono, a następnie fragment BgIII-BamHI o długości 800 bp, zawierający intron hsp70, sklonowano w unikalnym miejscu BgIII w pmon22515, otrzymując pmon22623. pmon22623 wprowadzono do komórek pszenicy przez bombardowanie mikropociskami stosując znane metody (Vasil i in.). Po uzyskaniu stransformowanych roślin, ich zdolność do wykazywania odporności na grzyby, szczególnie na Gtg, oceniana będzie znanymi metodami. Wszystkie publikacje i opisy patentowe wymienione w tym opisie włączono do niego poprzez odnośniki literaturowe, jak gdyby wyraźnie i pojedynczo stwierdzono, że każda pojedyncza publikacja lub opis patentowy jest włączona poprzez odnośnik literaturowy. Na podstawie powyższego opisu będzie widoczne, że ten wynalazek jest dobrze przystosowany do osiągnięcia wszystkich przedstawionych powyżej celów i przedmiotów wraz z zaletami, które są oczywiste i właściwe dla wynalazku.

14 178 652 Będzie zrozumiałe, że pewne cechy i subkombinacje są użyteczne i można je wykorzystywać bez odniesienia do innych cech i subkombinacji. Jest to przewidziane i pozostaje w zakresie zastrzeżeń. Ponieważ można dokonać wielu możliwych rozwiązań wynalazku bez wychodzenia poza jego zakres, powinno być zrozumiałe, że wszystkie wymienione tu lub przedstawione na dołączonych rysunkach treści należy interpretować w znaczeniu ilustrującym, a nie w znaczeniu ograniczającym. PIŚMIENNICTWO Barry, G.F., G. Kishore i S.R. Padgette. Glyphosate Tolerant 5-Enolpyruvylshikimate-3- phosphate Synthases. zgłoszenie PCT światowego opisu patentowego numer 92/04449,1991. Bevan, M. i in. Nature. 304: 184, 1983. Bevan, M. i in. Nucleic Acid Research. 14: 4625, 1986. Bol, J. i in. Ann Rev of Phvtopathol.. 28: 113-138, 1990. Bowles, D. Ann Rev of Biochem.. 59: 873-907, 1990. Cuypers, B. i in. Mol Plant-Microbe Interactions. 1: 157-160, 1988. FischofF, D. A. i Perlak, F. J. Synthetic plant genes and method for preparation. Publikacja europejskiego zgłoszenia patentowego numer 0 385 962, 1990. Frederick, K. i in. J. Biol. Chem.. 265: 3793-3802. Fritzemeier, K. i in. Plant Physiol. 85: 34-41, 1987. Gallo. Methods in Enzvmology. 71: 665-668, 1981. Herrera-Estrella, L. i in. Nature. 303, 20-9, 1983. Kay, R. i in. Science. 236: 1299-1302, 1987. Keil, M. i in. Nucleic Acids Res.. 14: 5641-5650, 1986. Klee, H.J. i in. Bio/Technology. 3: 637-642, 1985. Kim, K. i in. Phytopathology. 78: 488-492, 1988. Kim, K. i in. Can. J. Microbiol.. 36: 199-205, 1990. Kriechbaum M. i in. FEBSLett. 255: 63-66, 1989. Linthorst, H.J.M. Crit Rev Plant Sci. 10: 123-150. Logemann, J. i in. Plant Cell. 1: 151-158, 1989. Matton, D. i Brisson, N. Mol Plant-Microbe Interactions. 2: 325-331, 1989. Matton, D. i in. Plant Mol Biol. 14: 863-865, 1990. Nelson, C. i in. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77: 1975-1979, 1980. Odell, J. i in., Nature. 313: 810, 1985. Schroder, M. i in. Plant J. 2: 161-172, 1992. Taylor, J., i in. Molecular Plant-Microbe Interactions. 3: 72-77, 1990. Vasil i in. Bio/Technology 11: 1153-1158, 1993. Winter i in. Mol. Gen. Genet. 221(2): 315-19, 1988.

