(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11)

Transkrypt

1 R Z E C Z PO SPO L IT A PO LSK A (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 Urząd Patentowy R zeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (5 1 ) IntCl6: G01N 33/53 C12P 21/02 C12N 15/12 (54) Sposób oznaczania ludzkiego białka C i test diagnostyczny do oznaczania ludzkiego białka C (62) N u m er zgłoszenia, z którego nastąp iło wydzielenie: (73) U praw niony z patentu: Polska Akademia Nauk,. Centrum Badań Molekularnych i Makromolekularnych, Łódź, PL Polska Akademia Nauk, Centrum Mikrobiologii i Wirusologii, Łódź, PL (43) Z głoszenie ogłoszono: BUP 09/92 (72) Twórcy wynalazku: (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 11/95 (74) P ełnom ocnik: Iwona Fijałkowska-Gorzka, Łódź, PL Czesław Cierniewski, Łódź, PL Andrzej Płucienniczak, Łódź, PL Grażyna Płucienniczak, Łódź, PL Wojciech J. Stec, Łódź, PL Genowefa Goss, Łódź, PL Andrzej Wilk, Łódź, PL Brodowska Iwona, "Lex- Pat" Biuro Prawno- Patentowe s.c. I. Sposób oznaczania ludzkiego białka C jako antygenu, w próbce zawierającej ten antygen, z zastosowaniem przeciwciał i odczynnika dającego sie oznaczyć analitycznie, znam ienny tym, ze badaną próbkę kontaktuje się z przeciwciałam i dla polipeptydu o wzorze (Y)a-(X)c-A -(Z )b, albo z przeciwciałam i dla polipeptydu o w zorze A -(Z)b, przy czym w pow yzszych wzorach Y oznacza białko nośnikow e kodow ane przez fragment w ektora, korzystnie M et I - Val 444 ß-galaktozydazy i/lub sekw encję kodow aną przez fragment polilinkera, korzystnie Gin, Gly, Leu,, Glu, a oznacza 0 lub 1, X oznacza peptyd łączący, korzystnie Phe, Asp, Pro, c oznacza 0 łub 1, A oznacza sekwencję odpowiadającą fragmentowi ludzkiego białka C, obejmującemu am inokw asy w pozycji łańcucha ciężldego ludzkiego białka C. a mianowicie: -M et-a sp-g iu -Sei Lys 61 s -Lys-Leu-Leu-Val-Arg-Leu-Gly-Glu-Tyr Asp 7 1 : -Leu-Arg-Arg-Trp-Glu-Lys-Trp-Glu-Leu-Asp 81: -Leu-Asp-Ile-Lys-Glu-Val-Phe-Val-His-Pro 91: -Asn-Tyr-Sei Lys-Ser-Thi Thi Asp-Asn-Asp 101: -Ile-Aló-Leu-Leu-His-Leu-Ala-Głn-Pro-Ala PL B1 111: -Thr-Leu-Ser-Gln-Thi Ile-Val-Pro-Ile-. Z oznacza sekw encję uzupełniającą, korzystnie M et i/lub sekwencję kodow aną przez fragm ent polilinkera, b oznacza 0 lub 1, po czym oznacza się wytworzony kompleks antygen-przeciwciało. 4. Sposób oznaczania ludzkiego białka C jako antygenu w próbce zawierającej ten antygen przez w ytw orzenie kom pleksu dw uskładnikow ego antygenu w próbce z pierwszym przeciw ciałem zdolnym do reagowania z tym antygenem, wytworzenie kompleksu trójskładnikowego przez skontaktow anie kompleksu dwuskładnikowego z drugim przeciw ciałem zdolnym do reagowania ze wspom nianym antygenem i wykrywanie obecności kom pleksu trójskładnikow ego za pomocą sygnału tw orzonego przez odczynnik dający się oznaczyć analitycznie lub wyznakowane przeciw ciała przeciw im m unoglobulm owe, znam ienny tym, ze jako jedne z tych przeciw ciał stosuje się przeciw ciała dla polipeptydu (Y)a-(X )c- A-(Z)n, albo przeciw ciała dla polipeptydu o w zorze A-(Z)h, przy czym w powyzszych wzorach Y oznacza białko nośnikow e kodowane przez fragm ent wektora, korzystnie M et 1-Val 444 ß-galaktozydazy i/lub sekw encję kodowaną przez fragment polilinkera, korzystnie Gin, Gly, Leu,, Glu, a oznacza 0 lub 1, X oznacza peptyd łączący, korzystnie Phe, Asp, Pro; c oznacza 0 lub 1, A oznacza sekwencję odpowiadającą fragmentowi ludzkiego białka C, obejmującemu aminokwasy w pozycji łańcucha ciężkiego ludzkiego białka C, a mianowicie. -Met Asp-Glu Sei Lys 6 1 : -Lys-Leu-Leu-Val-Arg-Leu-Gły-Glu-Tyj Asp 71: Leu-Arg-Arg-Trp-Glu-Lys-Trp-Glu-Leu-Asp 81: -Leu-Asp-Ile-Lys-Glu-Val-Phe-Val-His-Pro 91: -Asn-Tyr-Sei Lys-Ser-Thr Tfu Asp-Asn-Asp : -Ile-Ala-Leu-Leu-His-Leu-Ala-Gln-Pro-Ala 111: -Thr Leu-Set Gln-Thi Ile-Val-Pro-Il e-, Z oznacza sekwencję uzupełniającą, korzystnie Met i/lub sekwencję kodowaną przez fragment polilinkera, b oznacza 0 lub 1

2 Sposób oznaczania ludzkiego białka C i test diagnostyczny do oznaczania ludzkiego białka C Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób oznaczania ludzkiego białka C jako antygenu, w próbce zawierającej ten antygen, z zastosowaniem przeciwciał i odczynnika dającego się oznaczyć analitycznie, znamienny tym, że badaną próbkę kontaktuje się z przeciwciałami dla polipeptydu o wzorze (Y)a-(X)c-A-(Z)b, albo z przeciwciałami dla polipeptydu o wzorze A-(Z)b, przy czym w powyższych wzorach Y oznacza białko nośnikowe kodowane przez fragment wektora, korzystnie Met 1-Val 444 ß-galaktozydazy i/lub sekwencję kodowaną przez fragment polilinkera, korzystnie Gin, Gly, Leu,, Glu; a oznacza 0 lub 1, X oznacza peptyd łączący, korzystnie Phe, Asp, Pro; c oznacza 0 lub 1, A oznacza sekwencję odpowiadającą fragmentowi ludzkiego białka C, obejmującemu aminokwasy w pozycji łańcucha ciężkiego ludzkiego białka C, a mianowicie: - M e t A s p G l u S e r L y s 6 1 : - L y s - L e u - L e u - V a l - A r g - L e u - G l y - G l u - T y r Asp 7 1 : - L e u - A r g - A r g - T r p - G l u - L y s - T r p - G l u - L e u - A s p 8 1 : - L e u - A s p - I l e - L y s - G l u - V a l - P h e - V a l H i s - P r o 9 1 : -A s n - T y r Ser L y s - S e r T h r T h r - A s p A s n -A s p 101: - I l e - A l a - L e u - L e u - H i s - L e u - A l a - G l n - P r o - A l a 111: - T h r - L e u - S e r - G l n -Thr I l e - V a l - P r o - I l e -, Z oznacza sekwencję uzupełniającą, korzystnie Met i/lub sekwencję kodowaną przez fragment polilinkera, b oznacza O lub 1, po czym oznacza się wytworzony kompleks antygenprzeciwciało. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się przeciwciała dla fragmentu polipeptydowego otrzymanego przez ekspresję zrekombinowanego DNA. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się zsyntetyzowany chemicznie DNA o sekwencji: AA TTC GAT CCA ATG GAC GAG TCC AAG AAG CTC CTT GTC CGC CTT GGA GAG TAT GAC CTG CGG CGC TGG GAG AAG TGG GAG CTG GAC CTG GAC ATC AAG GAG GTC TTC GTC CAC CCC AAC TAC AGC AAG AGC ACC ACC GAC AAT GAC ATC GCA CTG CTG CAC CTG GCC CAG CCC GCC ACC CTC TCG CAG ACC ATA GTG CCC ATC ATG TA 4. Sposób oznaczania ludzkiego białka C jako antygenu w próbce zawierającej ten antygen przez wytworzenie kompleksu dwuskładnikowego antygenu w próbce z pierwszym przeciwciałem zdolnym do reagowania z tym antygenem, wytworzenie kompleksu trójskładnikowego przez skontaktowanie kompleksu dwuskładnikowego z drugim przeciwciałem zdolnym do reagowania ze wspomnianym antygenem i wykrywanie obecności kompleksu trójskładnikowego za pomocą sygnału tworzonego przez odczynnik dający się oznaczyć analitycznie lub wyznakowane przeciwciała przeciwimmunoglobulinowe, znamienny tym, że jako jedne z tych przeciwciał stosuje się przeciwciała dla polipeptydu (Y )a-(x )c-a-(z)b, albo przeciwciała dla polipeptydu o wzorze A-(Z)b, przy czym w powyższych wzorach Y oznacza białko nośnikowe kodowane przez fragment wektora, korzystnie Met 1-Val 444 ß-galaktozydazy i/lub sekwencję kodowaną przez

