PL B1. Polska Akademia Nauk, Instytut Biochemii i Biofizyki,Warszawa,PL BUP 18/04

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (51) Int.Cl. C12N 9/14 ( ) C12N 15/29 ( ) C12Q 1/34 ( ) (54) Gen kodujący enzym hydrolityczny 1,3-β-glukanazy, sposób jego wytwarzania, enzym kodowany przez ten gen oraz sposób wytwarzania enzymu hydrolitycznego 1,3-β-glukanazy (73) Uprawniony z patentu: Polska Akademia Nauk, Instytut Biochemii i Biofizyki,Warszawa,PL (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 18/04 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 12/08 (72) Twórca(y) wynalazku: Jacek Hennig,Warszawa,PL Anna Barabasz,Zwoleń,PL Kamil Witek,Szymanów,PL (74) Pełnomocnik: Iwona Brodowska, LEX-PAT Biuro Prawno-Patentowe S.C. (57) 1. Gen, kodujący nowy enzym hydrolityczny 1,3-β-glukanazy, o sekwencji nukleotydowej przedstawionej wzorem 1 PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest gen, o nieznanej dotychczas sekwencji nukleotydowej, kodowany przez ten gen nowy enzym hydrolityczny 1,3-β-glukanazy oraz sposób wytwarzania tego genu i enzymu. Gen będący przedmiotem wynalazku znajduje zastosowanie do otrzymywania roślin zawierających podwyższony poziom kodowanego przez ten gen enzymu hydrolitycznego 1,3-β-glukanazy, wybranych z grupy obejmującej ziemniaki, pomidory, paprykę, tytoń, czyli podstawowe rośliny uprawne rodziny Solanaceae, posiadających ulepszone cechy hodowlane, zwłaszcza zwiększoną odporność na infekcje grzybowe. Podczas odpowiedzi roślin na różnego rodzaju infekcje (wirusy, bakterie, grzyby) ulega indukcji wiele klas białek, które noszą wspólną nazwę białka PR (od. Patogenesis-Related - Związane z Patogenezą). Klasę II białek PR tworzą 1,3-β-glukanazy. Enzymy te katalizują hydrolizę wiązania endo 1,3- -β-glikozydowego, które jest częstym wiązaniem w związkach budujących ściany komórkowe roślin, grzybów i bakterii. 1,3-β-Glukanazy są enzymami powszechnie występującymi w świecie roślin nasiennych. Występują one w postaci wielu izoform (kwaśnych i zasadowych), które różnią się wielkością, punktem izoelektrycznym, strukturą pierwszorzędową, aktywnością, lokalizacją komórkową i wzorem ekspresji. 1,3-β-Glukanazy ulegają ekspresji, w różnych procesach fizjologicznych i rozwojowych takich jak: odpowiedź na infekcję, zranienie czy chłód, traktowanie ozonem i promieniowaniem UV i X, jak również podczas dojrzewania ziaren pyłku, wzrostu łagiewki pyłkowej, embriogenezie, kiełkowaniu nasion w tym w mobilizacji rezerw w bielmie. Większość genów kodujących białka o aktywności 1,3-β-glukanazowej wykazuje podobny schemat budowy. Składają się one z dwóch eksonów rozdzielonych intronem, gdzie miejsce splicingu znajduje się w przedostatnim kodonie peptydu sygnalnego. Syntetyzowane w procesie translacji białko ulega dalszej obróbce. Zarówno w przypadku form