RZECZPOSPOLITA ( 12) OPIS PATENTOWY (19) PL (18) POLSKA (13) B1. (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/CA94/00144

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA ( 12) OPIS PATENTOWY (19) PL (18) POLSKA (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/CA94/00144 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO94/20615, PCT Gazette nr 21/94 (51) IntCl7 C12N 15/12 C12N 15/18 C07K 14/51 C12N 15/63 G01N 33/68 A61P 19/10 Polipeptyd wykazujący działanie stymulujące kości u ssaków, sekwencja DNA oraz wektor kodujący polipeptyd wykazujący działanie stymulujące kości u ssaków, sposób wytwarzania i oczyszczania białka wykazującego działanie stymulujące kości (54) u ssaków, macierzyste komórki transformowane sekwencją DNA, sposób wykrywania obecności białka, białko wykazujące stymulację kości u ssaków, chimeryczny czynnik wykazujący stymulację kości u ssaków, polipeptyd wykazujący działanie stymulujące kości u ssaków z układu krążenia, zestaw diagnostyczny do określania obecności polipeptydu, sposób wytwarzania polipeptydu wykazującego działanie stymulujące kości u ssaków oraz sposób diagnozowania stanu chorobowego (30) Pierwszeństwo: ,US,08/ (73) Uprawniony z patentu: GENSCI REGENERATION SCIENCES INC., Mississauga, CA (4 3) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 26/95 (72) Twórcy wynalazku: Cherk S. Tam, Oakville, CA (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 11/01 (74) Pełnomocnik: Wierzchoń Jan, JAN WIERZCHOŃ & PARTNERZY, Biuro Patentów i Znaków Towarowych s.c. PL B1 (5 7 ) 1. Polipeptyd wykazujący działanie stymulujące kości u ssaków, obejmujący monomer mający sekwencję aminokwasów NH 2-Gly-Ile-Gly-Lys-Arg-Thr-Asn-Glu-His-Thr-Ala-Asp-Cys-Lys-Ile-Lys-Pro-Asn-Thr-Leu-His-Lys-Lys-Ala-Ala-Glu-Thr-Leu-Met-Val- Leu-Asp-Gln-Asn-Gln-Pro-CO2H i jego dimery, mające monomery powiązane ze sobą mostkiem dwusiarczkowym pomiędzy resztami cysteiny obu sekwencji 5 Sekwencja DNA kodująca polipeptyd wykazujący działanie stymulujące kości u ssaków, obejmująca sekwencję nukleotydów GGG ATC GGA AAA CGA ACA AAT GAA CAT ACG GCA GAT TGT AAA ATT AAA CCG AAC ACC TTG CAT AAA AAA GCT GCA GAG ACT TTA ATG G T C CTT G A C CAA AAT C A A C C A i sekwencje, które kodują analogi polipeptydu kodowanego przez n ią w których aminokwasy w sekwencji m ogą być podstawione, usunięte lub dodane, tak długo, jak długo zachow ane jest działanie stymulujące kości u ssaków uzyskane z trójwymiarowej konformacji sekwencji w polipeptydzie obejmującym tę sekwencję aminokwasów. 7 Wektor kodujący polipeptyd wykazujący działanie stymulujące kości u ssaków, znamienny tym, że obejmuje następującą sekwencję DNA GGG ATC GGA AAA CGA ACA AAT GAA CAT ACG GCA GAT TGT AAA ATT AAA CCG AAC ACC TTG CAT AAA AAA GCT GCA GAG ACT TTA ATG GTC CTT GAC CAA AAT CAA CCA lub sekwencje, które kodują analogi polipeptydu kodowanego przez mą, w których aminokwasy w sekwencji m ogą być podstawione, usunięte lub dodane, tak długo, jak długo zachowane jest działanie stymulujące kości u ssaków uzyskane z trójwymiarowej konformacji sekwencji w