3 fragment polilinkera, korzystnie Gin, Gly, Leu Glu; a oznacza 0 lub 1, X oznacza peptyd łączący, korzystnie Phe, Asp, Pro; c oznacza 0 lub 1, A oznacza sekwencję odpowiadającą fragmentowi ludzkiego białka C, obejmującemu aminokwasy w pozycji łańcucha ciężkiego ludzkiego białka C, a mianowicie: - M e t A s p G l u - S e r L y s 6 1 : - L y s - L e u - L e u - V a l - A r g - L e u - G l y - G l u - T y t Asp 7 1 : - L e u - A r g - A r g - T r ρ- G l u - L y s - T r p G l u - L e u - A s p 8 1 : - L e u - A s p - I l e - L y s - G l u - V a l - P h e - V a l - H i s - P r o 9 1 : - A s n - T y r - S e r - L y s - S e r Thr T h r - A s p - A s n - A s p 101: - I l e - A l a - L e u - L e u - H i s - L e u - A l a - G l n - P r o - A l a 111: -Thr Leu-Ser Gln-Thr Ile-Val-Pro-Ile-, Z oznacza sekwencję uzupełniającą, korzystnie Met i/lub sekwencję kodowaną przez fragment polilinkera, b oznacza O lub Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że stosuje się przeciwciała dla fragmentu polipeptydowego otrzymanego przez ekspresję zrekombinowanego DNA. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że stosuje się zsyntetyzowany chemicznie DNA o sekwencji: AA TTC GAT CGA ATG GAC GAG TCC AAG AAG CTG GTT GTC CGG GTT GGA GAG TAT GAC CTG CGG CGG TGG GAG AAG TGG GAG CTG GAC CTG GAC ATG AAG GAG GTC TTC GTC CAC CCC AAC TAC AGG AAG AGG ACC AGG GAC AAT GAC ATG GGA CTG CTG CAC CTG GGG CAG CCC GCC ACC CTG TGG CAG ACC ATA GTG CCC ATG ATG TA 7. Test diagnostyczny do oznaczania ludzkiego białka C z zastosowaniem przeciwciał, znamienny tym, że zawiera przeciwciała dla polipeptydu o wzorze (Y)a-(X )c-a-(z)b, albo przeciwciała dla polipeptydu o wzorze A-(Z)b, przy czym w powyższych wzorach Y oznacza białko nośnikowe kodowane przez fragment wektora, korzystnie Met 1-Val 444 β-galaktozydazy i/lub sekwencję kodowaną przez fragment polilinkera, korzystnie Gin, Gly, L e u,, Glu; a oznacza O lub 1, X oznacza peptyd łączący, korzystnie Phe, Asp, Pro; c oznacza O lub 1, A oznacza sekwencję odpowiadającą fragmentowi ludzkiego białka C, obejmującemu aminokwasy w pozycji łańcucha ciężkiego ludzkiego białka C, a mianowicie: -Met-Asp-Glu-Ser-Lys 61: -Lys-Leu-Leu-Val-Arg-Leu-Gly-Glu-Tyr-Asp 71: -Leu-Arg-Arg-Trp-Głu-Lys-Trp-Glu-Leu-Asp 31: -Leu-Asp-Ile-Lys-Glu-Val-Phe-Val-His-Pro 91: -Asn-Tyr-Ser-Lys-Ser-Thr Thr-Asp-Asn-Asp 101: -Ile-Ala-Leu-Leu-His-Leu-Ala-Gln-Pro-Ala 111: Thr Leu-Ser-Gln-Thr-Ile-Val-Pro-Ile- Z oznacza sekwencję uzupełniającą, korzystnie Met i/lub sekwencję kodowaną przez fragment polilinkera, b oznacza 0 lub 1, ewentualnie unieruchomione na nośniku lub rozpuszczone w fazie ciekłej.

4 Test według zastrz. 7, znam ienny tym, że zawiera przeciwciała związane z odczynnikiem dającym oznaczyć się analitycznie. 9. Test według zastrz. 8, znam ienny tym, że zawiera przeciwciała dla fragmentu polipeptydowego otrzymanego przez ekspresję zrekombinowanego DNA. 10. Test według zastrz. 9, znam ienny tym, że zawiera zsyntetyzowany chemicznie DNA o sekwencji: AA TTC BAT CCA ATB BAC BAB TCC AAS AAS CTC CTT GTC CGC CTT GBA GAG TAT BAC CTB CGG CBC TGG GAG AAG TGG GAG CTG GAC CTG GAC ATC AAG GAG GTC TTC GTC CAC CCC AAC TAC AGC AAG AGC ACC ACC GAC AAT GAC ATC GCA CTG CTG CAC CTG GCC CAG CCC GCC ACC CTC TCG CAG ACC ATA GTG CCC ATC ATG TA 11. Test diagnostyczny do oznaczania ludzkiego białka C z zastosowaniem przeciwciał, znamienny tym, że zawiera pierwsze przeciwciała reagujące specyficznie z ludzkim białkiem C oraz układ do wykrywania kompleksu antygen-przeciwciało zawierający drugie przeciwciała zdolne do specyficznego reagowania z ludzkim białkiem C i ewentualnie przeciwciała przeciwimmunoglobulinowe, przy czym jedne z tych przeciwciał stanowią przeciwciała dla polipeptydu o wzorze (Y)a-(X )c-a-(z)b, albo przeciwciała dla polipeptydu o wzorze A-(Z)b, przy czym w powyższych wzorach Y oznacza białko nośnikowe kodowane przez fragment wektora, korzystnie Met 1-Val 444 ß-galaktozydazy i/lub sekwencję kodowaną przez fragment polilinkera, korzystnie Gin, Gly, Leu,, Glu; a oznacza 0 lub 1, X oznacza peptyd łączący, korzystnie Phe, Asp, Pro; c oznacza 0 lub 1, A oznacza sekwencję odpowiadającą fragmentowi ludzkiego białka C, obejmującemu aminokwasy w pozycji łańcucha ciężkiego ludzkiego białka C, a mianowicie: - M e t A sp G l u S e r - L y s 6 1 : - L y s - L e u - L e u - V a l - A r g - L e u - G l y - G l u T yr Asp 7 1 : - L e u - A r g A r g T r p - G l u - L y s - T r p - G l u - L e u - A s p 3 1 : - L e u - A s p - I l e - L y s - G l u - V a l - P h e - V a l - H i s - P r o 9 1 : - A s n - T y r S e r - L y s - S e r - T h r - T h r A s p -A s ri-a s p 101: - I l e - A l a L e u - L e u H i s - L e u - A l a - G l n - P r o - A l a 111: - T h r - L e u S e r - G ln - T h r I l e V a l - P r o - Ι l e -, Z oznacza sekwencję uzupełniającą, korzystnie Met i/lub sekwencję kodowaną przez fragment polilinkera, b oznacza 0 lub Test według zastrz. 11, znamienny tym, że zawiera dodatkowo nośnik stały dla związania próbki zawierającej antygen. 13. Test według zastrz. 11, znamienny tym, że zawiera pierwsze przeciwciała związane z fazą stałą lub ciekłą. 14. Test według zastrz. 11, znamienny tym, że zawiera drugie przeciwciała związane z odczynnikiem dającym oznaczyć się analitycznie. 15. Test według zastrz. 11, znamienny tym, że zawiera przeciwciała dla fragmentu polipeptydowego otrzymanego przez ekspresję zrekombinowanego DNA.