zasadowych, jak i kwaśnych ulega odcięciu peptyd sygnalny, jeszcze podczas translacji. Po zakończeniu translacji formy białek kwaśnych mają już dojrzałą postać. Natomiast, w przypadku białek zasadowych powstały po translacji peptyd ulega glikozylacji na C-końcu, a następnie zglikozylowany C-końcowy fragment jest odcinany. Białko wykrywane w wakuoli jest już nie zglikozylowane, nie posiada też C-końcowego fragmetu (Linthorst H. Crit. Rev. Plant Sci. [1991] 10, ). Istnieje coraz więcej przesłanek ku temu, aby twierdzić, że właśnie ten C-koniec zawiera sygnał do lokalizacji komórkowej białka. Do chwili, obecnej najwięcej informacji dotyczących sekwencji genów kodujących poszczególne izoformy uzyskano dla roślin tytoniu (Ward E. R., Payne G. B., Moyer M. B., Williams S. C., Dincher S. S., Sharkey K. C., Bec, J. J., Taylor H. T., Ahl-Goy P., Meins F. Jr., Ryals J. A. Plant Physiol. [1991] 96, ). Sklonowano wiele genów kodujących białka o omawianej aktywności - zarówno kopie cdna-owe, jak i genomowe. Opierając się na podobieństwie sekwencji aminokwasowych 1,3-β- -glukanazy zostały podzielone na 5 klas (Li C. -D., Langridge P., Lance R. C. M., Xu P., Fincher G. B. Theor. Appl. Genet. [1996] 92, ). Białka zaliczone do klasy I i II 1,3-β-glukanaz są silnie aktywowane podczas procesu odpowiedzi roślin na infekcje. Przypisuje się im właściwości obronne i zalicza do grupy białek PR. Klasę II 1,3-β-glukanaz tworzą białka kwaśne, o lokalizacji pozakomórkowej. Masa poszczególnych białek wynosi od 34 do 36 kda. Ulegają one znaczącej indukcji po potraktowaniu tkanki kwasem salicylowym oraz chemicznymi środkami ochrony roślin (np. BHT). Geny kodujące tę klasę β-glukanaz ulegają ponadto ekspresji w poszczególnych częściach kwiatu, jak i w kiełkujących nasionach (Delp G. i Palva T. A. Plant Mol. Biol. [1999] 39, ). Stosunkowo mało wiadomo o genach kodujących białka o aktywności 1,3-β-glukanazy, w roślinach takich jak ziemniaki, pomidory, papryka, czyli podstawowe rośliny uprawne rodziny Solanaceae, a zwłaszcza w roślinach ziemniaka. Dotychczas poznane zostały jedynie sekwencje dla kilku genów. Nieoczekiwanie okazało się, że możliwe jest otrzymanie genu kodującego nowy wariant enzymu hydrolitycznego z wykorzystaniem techniki rt-pcr, z użyciem jako matrycy całkowitego RNA z tkanki rośliny gospodarza, zwłaszcza ziemniaka (Solanum tuberosum L. odmiany Désirée), zainfekowanej ziemniaczanym wirusem Y (PVY). W wyniku analizy sekwencyjnej nukleotydów genu według wynalazku stwierdzono, że należy on do rodziny genów kodujących 1,3-β-glukanazy. Przeprowadzona analiza wzoru ekspresji genu oraz badania funkcjonalne wskazują, że ekspresja tego genu jest regulowana w odpowiedzi rośliny na infekcje. Gen, kodujący enzym hydrolityczny 1,3-β-glukanazy, według wynalazku, ma sekwencję nukleotydową przedstawioną wzorem 1.