178 652 15 LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJA OGÓLNA: (i) ZGŁASZAJĄCY: (A) NAZWA: Monsanto Company (B) ULICA: 800 North Lindbergh Boulevard (C) MIEJSCOWOŚĆ: St. Louis (D) STAN: Missouri (E) KRAJ: STANY ZJEDNOCZONE AMERYKI (F) KOD POCZTOWY (ZIP): 63198 (G) TELEFON: (314)537-7286 (H) TELEFAX: (314)537-6047 (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: METODA ZWALCZANIA PATOGENÓW ROŚLINNYCH (iii) LICZBA SEKWENCJI: 4 (iv) ZAPIS KOMPUTEROWY: (A) TYP NOŚNIKA: Dyskietka (B) KOMPUTER: kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS./MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Release #1.0, wersja #1.25 (EPO) (vi) DANE DOTYCZĄCE UPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA: (A) NUMER ZGŁOSZENIA: US 08/161041 (B) DATA ZŁOŻENIA: 24 listopada 1993 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 1: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI: (A) DłUGOŚĆ: 1848 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa

16 178 652 (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (ix) CECHA: (A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 16...1833 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 1: TCTAGAAGAT CTATC ATG CAG ACT CTC CTT GTG AGC TCG CTT GTG GTC TCC 51 Met Gln Thr Leu Leu Val Ser Ser Leu Val Val Ser 1 5 10 CTC GCT GCG GCC CTG CCA CAC TAC ATC AGG AGC AAT GGC ATT GAA GCC 99 Leu Ala Ala Ala Leu Pro His Tyr Ile Arg Ser Asn Gly Ile Glu Ala 15 20 25 AGC CTC CTG ACT GAT CCC AAG GAT GTC TCC GGC CGC ACG GTC GAC TAC 147 Ser Leu Leu Thr Asp Pro Lys Asp Val Ser Gly Arg Thr Val Asp Tyr 30 35 40 ATC ATC GCT GGT GGA GGT CTG ACT GGA CTC ACC ACC GCT GCT CGT CTG 195 Ile Ile Ala Gly Gly Gly Leu Thr Gly Leu Thr Thr Ala Ala Arg Leu 45 50 55 60 ACG GAG AAC CCC AAC ATC AGT GTG CTC GTC ATC GAA AGT GGC TCC TAC 243 Thr Glu Asn Pro Asn Ile Ser Val Leu Val Ile Glu Ser Gly Ser Tyr 65 70 75 GAG TCG GAC AGA GGT CCT ATC ATT GAG GAC CTG AAC GCC TAC GGC GAC 291 Glu Ser Asp Arg Gly Pro Ile Ile Glu Asp Leu Asn Ala Tyr Gly Asp 80 85 90 ATC TTT GGC AGC AGT GTA GAC CAC GCC TAC GAG ACC GTG GAG CTC GCT 339 Ile Phe Gly Ser Ser Val Asp His Ala Tyr Glu Thr Val Glu Leu Ala 95 100 105 ACC AAC AAT CAA ACC GCG CTG ATC CGC TCC GGA AAT GGT CTC GGT GGC 387 Thr Asn Asn G ln Thr Ala Leu Ile Arg Ser Gly Asn Gly Leu Gly Gly 110 115 120 TCT ACT CTA GTG AAT GGT GGC ACC TGG ACT CGC CCC CAC AAG GCA CAG 435 Ser Thr Leu Val Asn Gly Gly Thr Trp Thr Arg Pro His Lys Ala G ln 125 130 135 140 GTT GAC TCT TGG GAG ACT GTC TTT GGA AAT GAG GGC TGG AAC TGG GAC 483 Val Asp Ser Trp Glu Thr Val Phe Gly Asn Glu Gly Trp Asn Trp Asp 145 150 155 AAT GTG GCC GCC TAC TCC CTC CAG GCT GAG CGT GCT CGC GCA CCA AAT 531 Asn Val Ala Ala Tyr Ser Leu G ln Ala Glu Arg Ala Arg Ala Pro Asn 160 165 170