5 Test według zastrz. 15, znamienny tym, że zawiera zsyntetyzowany chemicznie DNA o sekwencji: AA TTC GAT CCA ATG GAC GAG TCC AAG AAG CTC CTT GTC CGC CTT GGA GAG TAT GAC CTG CGG CGC TGG GAG AAG TGG GAG CTG GAC CTG GAC ATC AAG GAG GTC TTC GTC CAC CCC AAC TAC AGC AAG AGC ACC ACC GAC AAT GAC ATC GCA CTG CTG CAC CTG GCC CAG CCC GCC ACC CTC TCG CAG ACC ATA GTG CCC ATC ATG TA * * * Przedmiotem wynalazku jest sposób oznaczania ludzkiego białka C jako antygenu i test do oznaczania ludzkiego białka C, zdolnego do produkcji przeciwciał reagujących specyficznie z ludzkim białkiem C. Białko C należy do rodziny białek zależnych od witaminy K. Aktywne białko C jest silnym czynnikiem antykoagulacyjnym działającym na poziomie czynników Va i VIII podczas krzepnięcia. Ma także swój udział w procesie fibrynolizy skrzepu poprzez wpływ na poziom aktywatora plazminogenu we krwi (P. C. Comp, R. R. Nixon, C. T. Esmon, Blood, 63, 1984, 15-21). Niedobór białka C zaobserwowano w przypadkach głębokiej zakrzepicy żylnej i tętniczej, zatoru płucnego, zawału mięśnia sercowego, zespołu rozsianego krzepnięcia śródnaczyniowego i innych (R. A. Malar, Seminars in Thromb. Hemost., 11, nr 4, 1985, ). Poziom białka C oznacza się kilkoma metodami, które podzielić można na trzy grupy. Do pierwszej grupy należą metody wykorzystujące antykoagulacyjne właściwości białka. Jedna z nich polega na oznaczaniu białka C przy użyciu trombomoduliny z płuc królika do hamowania aktywności prokoagulacyjnej trombiny i jednoczesnego stymulowania aktywności białka C. Tak zakty wowane białko C wpływa na czas tworzenia skrzepu przy udziale tromboplastyny aktywowanej kaoliną i kefaliną (Kaolin-cephalin activated Partial Thromboplastin Time-PTT, R. B. Francis, Thromb. Res., 37, 1986, ). Różne odmiany tej metody wykorzystują wpływ aktywnego białka C na tworzenie się skrzepu po aktywacji trombinowej (H. Vinazzer, U. Pengraz, Thromb. Res., 46, 1987, 1-8), gdzie do aktywacji trombiny używa się różnych czynników takich jak kaolina, cefaloplastyna, aktyna czy Pathrombin. Bada się także udział białka C w tworzeniu skrzepu pod wpływem protrombiny i prokonwertyny (Prothrombin-prokonvertin time, P-P, R. B. Francis, Thromb. Res., 37, 1986, ). Zauważono również, że białko C powoduje zmniejszenie liczby miejsc receptorowych dla czynnika Xa i wpływa na zdolność płytek do przekształcania protrombiny (Platelet Prothrombin-Converting Activity, P. C. Comp, C. T. Esmon, Blood, 54, nr 6, 1979, ). W wymienionych metodach ilość aktywnego białka C w próbie badanej odczytuje się z krzywych kalibracyjnych. Druga grupa metod oznaczania białka C wykorzystuje jego właściwości amidolityczne. Aktywne białko C powoduje rozkład substratu barwnego, co można badać spektrofotometrycznie. Jako substraty służą tu: pglu-pro-arg-mna, S-2222, S-2238, S-2251, S-2266, S-2302, S-2314, S-2366, S-2444 (H. Vinazzer, U. Pengraz, Thromb. Res., 46, 1987, 1-8). W tej grupie metod do aktywacji białka C używa się kompleksu trombina-trombomodulina (P. C. Comp, Blood, 23, 1987, 86-92), albo pewnych frakcji otrzymywanych z jadów węży (H. Vinazzer, U. Pengraz, Thromb. Res., 46, 1987, 1-8) oraz (W. Kisiel, Clin. Invest., 4, 1979, ). Wśród stosowanych metod immunologicznych oznaczania poziomu białka C jako antygenu wyróżnia się kilka rodzajów. Należą do nich metoda radioimmunologiczna polegająca na

6 wiązaniu białka C z przeciwciałami znakowanymi radioaktywnym jodem (R. M. Bertina, A. W. Broeckmans, et al., Thromb. Haemost., 1982), metoda immunoradiometryczna (R: M. Bertina, A. W. Broeckmans, et al., Thromb. Haemost., 57, nr 1, 1987, ), oraz testy enzymoimmunologiczne (H. Vinazzer, U. Pengraz, Thromb. Res., 46, 1987, 1-8), czy metody immunoblotingu (M. Heeb, P. Schwartz, Thromb. Res., 52, 1988, 33-43). Białko C stosowane w wymienionych metodach służące do immunizacji, a dalej do uzyskania przeciwciał na ogół izoluje się z plazmy ludzkiej za pomocą absorpcji na cytrynianie baru, elucji, frakcjonowaniu w siarczanie amonu, chromatografii, a następnie elektroforezy preparatywnej w żelu poliakryloamidowym. Wydajność metody wynosi 5 mg białka z 15 litrów plazmy, a stężenie białka na poszczególnych etapach oczyszczania oznacza się metodą aktywacji trombinowej (PTT) (W. Kisiel, J. Clin. Invest., 64, 1979, ). Opisana wyżej metoda otrzymywania białka C jest czasochłonna, skomplikowana i kosztowna, co w znacznym stopniu zawyża koszt całego testu. Otrzymywanie całej cząsteczki białka metodą biotechnologiczną jest także trudne do przeprowadzenia i kosztowne. Wynalazek pozwala na oznaczanie ilościowe ludzkiego białka C z dużą dokładnością w oparciu o metodę, w której stosuje się odpowiedni fragment polipeptydowy. Stwierdzono, że można wykorzystać pełną reakcję krzyżową w teście immunologicznym przeciwciał otrzymanych dla fragmentu białka oraz dla całej cząsteczki białka C. W odróżnieniu od znanych metod, zastosowany w sposobie według wynalazku fragment polipeptydowy, a nie całe białko, może służyć do produkcji swoistych przeciwciał rozpoznających w ten sam sposób zarówno ten fragment jak i rodzime białko C. Fragment ten również stosuje się do uzyskania krzywej wzorcowej oraz do oznaczania przeciwciał dla ludzkiego białka C. Sposób oznaczania ludzkiego białka C jako antygenu polega na tym, ze badaną próbkę, korzystnie materiału biologicznego kontaktuje się z przeciwciałami dla polipeptydu o wzorze (Y)a-(X)c-A-(Z)b, albo z przeciwciałami dla polipeptydu o wzorze A-(Z)b, przy czym w powyższych wzorach Y oznacza białko nośnikowe kodowane przez fragment wektora, korzystnie Met 1-Val 444 ß-galaktozydazy i/lub sekwencje kodowaną przez fragment polilinkera, korzystnie Gin, Gly, Leu Glu, a oznacza 0 lub 1, X oznacza peptyd łączący, korzystnie Phe, Asp, Pro; c oznacza 0 lub 1, A oznacza sekwencję odpowiadającą fragmentowi ludzkiego białka C, obejmującemu aminokwasy w pozycji łańcucha ciężkiego ludzkiego białka C, a mianowicie: - M e t - A s p - G l u - S e r - L y s 6 1 : - L y s - L e u - L e u - V a l - A r g - L e u - G l y - G l u - T y f A sp 7 1 : L e u - A r g - A r g - T r p - G l u - L y s - T r p - G l u - L e u - A s p 31: -Leu-Asp-11e-Lys-Glu-Val-Phe-Val-His-Pro 9 1 : - A s n - T y r - S e r - L y s - S e r Thr Thr A s p - A s n - A s p 101: - I l e - A l a - L e u - L e u - H i s - L e u - A l a - G l n - P r o - A l a 111: - T h r - L e u - S e r G ln - T h r I l e - V a l - P r o - I l e -, Z oznacza sekwencję uzupełniającą, korzystnie Met i/lub sekwencję kodowaną przez fragment polilinkera, b oznacza O lub 1, po czym oznacza się wytworzony kompleks antygenprzeciwciało. W alternatywnej metodzie najpierw wytwarza się kompleks dwuskładnikowy antygenu z pierwszym przeciwciałem zdolnym do reagowania ze wspomnianym antygenem, po czym wytwarza się kompleks trójskładnikowy przez skontaktowanie kompleksu dwuskładnikowego z drugim przeciwciałem zdolnym do reagowania ze wspomnianym antygenem, przy czym jako jedne z tych przeciwciał stosuje się przeciwciała dla polipeptydu o wzorze (Y )a-(x )c-a-(z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, albo przeciwciała dla polipeptydu o wzorze A-(Z)b. Obecność kompleksu trójskładnikowego wykrywa się za pomocą sygnału tworzonego