3 PL B1 3 Sposób wytwarzania genu według wynalazku polega na tym, że tkankę rośliny, korzystnie ziemniaka infekuje się ziemniaczanym wirusem Y (PVY), po czym z zainfekowanego materiału roślinnego wyizolowuje się techniką rt-pcr gen według wynalazku kodujący nowy enzym hydrolityczny 1,3- -β-glukanazy wykorzystując jako matrycę całkowite RNA tkanki tej rośliny. Enzym hydrolityczny 1,3-β-glukanazy ulegający ekspresji w komórkach roślin, kodowany przez gen według wynalazku, ma strukturę aminokwasową przedstawioną wzorem 2. Enzym hydrolityczny 1,3-β-glukanazy według wynalazku wytwarza się w ten sposób, że genom roślin-gospodarza, korzystnie ziemniaka, transformuje się materiałem genetycznym, do którego wprowadzono gen według wynalazku w obrębie roślinnej kasety, ekspresyjnej, przy czym do transformacji materiału roślinnego stosuje się plazmid w skład, którego oprócz wspomnianego genu, wchodzi dowolny znany promotor, o którym wiadomo, że zapewnia inicjację transkrypcji w roślinach, wybrany z grupy promotorów wyizolowanych z roślin lub wirusów roślinnych, korzystnie promotor wirusa mozaikowatości kalafiora CaMV 35S, promotor syntazy nopalinowej promotor nos, promotor syntazy oktopinowej lub promotor ocs oraz dowolny znany terminator transkrypcji korzystnie termniator genu syntazy nopalinowej 3' nos lub terminator genu 35S wirusa mozaikowatości kalafiora 3' 35S, funkcjonujący w komórkach roślinnych, zapewniający stabilne zakończenie transkryptu za wprowadzonym genem, do otrzymania materiału roślinnego o podwyższonym poziomie enzymu hydrolitycznego 1,3-β-glukanazy, po czym regeneruje się oraz selekcjonuje transgeniczne rośliny nadprodukujące pożądany enzym. Porównując 338 aminokwasową sekwencję białka z sekwencjami innych znanych białek o podobnej aktywności enzymatycznej można przewidywać, że peptyd sygnalny ma w nim długość 23 aminokwasów, a dojrzałe białko stanowi 315 aminokwasów. Z komputerowej analizy danych wynika, że masa dojrzałego białka wynosi 35,5 kda, a punkt izoelektryczny jest w granicach obojętnego. Nieoczekiwanie stwierdzono iż, zwiększona zawartość enzymu według wynalazku nadaje roślinom zestaw korzystnych właściwości, a przede wszystkim zmianę wyglądu roślin, są krępe, jak pokazano na fig. 1, przy zachowaniu nie zmienionej produktywności bulw, co pokazano na fig. 2, zaś uzyskane rośliny, zwłaszcza ziemniaki, charakteryzują się zmniejszoną podatnością na infekcje grzybowe, jak pokazano na fig. 3. Na wszystkich załączonych rysunkach literą A oznaczono rośliny kontrolne, a literą B rośliny z podwyższonym poziomem enzymu hydrolitycznego 1,3-β-glukanazy. Gen według wynalazku można zastosować do wytworzenia roślin o ulepszonych cechach hodowlanych, w ten sposób, że prowadzi się: [I] rekombinację DNA do skonstruowania wektora zawierającego DNA genem kodującym enzym hydrolityczny (1,3-β-glukanazą), [II] przeniesienie fragmentu DNA z genem kodującym enzym hydrolityczny oraz sygnałami zapewniającymi jego rekombinację z DNA gospodarza-rośliny, korzystnie ziemniaka, oraz jego ekspresję w komórkach gospodarza (kaseta ekspresyjna), z wektora plazmidowego do genomu rośliny, (III) regenerację oraz selekcję transgenicznych roślin nadprodukujących enzym hydrolityczny (1,3-β-glukanazę). Do transformacji roślin stosuje się materiał genetyczny (DNA plazmidu), korzystnie uzupełniony czynnikiem (markerem) umożliwiającym selekcją komórek zawierających wrekombinowaną do genomu kasetą ekspresyjną z genem kodującym enzym hydrolityczny. Marker ten warunkuje oporność selekcjonowanych roślin na antybiotyki, takie jak kanamycyna. Do wprowadzenia DNA kasety ekspresyjnej zawierającej gen dla enzymu hydrolitycznego oraz marker selekcyjny stosuje się dowolną znaną metodą, taką jak bezpośrednie bombardowanie tkanki roślinnej DNA lub transformacji roślin z wykorzystaniem szczepów bakterii z rodzaju Agrobacterium i wektorów z rodziny Ti. Wybór metody wprowadzenia obcego DNA do materiału genetycznego komórek roślin zależy od tego, jaki gatunek roślin zostanie wybrany w celu transformacji. Podstawową metodą, gwarantującą stabilną integrację fragmentu DNA do genomu roślin, korzystnie ziemniaka oraz zapewniającą dziedziczenie wprowadzonej modyfikacji oraz utrzymywanie się uzyskanych pożądanych cech w pokoleniach potomnych, jest transformacja z wykorzystaniem bakterii z rodzaju Agrobacterium. Istnieje szereg modyfikacji procesu transformacji roślin z wykorzystaniem różnych szczepów Agrobacterium, ponadto, można zastosować liczne strategie konstrukcji wektorów wykorzystywanych dla zapewnienia optymalnego poziomu ekspresji transgenu. Stwierdzono, że uzyskane przy pomocy genu według wynalazku rośliny, zwłaszcza ziemniaka, mają 3-8 krotnie zwiększony, w porównaniu z roślinami macierzystymi, poziom enzymu hydrolitycznego (1,3-β-glukanazy) według wynalazku i nieoczekiwanie znacznie lepsze cechy hodowlane. Są krępe, przy zachowaniu nie zmienionej produktywności, zwłaszcza bulw i charakteryzują się zmniejszoną podatnością na infekcje grzybowe.

4 4 PL B1 Najprawdopodobniej, wszystkie te korzystne właściwości wynikają z podwyższonej zawartości enzymu hydrolitycznego, kodowanego przez nowy gen według wynalazku. Konsekwencją tego podwyższonego poziomu enzymu hydrolitycznego, skierowanego przeciwko elementom ściany komórkowej grzybów chorobotwórczych, w stosunku do roślin może być podwyższona odporność na infekcje. Zastosowanie genu według wynalazku do wytwarzania linii roślin o zmniejszonej podatności na infekcje, polega na wbudowaniu go w strukturę materiału genetycznego roślin, korzystnie Solarium tuberosum L. odmiany Désirée. Tak, więc nowy enzym hydrolityczny, będący przedmiotem wynalazku może być skutecznie stosowany dla ochrony roślin przed infekcją, korzystnie roślin ziemniaka dając zmniejszona podatność na choroby grzybowe. Poniżej przedstawiono przykłady wykonania wynalazku nie ograniczające jego zakresu. P r z y k ł a d I 1. Izolacja fragmentu DNA zawierającego nowy gen dla enzymu hydrolitycznego. DNA zawierający sekwencję kodującą (glub20) enzym hydrolityczny namnożono z wykorzystaniem techniki PCR na matrycy całkowitego RNA wyizolowanego z tkanki liści roślin Ziemniaka jadalnego (Solanum tuberosum L.) odmiany Désirée infekowanych wirusem PVY 0, szczep Epoka, w dwa tygodnie po infekcji. W reakcji PCR wykorzystano następującą parę primerów ([20-2L] 5'-GGATCCATTATTAAAATTGAGTTGATAC-3' [20-2U] 5'-GGATCCAATTTTCCATGGC TTTTAAG-3') Primery te wprowadziły dodatkowo miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne BamHI i Ncol: w górę od miejsca startu translacji oraz miejsce dla enzymu BamHI poniżej kodonu STOP translacji. Produkt reakcji PCR został wstawiony do wektora pcrii-topo (Invitrogen Corp.) zgodnie z procedurą zalecaną przez producenta. Dla powielenia DNA plazmidu stosowano transformację komórek Escherichia coli, szczep TOP10 (TOPO TA Cloning Version. C, Invitrogen Corp., CA USA), przeprowadzoną zgodnie ze standardową metodą, z użyciem CaCI 2 alkalicznej (Sambrook J., E. F. and T. Maniatis. 