178 652 17 GCC AAA CAG ATC GCT GCT GGC CAC TAC TTC AAC GCA TCC TGC CAT GGT 579 Ala Lys G ln Ile Ala Ala Gly His Tyr Phe Asn Ala Ser Cys His Gly 175 180 185 GTT AAT GGT ACT GTC CAT GCC GGA CCC CGC GAC ACC GGC GAT GAC TAT 627 Val Asn Gly Thr Val His Ala Gly Pro Arg Asp Thr Gly Asp Asp Tyr 190 195 200 TCT CCC ATC GTC AAG GCT CTC ATG AGC GCT GTC GAA GAC CGG GGC GTT 675 Ser Pro Ile Val Lys Ala Leu Met Ser Ala Val Glu Asp Arg Gly Val 205 210 215 220 CCC ACC AAG AAA GAC TTC GGA TGC GGT GAC CCC CAT GGT GTG TCC ATG 723 Pro Thr Lys Lys Asp Phe Gly Cys Gly Asp Pro His Gly Val Ser Met 225 230 235 TTC CCC AAC ACC TTG CAC GAA GAC CAA GTG CGC TCC GAT GCC GCT CGC 771 Phe Pro Asn Thr Leu His Glu Asp Gln Val Arg Ser Asp Ala Ala Arg 240 245 250 GAA TGG CTA CTT CCC AAC TAC CAA CGT CCC AAC CTG CAA GTC CTG ACC 819 Glu Trp Leu Leu Pro Asn Tyr Gin Arg Pro Asn Leu G ln Val Leu Thr 255 260 265 GGA CAG TAT GTT GGT AAG GTG CTC CTT AGC CAG AAC GGC ACC ACC CCT 867 Gly Gin Tyr Val Gly Lys Val Leu Leu Ser Gin Asn Gly Thr Thr Pro 270 275 280 CGT GCC GTT GGC GTG GAA TTC GGC ACC CAC AAG GGC AAC ACC CAC AAC 915 Arg Ala Val Gly Val Glu Phe Gly Thr His Lys Gly Asn Thr His Asn 285 290 295 300 GTT TAC GCT AAG CAC GAG GTC CTC CTG GCC GCG GGC TCC GCT GTC TCT 963 Val Tyr Ala Lys His Glu Val Leu Leu Ala Ala Gly Ser Ala Val Ser 305 310 315 CCC ACA ATC CTC GAA TAT TCC GGT ATC GGA ATG AAG TCC ATC CTG GAG 1011 Pro Thr Ile Leu Glu Tyr Ser Gly Ile Gly Met Lys Ser Ile Leu Glu 320 325 330 CCC CTT GGT ATC GAC ACC GTC GTT GAC CTG CCC GTC GGC TTG AAC CTG 1059 Pro Leu Gly Ile Asp Thr Val Val Asp Leu Pro Val Gly Leu Asn Leu 335 340 345 CAG GAC CAG ACC ACC GCT ACC GTC CGC TCC CGC ATC ACC TCT GCT GGT 1107 G ln Asp Gin Thr Thr Ala Thr Val Arg Ser Arg Ile Thr Ser Ala Gly 350 355 360 GCA GGA CAG GGA CAG GCC GCT TGG TTC GCC ACC TTC AAC GAG ACC TTT 1155 Ala Gly Gin Gly Gin Ala Ala Trp Phe Ala Thr Phe Asn Glu Thr Phe 365 370 375 380 GGT GAC TAT TCC GAA AAG GCA CAC GAG CTG CTC AAC ACC AAG CTG GAG 1203 Gly Asp Tyr Ser Glu Lys Ala His Glu Leu Leu Asn Thr Lys Leu Glu 385 390 395 CAG TGG GCC GAA GAG GCC GTC GCC CGT GGC GGA TTC CAC AAC ACC ACC 1251 Gin Trp Ala Glu Glu Ala Val Ala Arg Gly Gly Phe His Asn Thr Thr 400 405 410