7 przez odczynnik dający się oznaczyć analitycznie lub znakowanego izotopowo przeciwciała immunoglobulinowego. Zgodnie z wynalazkiem badaną próbkę, w której wykrywa się i oznacza antygen, tj. ludzkie ciało C, kontaktuje się i inkubuje z przeciwciałami reagującymi specyficznie z tym antygenem. Utworzenie kompleksu dwuskładnikowego antygen-przeciwciało wykrywa się i oznacza za pomocą środka wykrywającego i sygnalizującego reakcję immunologiczną, korzystnie przeciwciało reagujące specyficznie z białkiem C znakowane odczynnikiem dającym się oznaczyć analitycznie. Środek wykrywający i sygnalizujący reakcję immunologiczną może być obecny podczas inkubowania antygenu z przeciwciałem. Można na przykład bezpośrednio wyznakować przeciwciała kontaktowane z badaną próbką i po przemyciu produktu reakcji uzyskać sygnał. Środkiem jest wówczas sam znacznik. Środek wykrywający można też dodać dopiero po wytworzeniu kompleksu dwuskładnikowego i usunięciu nieprzereagowanego materiału. Wykrywanie i oznaczanie prowadzi się wówczas następująco: dwuskładnikowy kompleks antygenprzeciwciało po odmyciu kontaktuje się z drugim przeciwciałem reagującym specyficznie z białkiem C, przy czym jako jedno z tych przeciwciał stosuje się przeciwciała dla polipeptydu o wzorze (Y)a-(X)c-A-(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie; albo przeciwciała dla polipeptydu o wzorze A-(Z)b o tym samym znaczeniu symboli. Pozostałym (pierwszym lub drugim) przeciwciałem może być na przykład przeciwciało dla całej cząsteczki białka C. Otrzymuje się wówczas kompleks trójskładnikowy przeciwciało-antygen-przeciwciało. Drugie przeciwciała mogą być znakowane odczynnikiem dającym się oznaczyć analitycznie. Alternatywnie, jako środek stosuje się układ dwuskładnikowy zawierający drugie przeciwciała tworzące kompleks trójskładnikowy, który wykrywa się za pomocą przeciwciała przeciwimmunologlobulinowego. Do znakowania można stosować enzym, biotynę, izotop promieniotwórczy, korzystnie 125J lub inne znane odczynniki. Wykrywanie i oznaczanie prowadzi się za pomocą sygnału wytwarzanego przez znacznik. Badaną próbkę, oznaczany antygen lub jedno z przeciwciał, korzystnie pierwsze, unieruchamia się na stałym nośniku takim jak bibuła nitrocelulozowa lub płytka plastikowa i inne. Wykrywanie i oznaczanie dogodnie prowadzi się za pomocą testu diagnostycznego według wynalazku, który zawiera przeciwciała dla polipeptydu o wzorze (Y)a-(X)c-A-(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, albo przeciwciała dla polipeptydu o wzorze A-(Z)b o tym samym znaczeniu symboli, ewentualnie unieruchomione na stałym nośniku lub rozpuszczone w fazie ciekłej. Przeciwciała są związane z odczynnikiem dającym się oznaczyć analitycznie. Alternatywnie test diagnostyczny zawiera pierwsze przeciwciała reagujące specyficznie z ludzkim białkiem C oraz układ do wykrywania kompleksu antygen-przeciwciało zawierający drugie przeciwciała zdolne do specyficznego reagowania z ludzkim białkiem C i ewentualnie przeciwciała przeciwimmunoglobulinowe, przy czym jedne z tych przeciwciał stanowią przeciwciała dla polipeptydu o wzorze (Y)a-(X)c-A-(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, albo przeciwciała dla polipeptydu o wzorze A-(Z)b o tym samym znaczeniu symboli. Korzystnie przeciwciała są związane z fazą stałą lub ciekłą. Test może dodatkowo zawierać nośnik stały i ciekły dla związania próbki zawierającej antygen. Układ do wykrywania kompleksu antygen-przeciwciało zawiera drugie przeciwciała bezpośrednio związane z odczynnikiem dającym się wykryć analitycznie, albo też układ ten zawiera trzecie przeciwciała przeciwimmonoglobulinowe związane ze znacznikiem. W sposobie i testach do oznaczania ludzkiego białka C można stosować przeciwciała otrzymane dotychczas znanymi metodami. Korzystnie jednak stosuje się przeciwciała wytworzone z zastosowaniem polipeptydu zdolnego do produkcji przeciwciał reagujących specyficznie z ludzkim białkiem C oraz z tym polipeptydem i/lub reagującgeo specyficznie z przeciwciałami dla ludzkiego białka C oraz z przeciwciałami dla tego polipeptydu. Sposób wytwarzania takiego polipeptydu polega na tym, że zrekombinowanym wektorem zawierającym DNA kodujący polipeptyd o wzorze (Y)a-(X)c-A-(Z)b transformuje się komórki gospodarza bakteryjnego, które hoduje się i wyodrębnia z nich białko o wzorze (Y)a-(X)c-A-(Z)b, które ewentualnie rozbija się na fragmenty o wzorach (Y)a-(X)C- oraz -A-(Z)b, przy czym w