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2 nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.). Transformanty selekcjonowano na podłożu pełnym Luria-Bertani (LB) [Merck GmbH, Niemcy] z dodatkiem ampicyliny o stężeniu 50 μg/ml. Izolację DNA plazmidowego prowadzono z wykorzystaniem metody tzw. lizy alkalicznej (Sambrook J., E. F. and T. Maniatis. 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2 nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.) 2. Ustalenie sekwencji nukleotydowej genu dla badanego fragmentu DNA. Strukturę sekwencji nukleotydowej nowego genu oraz sekwencji aminokwasowej nowego wariantu enzymu hydrolitycznego kodowanego przez gen, według wynalazku stwierdzono poprzez określenie sekwencji kb DNA wstawki pochodzenia roślinnego w wektorze pcril-topo (Invitrogen Corp.). Wektor wraz ze wstawką posłużył do ustalenia sekwencji obu nici DNA wstawki zawierającej nowy gen. Dla powielenia DNA plazmidu stosowano transformację komórek Escherichia coli K12, szczep DH5α, przeprowadzoną zgodnie ze standardową metodą, z użyciem CaCI 2 oraz izolację DNA plazmidowego z wykorzystaniem lizy alkalicznej (Sambrook J., E. F. and T. Maniatis. 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2 nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.). Kompletną sekwencję nukleotydową wstawki obejmującą region kodujący genu (glub20] dla enzymu hydrolitycznego otrzymano, stosując sekwencjonowanie metodą tzw. Primer Walking. Do prowadzenia reakcji sekwencjonowania DNA używano zestaw BigDye Terminator (Promega, WI USA), aparat do aplifikacji DNA firmy Perkin Elmer, (USA) model 2400 oraz sekwenator model ABI377 (Applied Biosystem, USA). Uzyskane sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe analizowano przy pomocy programów z pakietu GCG wersja 7.0, 1991 (Genetics Computer Group, Madison, Wi., USA) oraz BLAST (Altschul S. F., W. Gish, W. Miller E. W. Myers and D J. Lipman [1990], J. Mol Biol. 215, 403). 3. Konstrukcja wektora i transformacja szczepu Agrobacterium tumefaciens. Region kodujący genu glub20 został wytrawiony z wektora pcrii-topo przy pomocy enzymu BamHl i wstawiony do wektora pff19 (Timmermans M. C. P, Maliga P., Vieira J. i Messing J. [1990] J. of Biotech. 14, ). Zrekombinowany plazmid pff19/glub20 selekcjonowano w bakteriach na podłożu LB z dodatkiem ampicyliny o stężeniu 50 μg/ml. Kolonie bakterii zawierające pożądaną wstawkę DNA identyfikowano izolując DNA i trawiąc enzymem restrykcyjnym BamHl. Wyselekcjonowany klon (p20-2) niosący 1017 nukleotydową wstawkę z genem glub20 w orientacji zapewniającej: inicjację transkrypcji ze znajdującego się w wektorze pff19 sekwencji promotora CaMV 35S oraz właściwą terminację i stabilność powstających transkryptów (35S poly A). Klon ten p20-2 posłużył do izolacji kasety ekspresyjnej, gwarantującej wydajną ekspresję w komórkach roślinnych, poprzez