8 powyższych wzorach Y oznacza białko nośnikowe kodowane przez fragment wektora, korzystnie Met 1-Val 444 ß-galaktozydazy i/lub sekwencję kodowaną przez fragment polilinkera, korzystnie Gin, Gly, Leu,, Glu; a oznacza 0 lub 1, X oznacza peptyd łączący, korzystnie Phe, Asp, Pro; c oznacza 0 lub 1, A oznacza sekwencję odpowiadającą fragmentowi ludzkiego białka C, obejmującemu aminokwasy w pozycji łańcucha ciężkiego ludzkiego białka C, a mianowicie: - M e t - A s p - G l u - S e r - L y s 6 1 : - L y s - L e u - L e u - V a l - A r g - L e u - G l y - G l u - T y r A sp 7 1 : - L e u - A r g - A r g - T r p - G l u - L y s - T r p - G l u - L e u - A s p 3 1 : - L e u - A s p - I l e - L y s - G l u V a l - P h e - Va l - H i s - P r o 9 1 : - A s n - T y r S e r - L y s - S e r T h r T h r - A s p - A s n - A s p 101: - I l e - A l a - L e u - L e u - H i s - L e u - A l a - G l n - P r o - A l a 111: Thr-Leu Ser Gin Thr Ile Val-Pro I le, Z oznacza sekwencję uzupełniającą, korzystnie Met i/lub sekwencję kodowaną przez fragment polilinkera, b oznacza 0 lub 1. W metodzie tej stosuje się zrekombinowany wektor zawierający DNA kodujący polipeptyd o wzorze jak wyżej. Korzystnie stosuje się wektor zawierający zsyntetyzowany chemicznie DNA odpowiadający cdna o sekwencji: AA TTC GAT CCA ATG GAC GAG TCC AAG AAG CTC CTT GTC CGC CTT GGA GAG TAT GAC CTG CGG CGC TGG GAG AAG TGG GAG CTG GAC CTG GAC ATC AAG GAG GTC TTC GTC CAC CCC AAC TAC AGC ACC ACC GAC AAT GAC AAT GAC ATC GCA CTG CTG CAC CTG GCC CAG CCC GCC ACC CTC TCG CAG ACC ATA GTG CCC ATC ATG TA Stosowany w powyższym sposobie zrekombinowany wektor do klonowania i/lub ekspresji w komórkach gospodarza, otrzymuje się łącząc znanymi metodami wektor z fragmentem D N A kodującym polipeptyd o wzorze (X )c-a-(z)b, w którym symbole mają wymienione wyżej znaczenie. Wytworzony fragment polipeptydowy ma dużą hydrofilowość i obejmuje aminokwasy w pozycjach łańcucha ciężkiego ludzkiego białka C o sekwencji określonej symbolem A. Ze względu na powierzchniowe ułożenie, region ten może zawierać determinanty antygenowe. Jest to także obszar o specyficznej sekwencji aminokwasowej, w odróżnieniu od pozostałych obszarów, które wykazują znaczne podobieństwo do innych białek z grupy zależnych od witaminy K. Charakterystyczne dla centrum aktywnego proteaz serynowych są aminokwasy: His 54, Asp 100 i Ser 203 łańcucha ciężkiego (G. Plutzki et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 83, 1984, ). Otrzymany fragment stanowi część centrum katalitycznego. Sekwencja nukleotydowa cdna dla białka C jest znana (R. J. Beckman et al., Nucleic Acid Res., 13, nr 14, 1985, ). Zastosowany w sposobie wytwarzania polipeptydu gen kodujący polipeptyd o określonym wzorze (X )c-a-(z)b można skonstruować z fragmentów oligonukleotydowych zsyntetyzowanych chemicznie. Fragmenty oligonukleotydowe można zsyntetyzować chemicznie na nośniku poprzez kolejne przyłączanie nukleozydów z zablokowanymi grupami czynnymi. Korzystnie do ochrony funkcji aminowej stosuje się grupę izopropoksyacetylową, co przedstawiono w opisie

9 patentowym polskim nr Fragmenty Oligonukleotydowe zsyntetyzowane chemicznie poddaje się enzymatycznej reakcji kinazowania, w trakcie której wprowadza się fosforan na końcach 5 za pomocą kinazy polinukleotydowej i ATP. Kinazowane oligonukleotydy liguje się in vitro w dwuniciowe odcinki ograniczone sekwencjami rozpoznawanymi przez enzymy restrykcyjne, korzystnie Eco RI i Hind III. Zligowane odcinki namnaża się w wektorze do klonowania, stosując właściwe miejsce restrykcyjne polilinkera. Stosować można różne wektory np. plazmidowe, fagowe, przy czym korzystne są plazmidy, np. plazmid puc-19. Sklonowane wektory z odcinkami DNA namnaża się w komórkach gospodarza, którymi mogą być bakterie, drożdże itp. Wektory z wklonowanymi odcinkami izoluje się, a następnie odcinki odzyskuje się przez trawienie restrykazami i rozdzielenie otrzymanych odcinków elektroforetycznie. Odzyskane odcinki włącza się do wektora ekspresyjnego po uprzednim.strawieniu go odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi. Na tym etapie stosuje się różne wektory ekspresyjne, np. plazmidowe, fagowe i inne. Przykładowo plazmid pwr zawiera gen kodujący ß-galaktozydazę i gen oporności na ampicylinę. Komórki gospodarza, np. bakterii, transformowane zrekombinowanym wektorem, są po namnożeniu źródłem polipeptydu o wzorze (Y)a-(X )c-a-(z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, albo fragmentu ludzkiego białka C. Fragment ewentualnie odcina się od polipeptydu. Wytworzony w ten sposób fragment białka C, ewentualnie w połączeniu z fragmentem białka nośnikowego, np. ß-galaktozydazy, można stosować do otrzymania przeciwciał różnymi znanymi metodami, a także do wykreślania krzywej wzorcowej niezbędnej do ilościowego oznaczania białka C. Stosując tak otrzymany polipeptyd można wytworzyć przeciwciała poliklonalne reagujące specyficznie z białkiem C, w ten sposób, że immunizuje się zwierzęta polipeptydem o wzorze (Y)a-(X)c-A-(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, albo polipeptydem o wzorze A-(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, pobiera się krew i izoluje przeciwciała. Wytworzone w ten sposób przeciwciała można zastosować w sposobie według wynalazku do oznaczania ludzkiego białka C jako antygenu oraz przeciwciał do tego białka oraz do wytworzenia testów do ich oznaczania. Sposób wykrywania przeciwciał dla białka C w badanej próbce, na przykład w materiale biologicznym, polega na tym, że polipeptyd o wzorze (Y)a-(X )c-a-(z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, kontaktuje się z badaną próbką aż do związania przeciwciał, po czym wykrywa się produkt reakcji immunologicznej. Korzystnie reakcję prowadzi się w roztworze. Dogodnie jest stosować test do wykrywania przeciwciał anty-białko C zawierający polipeptyd o określonym wyżej wzorze. Polipeptyd jest związany z odczynnikiem dającym się wykryć analitycznie. Do znakowania można stosować znane metody. Celem uproszczenia, w opisie i przykładach używane są następujące skróty: A: adenina C: cytozyna G: guanina T: tymina Ala: alanina Arg: arginina Asn: asparagina Asp: kwas asparaginowy Gin: glutamina Glu: kwas glutaminowy His: histydyna Ile: izoleucyna Leu: leucyna Lys: lizyna Met: metionina Phe: fenyloalanina

10 Pro: Ser: Thr: Trp: Tyr: Val: DNA: ATP: EDTA: SDS: prolina seryna treonina tryptofan tyrozyna walina kwas deoksyrybonukleinowy trójfosforan adenozyny kwas etylenodwuaminoczterooctowy siarczan dodecylu sodu Bufor Eco RI: 100 mm Tris-HCl ph 7,5 1 M NaCl 10 mm ß-merkaptoetanol Bufor do kinazowania: 0,7 M tris-hcl ph 7,6 0,1 M M gc l2 50 mm ditiotreitol Bufor ligacyjny: 0;66 M Tris -HCl ph 7,6 50 mm MgCl2 50 mm ditiotreitol 10 mm ATP Bufor do ekstrakcji: 50 mm Tris-HCl ph 8,0 300 mm octanu sodu 0,2% SDS 4 mm EDTA Pożywka LB: 10 g bacto trypton 5g ekstrakt drożdży 5g NaCl rozpuszczone w 1 1 H2O Bufor TE: 10 mm Tris-HCl ph 8,0 1 mm EDTA Bufor z SDS: 10g Tris-HCl ph 8,0 7-7g glicyny 1g SDS rozpuszczone w 1 1 H2O Bufor do lizy komórek: Bufor RI: Bufor RII Bufor RIII PMSF: PBS: DTT: ELISA: EDTA: 150 mg Tris 400 mg SDS 1 ml ß-merkaptoetanol 2 ml glicerolu, 7 ml wody 50 mm glukoza 10 mm EDTA 25 mm Tris-HCl ph 8,0 4 mg/ml Iizozym 0,2 M NaOH 1 % SDS 60 ml 5 M kwasu octowego fluorek kwasu fenylometylosulfonowego ml 0.2 Na2HPO ml 0.2 M NaH2PO4 w % NaCl ditiotreitol test immunoenzymatyczny wersenian sodowy