5 PL B1 5 trawienia DNA klonu p20-2 enzymami Hindlll\EcoRl. Odnośny fragment DNA, o wielkości 2.1 kb został wstawiony do wektora pga482 (An G. [1986], Plant Physiol. 81, 86-91) umożliwiającego transformację roślin. Finalny wektor pga482/20-2 przenoszono do komórek Agrobacterium tumefaciens zgodnie z metodą opisaną przez Ditta G., Stanfield S., Corbin, D. i Helinski, D. R. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1980, 77, ) z wykorzystaniem oporności na tetracyklinę (2.5 μg/ml). 4. Transformacja, regeneracja i warunki hodowli roślin. Do transformacji użyto roślin Ziemniaka jadalnego (Solanum tuberosum L.) odmiany Désirée, pochodzącej z kolekcji Zakładu Doświadczalnego w Młochowie, Instytutu Hodowli Aklimatyzacji Roślin w Radzikowie. Rośliny były propagowane in vitro, w podłożu Murashige i Skoog (Murashige T. i Skoog F. [1962] Plant Physiol. 15, ) w kontrolowanych warunkach wzrostu, w fitotronie przy 16 godzinnym dniu i temperaturze 22 C oraz 8 godzinnej nocy i temperaturze 18 C. Stosowano oświetlenie jarzeniowe o natężeniu 5000 to 6000 lux. W fitotronie wilgotność wahała się w zakresie 65-85%. Transformację wykonywano według procedury opisanej przez Horsch R. B., Fry J. E., Hoffmann N. L, Eichholtz D., Rogers S. G. i Fraley R. T. (Science [1985], 227, ), z wykorzystaniem komórek Agrobacterium tumefaciens szczep LBA 4404, zawierającego wektor pga 482/20-2. Zregenerowano około 40 transformantów opornych na kanamycynę, które dalej badano. Obecność oraz ekspresję transgenu gwarantującego podwyższony poziom enzymu hydrolitycznego (1,3-β-glukanazę) potwierdzono: na poziomie RNA metodą Notherna i na poziomie białka z wykorzystaniem specyficznych przeciwciał. W testach tych stosowano standardowe metody opisane przez Sambrooka J. i Maniatisa T. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2 nd Edition [1989], Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.). Wybrane linie transgeniczne przenoszono do podłoża torfowego i hodowano w kontrolowanych warunkach świetlno-temperaturowych (jak powyżej) w fitotronie. 5. Oznaczenie aktywności enzymatycznej 1,3-β-glukanazy. Aktywność enzymu oznaczano w ekstrakcie białkowym uzyskanym poprzez roztarcie mg tkanki liści w 0,5 M buforze cytrynianowym o ph 5,2. Ekstrakt sedymentowano poprzez wirowanie 10 4 x g w temp. 4 C przez 20 min. Zawartość białka w próbie wyznaczano metodą Bradforda przy pomocy zestawu firmy BioRad Laboratories, Inc. CA USA. Aktywność 1,3-β-glukanazy wyznaczano spektrofotometryczne (przy OD 410 ) poprzez pomiar ilości uwalnianej glukozy z laminaryny jak opisano wcześniej przez Kombrinka E. i Hahlbrocka K. Plant Physiol. (1986) 81, P r z y k ł a d II 1. Transformacja, regeneracja i warunki hodowli roślin. Do transformacji użyto roślin Tytoniu (Nicotiana tabaccum L.) odmiany Xanthinc, pochodzącej z kolekcji Zakładu Biochemii Roślin, Instytutu Biochemii i Biofizyki PAN w Warszawie. Rośliny były propagowane in vitro, w podłożu Murashige i Skoog (Murashige T. i Skoog F. [1962] Plant Physiol. 15, ) w kontrolowanych warunkach wzrostu, w fitotronie przy 16 godzinnym dniu i temperaturze 22 C oraz 8 godzinnej nocy i temperaturze 18 C. Stosowano oświetlenie jarzeniowe o natężeniu 5000 to 6000 lux. W fitotronie wilgotność wahała się w zakresie 65-85%. Transformację wykonywano według procedury opisanej przez Horsch R. B., Fry J. E., Hoffmann N. L., Eichholtz D., Rogers S. G. i Fraley R. T. (Science [1985], 227, ), z wykorzystaniem komórek Agrobacterium tumefaciens szczep LBA 4404, zawierającego wektor pga 482/20-2. Zregenerowano około 20 stransformowanych roślin tytoniu, opornych na kanamycynę, które dalej badano. Obecność oraz ekspresję transgenu gwarantującego podwyższony poziom enzymu hydrolitycznego (1,3-β-glukanazę) potwierdzono: na poziomie RNA metodą Notherna i na poziomie białka z wykorzystaniem specyficznych przeciwciał. W testach tych stosowano standardowe metody opisane przez Sambrooka J. i Maniatisa T. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2 nd Edition [1989], Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.). Wybrane linie transgeniczne przenoszono do podłoża torfowego i hodowano w kontrolowanych warunkach świetlno-temperaturowych (jak powyżej) w fitotronie. 2. Oznaczenie aktywności enzymatycznej 1,3-β-glukanazy. Aktywność enzymu oznaczano w ekstrakcie białkowym uzyskanym poprzez roztarcie mg tkanki liści tytoniu w 0,5 M buforze cytrnianowym o ph 5,2. Ekstrakt sedymentowano poprzez wirowanie 10 4 x g w temp. 4 C przez 20 min. Zawartość białka w próbie wyznaczano metodą Bradforda przy pomocy zestawu firmy BioRad Laboratories, Inc. CA USA. Aktywność 1,3-β-glukanazy wyznaczano spektrofotometryczne (przy OD 410 ) poprzez pomiar ilości uwalnianej glukozy z laminaryny jak opisano wcześniej przez Kombrinka E. i Hahlbrocka K. Plant Physiol. (1986) 81,

6 6 PL B1 Zastrzeżenia patentowe 1. Gen, kodujący nowy enzym hydrolityczny 1,3-β-glukanazy, o sekwencji nukleotydowej przedstawionej wzorem Sposób wytwarzania genu kodującego nowy enzym hydrolityczny 1,3-β-glukanazy, znamienny tym, że tkankę rośliny, korzystnie ziemniaka infekuje się ziemniaczanym wirusem Y (PVY), po czym z zainfekowanego materiału roślinnego wyizolowuje się techniką rt-pcr gen kodujący nowy enzym hydrolityczny 1,3-β-glukanazy jak określono w zastrz. 1, wykorzystując jako matrycę całkowite RNA tkanki tej rośliny. 3. Enzym hydrolityczny ulegający ekspresji w komórkach roślinnych, kodowany przez gen, jak określono w zastrz. 1, o strukturze aminokwasowej o wzorze Sposób wytwarzania enzymu hydrolitycznego 1,3-β-glukanazy, jak określono w zastrz. 3, znamienny tym, że genom roślin-gospodarza, korzystnie ziemniaka, transformuje się materiałem genetycznym, do którego wprowadzono gen, jak określono w zastrz. 1, w obrębie roślinnej kasety, ekspresyjnej, przy czym do transformacji materiału roślinnego stosuje się plazmid w skład, którego oprócz wspomnianego genu, wchodzi dowolny znany promotor, o którym wiadomo, że zapewnia

7 PL B1 7 inicjację transkrypcji w roślinach, wybrany z grupy promotorów wyizolowanych z roślin lub wirusów roślinnych, korzystnie promotor wirusa mozaikowatości kalafiora CaMV 35S, promotor syntazy nopalinowej promotor nos lub promotor syntazy oktopinowej promotor ocs oraz dowolny znany terminator transkrypcji korzystnie termniator genu syntazy nopalinowej 3' nos lub terminator genu 35S wirusa mozaikowatosci kalafiora 3' 35S, funkcjonujący w komórkach roślinnych, zapewniający stabilne zakończenie transkryptu za wprowadzonym genem, do otrzymania materiału roślinnego o podwyższonym poziomie wydzielania enzymu hydrolitycznego 1,3-β-glukanazy, jak określono w zastrz. 3, po czym regeneruje się oraz selekcjonuje transgeniczne rośliny nadprodukujące pożądany enzym. Rysunki

8 8 PL B1 Departament Wydawnictw UP RP Nakład 50 egz. Cena 2,00 zł.