11 Na załączonych rysunkach fig. 1 przedstawia wykres hydrofobowości łańcucha polipeptydowego białka C, fig. 2 przedstawia sekwencję fragmentu genu ludzkiego białka C rozłożoną na fragmenty syntetyzowane chemicznie, fig. 3 i fig. 4 podają schematy konstrukcji genu dla białka C sklonowanego w wektorze rekombinacyjnym puc 19 i ekspresyjnym pw R 450.1, fig. 5 przedstawia rozdział elektroforetyczny w żelu poliakryloamidowym z SDS ekstraktów białkowych otrzymanych z komórek E.coli oraz oczyszczonego kompleksu ß-galaktozydaza-białko C: 1) ciałka inkluzyjne rozpuszczone w zbuforowanym 6 M roztworze mocznika, 2) oczyszczone białko hybrydowe ß-galaktozydaza-białko C, fig. 6 przedstawia schemat rozbica kompleksu białkowego o wzorze (Y )a-(x )c-a-(z)b, i oczyszczenia fragmentu peptydowego o wzorze A-(Z)b. Produkty degradacji kompleksu beta-galaktozydaza-białko C stanowią mieszaninę peptydów o długości 3 do 125 aminokwasów. Fragment białka C składa się z 65 aminokwasów i izoluje się go przy pomocy HPLC. Wynalazek jest bliżej wyjaśniony w przykładach wykonania. Przykład I. Etap 1. Synteza oligonukleotydów Syntezę chem iczną oligonukleotydów przeprow adza się stosując m etodę amidofosforynową syntezy na stałym nośniku (M. Gait, "Oligonucleotides synthesis - a practical approach., IRL Press, 1984). Jako nośnik użyto szkło o kontrolowanej porowatości typu LCA-CPG ze związaną pierwszą jednostką nukleozydową. Jednostka ma przyłączoną na końcu 5 -OH deoksyrybozy blokującą grupę kwasolabilną - dimetoksytrityl (DMT, którą usuwa się w środowisku kwaśnym). Odsłonięta w ten sposób grupa 5 -OH jednostki nukleozydowej przyłącza prekursor kolejnej jednostki: amidofosforyn. Przy udziale jodu w obecności wody dokonuje się utlenienia grupy fosforynowej do fosforanu. Kolejnym etapem jest usunięcie DMT z przyłączonej jednostki, tym samym cykl rozpoczyna się na nowo. Ponieważ wydajność poszczególnych etapów fosforylowania wynosi 99.7%, w celu usunięcia pozostałych 0.3% jednostek z wolnymi grupami 5 -OH stosuje się tzw. "capping" tj. zablokowanie pomyłkowych sekwencji przez acetylowanie bezwodnikiem octowym w obecności aktywatorów. Po utworzeniu żądanego oligonukleotydu odcina się go od złoża 29% amoniakiem, oczyszcza elektroforetycznie, następnie odsala metodą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (Waters C-18 RP, 10 μ m ). Oligonukleotydy przechowuje się w porcjach po około 0,5 OD. Etap 2. Konstrukcja wektora rekombinacyjnego i wektora ekspresyjnego. A. Kinazowanie i ligacja odcinków DNA. Fragmenty oligonukleotydowe C 1-C10 rozpuszcza się w wodzie tak, aby w 5 μl roztworu znajdowało się 2 μg kwasu. Miesza się po 4 μl fragmentów C 1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9 i C 10, (fig. 2) i do mieszaniny dodaje po 5 μl 20 mm ATP, 2 μl buforu do kinazowania, 2 μl wody i 1 μl ligazy polinukleotydowej, inkubuje przez 2 godziny w temperaturze 37 C, następnie podgrzewa do temperatury 65 C przez 10 minut, a potem ochładza. Po fosforylacji dodaje się 3 μg PUC trawionego uprzednio enzymami Eco RI i Hind III, 0,5 μl ligazy faga T4 i zostawia na 12 godzin w temperaturze 4 C. W celu sprawdzenia czy fragmenty genów połączyły się z plazmidem, mieszaninę ligacyjną z barwnikiem nanosi się na 6% żel poliakryloamidowy i rozdziela elektroforetycznie. Po wybarwieniu bromkiem etydyny wycina się odpowiednie pasmo w celu wyizolowania plazmidu rekombinacyjnego. Izolowany plazmid poddaje się hydrolizie enzymatycznej. B. Hydroliza enzymami. Do rozpuszczonego DNA (80 μl) dodaje się 10 x 10 μl stężonego buforu EcoRI, 2U restryktazy EcoRI (firmy Pharmacia) oraz wody do objętości 100 μl. Mieszaninę inkubuje się w temperaturze 37 C przez przez 2 godziny. Po tym czasie DNA strąca się etanolem, dodając 3 objętości alkoholu etylowego (99.8%), wymraża się w -20 C przez 5 minut, a następnie

12 odwirowywuje się przy 15 tys. obr. przez 5 minut. Osad rozpuszcza się w 20 μl buforu TE. Postępuje się w identyczny sposób trawiąc restryktazą Hind III. C. Rozdział elektroforetyczny. W celu sprawdzenia czy zligowane fragmenty DNA mają odpowiednią długość, rozdziela się je w 8% żelu poliakryloamidowym z SDS w TBE. Rozdział prowadzi się przy napięciu 130 V w ciągu 3 godzin. Żel wybarwia się bromkiem etydyny (0,5 μg/ml - firmy Serva) przez 20 minut w temperaturze pokojowej, następnie płucze dwukrotnie w wodzie destylowanej. Rozdzielone produkty obserwuje się po krótkim naświetlaniu lampą UV. Dla oceny wielkości fragmentów DNA, podczas elektroforezy używa się następujących wzorców: PUC 19 trawiony Msp i PUC 19 trawiony Bsp RI. Jeśli zligowane fragmenty posiadają oczekiwaną długość, po elektroforezie sprawdzającej wykonuje się elektroforezę preparatywną i odzyskuje'się odcinek DNA, który następnie liguje się z plazmidem pwr trawionym Eco RI i Hind III. D. Sprawdzenie sekwencji klonowanych fragmentów. W celu upewnienia się czy sekwencja sklonowanego fragmentu jest prawidłowa, fragment sekwencjonuje się metodą Maxama i Gilberta (Methods in Enzymology 65, , 1989). E. Ligacja zrekombinowanego DNA z plazmidem ekspresyjnym pwr Odcinek DNA odzyskany w etapie 2.C dodaje się do 3 μg pwr uprzednio trawionego enzymami Eco RI i Hind III, 0.5 μl ligazy faga T4 i zostawia się na 12 godzin w temperaturze 4 C. Po inkubacji część mieszaniny rozdziela się elektroforetycznie. Po sprawdzeniu, że odcinek DNA połączył się z plazmidem, resztę mieszaniny używa się do transformacji komórek. Uzyskuje się w ten sposób zrekombinowany plazmid pw-b.c. Etap 3. Hodowla komórek transformowanych plazmidem PWR 450. A. Przygotowanie kompetentnych komórek. Z płytki z posianymi bakteriami DH5, pobiera się jedną kolonię, którą szczepi się na 5 ml pożywki LB. Bakterie hoduje się w temperaturze 37 C przez 18 godzin. Do 100 ml pożywki LB dodaje się 2 ml otrzymanej zawiesiny i prowadzi się hodowlę do gęstości optycznej OD 600=0.3. Zawiesinę bakterii odwirowywuje się (5 tys. obr., 20 min), a osad bakteryjny ochładza, zawiesza w 50 ml buforu SB i umieszcza w temperaturze 0 C. Zwirowuje się jak wyżej, a osad zawiesza w 1/12 objętości-wyjściowej buforem SB. Przeprowadza się 20 minut inkubację w temperaturze 0 C. Po tym czasie z zawieszonych komórek pobiera się do sterylnych probówek po 200 μl zawiesiny komórek i inkubuje przez 30 minut w 0 C, a następnie dodaje się 7 μl DTT i plazmidy (20 μl). Inkubuje się w lodzie (0 C) przez 30 minut, a następnie 45 sekund w 45 C. Ochładza się w lodzie i dodaje 800 μl pożywki LB. Po 1 godzinnej inkubacji w 37 C, komórki bakteryjne posiewa się na płytki: wylewa się 200 μl mieszaniny ligacyjnej na płytkę i inkubuje w temperaturze 37 C przez 18 godzin. B. Analiza otrzymanych transformantów. Po 18 godzinach hodowli na płytce z wysianą mieszaniną transformacyjną obserwuje się pojedyncze kolonie. Do dalszej analizy wybiera się 10 kolonii. 5 ml pożywki szczepi się pojedynczymi koloniami i hoduje w 37 C przez 18 godzin, a następnie izoluje plazmidowym DNA. Preparatyka plazmidowego DNA z 5 ml pożywki przebiega w następujący sposób: Bakterie odwirowuje się (5 tys. obr. 5 min). Osad bakteryjny zawiesza się w 200 μl buforu RI i przetrzymuje przez 5 minut w temperaturze 0 C, a następnie dodaje 400 μl RII i 300 μl RIII (0 C). Całość odwirowywuje się (15 tys. obr., 5 min.), supernatant przenosi się znad osadu do nowej probówki i dodaje 2,5 objętości izopropanolu. Wymraża się w -20 C, odwirowywuje, osad płucze 70% etanolem i suszy w próżni. Osad rozpuszcza się w 200 μl TE i dodaje 20 μl roztworu RNazy o stężeniu 1 mg/ml. Inkubuje się 30 minut w 37 C. Dodaje się 200 μl fenolu. Zbiera się fazę wodną i dodaje 200 μl mieszaniny chloroform/alkohol izoamylowy w proporcjach 24:1. Odwirowywuje się ponownie, zbiera supernatant, czynność powtarza się jeszcze

13 raz. Do fazy wodnej dodaje się 0,1 objętości 3M octanu sodu (ph 5,2) oraz 2,5 objętości etanolu i wymraża 30 minut w temperaturze -20 C, a następnie odwirowywuje (15 tys. obr., 15 min.), osad przemywa 70% etanolem i suszy. Osad plazmidowy DNA rozpuszcza się w 40 μl buforu TE. W celu wybrania klonu zawierającego plazmid puc 19 z wklonowanym fragmentem, przeprowadza się analizę otrzymanych DNA plazmidowych przy użyciu enzymów restrykcyjnych EcoRI i Hind III, a produkty trawienia rozdziela się w żelu poliakryloamidowym. Trawienie przeprowadza się jak w punkcie B, a rozdział elektroforetyczny jak w punkcie C. C. Oczyszczanie ciałek inkluzyjnych. Po 18 godzinach inkubacji w temperaturze 37 C zawiesinę komórek bakteryjnych chłodzi się w lodzie, wiruje przez 10 minut/4000 obr., osad przemywa 0,1 M roztworem CaCl2- Odwirowany osad zawiesza się w 100 mm buforze fosforanowym ph 6.2, dodaje 1 M glicerol, 1 % lizozym i ogrzewa się do temperatury pokojowej. Dodaje się 0.5 M EDTA ph 8.0 i schładza do 0 C, następnie poddaje szokowi termicznemu w temperaturze 42 C przez 1 minutę. Zawiesinę wiruje się przy 4500 obr. przez 15 minut, osad zawiesza w 100 mm Tris-Cl ph 8.0 z 10 mm EDTA i ImM PMSF. Po kolejnym wirowaniu (4500 obr., 15 min.), osad zawiesza się w 100 mm Tris-Cl ph 8.0 z 10 mm EDTA, 1 mm PMSF, 100 mm beta-me, 1 % Triton X -100 i poddaje działaniu ultradźwięków 10 razy po 30 sekund. Mieszaninę wiruje się w buforze Tris-Cl ph=8.0 z 10 mm EDTA (20000 obr., 20 min.), osad zawiesza w buforze Tris-Cl ph 7.4 i znów wiruje. Pozostały osad zawiesza się w 9 M moczniku buforowanym Tris-Cl ph 7.4, dializuje wobec 6 M mocznika buforowanego Tris-Cl ph 7.4, odwirowywuje i supernatant nanosi się na kolumnę z DEAE 52 zrównoważoną buforem startowym: 6M mocznik, Tris-Cl ph 7.4, zawierającym 1 mm PMSF. Kompleks galaktozydaza-białko C eluuje się 0.2 M NaCl w powyższym buforze. Czystość frakcji chromatograficznych sprawdza się elektroforetycznie. D. Rozbicie kompleksu na drodze reakcji chemicznej. Oczyszczone białko hybrydowe beta-galaktozydaza-białko C dializuje się wobec buforu 10 mm Tris-Cl ph 7.4 w celu usunięcia mocznika, następnie liofilizuje. Rozbicie kompleksu przeprowadza się stosując 1 mg/ml CNBr w 80% kwasie mrówkowym, który hydrolizuje wiązania Met-X (G. Bauw et. al. Methods in Protein Sequence Analysis, Springer-Verlag, str ,1988). Reakcje przeprowadza się w temperaturze pokojowej przez 24 godziny, po czym kwas usuwa w wyparce próżniowej, a hydrolizat rozpuszcza się w 0.1% kwasie trójfluorooctowym. Produkty powstałe w wyniku tej reakcji analizuje się po przeprowadzeniu elektroforezy w żelu poliakryloamidowym, a następnie wyodrębnia się fragment białka C M et 56-Ile 119. E. Sposób wyodrębnienia polipeptydu odpowiadającego fragmentowi Met 56-Ile 119 łańcucha ciężkiego ludzkiego białka C za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC). Rozdział chromatograficzny przeprowadzono np. na kolumnie semipreparatywnej TSK G3000 SW firmy LKB, Szwecja. Etap 4. Otrzymywanie przeciwciał poliklonalnych. A. Immunizacja zwierząt. W celu uzyskania przeciwciał poliklonalnych dla fragmentu białka C po 50 μg antygenu rozpuszczonego w 0.5 ml PBS z dodatkiem 0.5 ml kompletnego adjuwantu Freunda podaje się królikom śródskórnie, co trzy tygodnie. Po 7 dniach od każdego szczepienia pobiera się krew z żyły usznej królika w celu sprawdzenia poziomu przeciwciał. Po wykrzepieniu w temperaturze 37 C przez godziny, skrzep oddziela się od ścianek probówki i całość pozostawia w temperaturze 4 C przez godzin. Następnie surowicę odciąga się do jałowych probówek wirówkowych i wiruje przy 3000 obr. przez 20 minut. Obecny dopełniacz w surowicach inaktywuje się podczas inkubacji przez 30 minut w temperaturze 56 C. Miano poszczególnych próbek surowicy określa się metodą radioimmunologiczną, oznaczając ich zdolność do wiązania znakowanego antygenu. Próby o najwyższym mianie przeciwciał przechowuje się w temperaturze -20 C.

14 B. Oczyszczanie przeciwciał. Przeciwciała dla fragmentu białka C izoluje się z surowicy odpornościowej metodą chromatografii powinowactwa. Immunoadsorbent otrzymuje się poprzez związanie fragmentu białka C ze złożem CNBr-Sepharose: 1g złoża przemywa się 1 mm HCl i zawiesza w buforze boranowym ph 8.0. Natychmiast dodaje się 20 mg antygenu w PBS i lekko miesza w temperaturze 4 C, następnie wiruje (4000 obr. przez 10 minut) i sprawdza stężenie białka w supernatancie. Złoże następnie zawiesza się w buforze boranowym ph 8.3 z 2 M glicyny, inkubuje przez 1 godzinę i wiruje. Osad przemywa się trzykrotnie buforem boranowym ph 8.3, 1 raz wodą destylowaną i 2 razy buforem boranowym ph 8.3. Na tak przygotowane złoże nanosi się 15 ml surowicy dla fragmentu białka Ci miesza w temperaturze 4 C przez godzin. Do mieszaniny dodaje się PMSF i chlorek benzamidyny do stężenia końcowego 1 mm. Po odwirowaniu (3000 obr., 10 minut) złoże przemywa się 4 razy buforem PBS z 1% Tween, a następnie 4 razy buforem 1 M NaCl z 1% Tween w PBS. Po każdym wirowaniu sprawdza się zawartość białka w supernatancie przez pomiar absorpcji przy 280 nm. Złoże umieszcza się w kolumnie 0.7 x 10 cm. Przeciwciała specyficznie związane z unieruchomionym na złożu antygenem eluuje się 0.5 M kwasem octowym do probówek zawierających 100 μl 2-M Tris. Frakcje o dużej zawartości białka łączy się i dializuje wobec PBS przez 24 godziny w temperaturze 0 C. C. Sprzęganie przeciwciał z peroksydazą. Uzyskane w ten sposób przeciwciała dla fragmentu białka C sprzęga się z peroksydazą. W tym celu rozpuszcza się 5 mg HRPO w 1 ml 0.3 M kwaśnego węglanu sodu o ph 8.1, następnie dodaje 0.1 ml 1% FDNB (1-fluoro-2,4-dunitrofluorobenzen) w etanolu absolutnym i delikatnie wytrząsa w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Następnie dodaje się mm NaJO4 rozpuszczonego w wodzie destylowanej i lekko miesza przez 30 minut. Po zmianie barwy na zielono-żółtą dodaje się 1 ml 0.16 M glikolu etylenowego i miesza przez godzinę, a następnie dializuje wobec 0.01 M węglanu sodu ph 9.5 w temperaturze 4 C. Do 3 ml tak przygotowanego roztworu aldehydu peroksydazy (HRPO) dodaje się 5 mg IgG rozpuszczone w 1 ml buforu węglanowego lub w postaci zliofilizowanego proszku wolnego od soli, lekko miesza przez 2-3 godziny w temperaturze pokojowej, następnie dodaje 5 mg.nabh4 i pozostawia w 4 C przez 3 do 12 godzin. Po inkubacji mieszaninę dializuje się w 4 C wobec PBS, ewentualny osad usuwa się przez wirowanie. Próbkę nanosi się na kolumnę 85 x 1.5 cm Sephadex G -100, zrównoważoną PBS. Zbiera się frakcje po 1.5 ml, poziom białka mierzy się spektrofotometrycznie. Frakcja IgG sprzężonych z peroksydazą schodzi w pierwszym szczycie. Roztwory koniugatu przechowuje się w 10 mg/ml albuminy w temperaturze 20 C. Etap 5. Oznaczenie białka C jako antygenu w badanej próbce za pomocą przeciwciał dla fragmentu w wzorze -A-, tj. fragmentu łańcucha ciężkiego ludzkiego białka C. Do roztworu antygenu w badanej próbce dodaje się wyznakowane np. peroksydazą przeciwciała dla fragmentu łańcucha ciężkiego ludzkiego białka C i inkubuje się przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Do wywołania reakcji enzymatycznej stosuje się roztwór substratu: ortofenylodwuaminę w 0.05 M buforze cytrynianowym, ph 5.0, zawierającym 0.02% nadtlenku wodoru. Po 6 minutach inkubacji pojawia się zabarwienie i reakcję hamuje się przez dodanie 3 M kwasu sjalowego. Absorbancję mierzy się przy 490 nm. Wynik odczytuje się z krzywej wzorcowej wykreślonej dla standardowego roztworu białka C. Etap 6. Wykonanie testu ELISA. Studzienki w płytce do testu ELISA (firmy Plastomed) opłaszcza się przeciwciałami dla polipeptydu o wzorze -A-, w którym symbol A ma wyżej wymienione znaczenie, zawieszonymi w 50 mm buforze fosforanowym ph 7.5. Testowane próbki osocza rozcieńcza się przed oznaczeniem 50 mm buforem fosforanowym, ph 7.5, zawierającym 0.15 M NaCl, 10 mm EDTA, 0.1 % Tween 20 i 1% BSA, dodaje się po 200 μl na studzienkę i inkubuje przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu inkubacji płytki 5-krotnie przemywa się 0.15 M

15 NaCl zawierającym 0.1% Tween 20. Następnie dodaje się 200 μl koniugatu IgG-HRP (przeciwciała dla całej cząsteczki białka C sprzęgnięte z peroksydazą) o stężeniu 5 μl/ml. Po 2 godzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej ponownie 5-krotnie przemywa się, po czym, w celu wywołania reakcji enzymatycznej dodaje się 200 μl roztworu substratu (0.4 mg/ml ortofenylodiaminy w 0.05 M buforze cytrynianowym, ph 5.0, zawierającym 0.02% H2O2). Po 6 min. inkubacji pojawia się zabarwienie i reakcję hamuje się przez dodanie 50 μl 3M kwasu sialowego. Absorbancję mierzy się przy 490 nm. Równocześnie wykonuje się oznaczenia z szeregiem rozcieńczeń fragmentu C, aby uzyskać krzywą wzorcową. Etap 7. Zastosowanie fragmentu Met 56-Ile 119 łańcucha ciężkiego ludzkiego białka C do oznaczania poziomu przeciwciał dla białka C w badanej próbce. Fragment polipeptydowy odpowiadający odcinkowi Met 56 - Ile 119 łańcucha ciężkiego ludzkiego białka C znakuje się izotopem jodu 125J. Do 100 μl radioznakowanego ligandu (ok cpm) dodaje się 100 μl badanej próbki (np. rozcieńczonej surowicy) i inkubuje się godzin w temperaturze 4 C. Następnie dodaje się przeciwciała przeciwimmunoglobulinowe (np. IgG królicze przeciw IgG ludzkim). Po 2-godzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej zwirowywuje się immunoprecypitat i przemywa go zbuforowanym roztworem soli fizjologicznej. Radioaktywność osadów mierzy się licznikiem gamma. Poziom przeciwciał dla białka C odczytuje się z krzywej wzorcowej. Przykład II. Postępując sposobem analogicznym jak w przykładzie I, z wyjątkiem etapu 3D i 3E, otrzymano przeciwciała dla kompleksu (Y)a-(X )c-a-(z)b, w którym Y oznacza fragment i Met 444 Val beta-galaktozydazy, X.oznacza peptyd łączący: Phe, Asp, Pro, A ma wyżej podane znaczenie, Z oznacza Met. Przeciwciała te stosowano analogicznie jak w przykładzie I etap 5 i 6. Przykład III. Test do oznaczania poziomu ludzkiego białka C składa się z: pojemnika zawierającego zbuforowany roztwór soli fizjologicznej (PBS) z EDTA i Tween 20, pojemnika z albuminą surowiczą, pojemnika z przeciwciałami dla fragmentu białka C, pojemnika z wyznakowanymi peroksydazą przeciwciałami dla białka C, pojemnika z substratem (ortodwufenyloaminą), pojemnika z buforem cytrynianowym o ph 5.0 i pojemnika z 3 M kwasem sjalowym.

16

17 FIG.2

18 FIG.3

19 FIG.4

20 FIG.5

21 FIG.6

22 FIG.1 Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 1,50 zł