polipeptydzie obejmującym tę sekwencję aminokwasów 9. Sposób wytwarzania 1 oczyszczania białka wykazującego działanie stymulujące kości u ssaków, znam ienny tym, że prowadzi się hodowlę w ośrodku hodowlanym komórek transformowanych za pomocą sekwencji DNA zawierającej sekwencję GGG ATC GGA AAA CGA ACA AAT GAA CAT ACG GCA GAT TGT AAA ATT AAA CCG AAC ACC TTG CAT AAA AAA GCT GCA GAG ACT TTA ATG GTC CTT G A C CAA AAT C A A CCA i następnie otrzymane z ośrodka hodowli białka izoluje się i oczyszcza 11 Macierzyste komórki transformowane sekw encją DNA kodującą polipeptyd wykazujący działanie stymulujące kości u ssaków o sekwencji aminokwasów NH2-Gly-Ile-Gly-Lys-Arg-Thr-Asn-Glu-His-Thr-Ala-Asp-Cys-Lys-Ile-Lys-Pro- Asn-Thr-Leu-His-Lys-Lys -Ala-Ala-Glu-Thr-Leu-Met-Val-Leu-Asp-Gln-Asn-Gln-Pro-CO2H lub jej analogi, w których aminokwasy w sekwencji mogą być podstawione, usunięte lub dodane, tak długo, jak długo zachowane jest działanie stymulujące kości u ssaków uzyskane z trójwymiarowej konformacji sekwencji w polipeptydzie obejmującym tę sekwencję aminokwasów

2 Polipeptyd wykazujący działanie stymulujące kości u ssaków, sekwencja DNA oraz wektor kodujący polipeptyd wykazujący działanie stymulujące kości u ssaków, sposób wytwarzania i oczyszczania białka wykazującego działanie stymulujące kości u ssaków, macierzyste komórki transformowane sekwencją DNA, sposób wykrywania obecności białka, białko wykazujące stymulację kości u ssaków, chimeryczny czynnik wykazujący stymulację kości u ssaków, polipeptyd wykazujący działanie stymulujące kości u ssaków z układu krążenia, zestaw diagnostyczny do określania obecności polipeptydu, sposób wytwarzania polipeptydu wykazującego działanie stymulujące kości u ssaków oraz sposób diagnozowania stanu chorobowego Zastrzeżenia patentowe 1. Polipeptyd wykazujący działanie stymulujące kości u ssaków, obejmujący monomer mający sekwencję aminokwasów NH2-Gly-Ile-Gly-Lys-Arg-Thr-Asn-Glu-His-Thr-Ala-Asp- -Cys-Lys-Ile-Lys-Pro-Asn-Thr-Leu-His-Lys-Lys-Ala-Ala-Glu-Thr-Leu-Met-Val-Leu-Asp-Gln- Asn-Gln-Pro-CO2H i jego dimery, mające monomery powiązane ze sobą mostkiem dwusiarczkowym pomiędzy resztami cysteiny obu sekwencji. 2. Polipeptyd wykazujący działanie stymulujące kości u ssaków, mający sekwencję, która odpowiada części lub całości sekwencji aminokwasów NH2-Gly-Ile-Gly-Lys-Arg-Thr-Asn-Glu- His-Thr-Ala-Asp-Cys-Lys-Ile-Lys-Pro-Asn-Thr-Leu-His-Lys-Lys-Ala-Ala-Glu-Thr-Leu-Met-Val-Leu- Asp-Gln-Asn-Gln-Pro-CO2H, analogi tej sekwencji, w obrębie której aminokwasy mogą być podstawione, usunięte lub dodane, tak długo, jak długo zachowane jest działanie stymulujące kości u ssaków uzyskane z trójwymiarowej konformacji sekwencji oraz koniugaty polipetydu lub jego analogów. 3. Polipeptyd wykazujący działanie stymulujące kości u ssaków, obejmujący dimer peptydu mającego sekwencję, która odpowiada części lub całości sekwencji aminokwasów NH2-Gly-Ile-Gly-Lys-Arg-Thr-Asn-Glu-His-Thr-Ala-Asp-Cys-Lys-Ile-Lys-Pro-Asn-Thr-Leu- His-Lys-Lys-Ala-Ala-Glu-Thr-Leu-Met-Val-Leu-Asp-Gln-Asn-Gln-Pro-CO2H, w którym peptydy dimeru są ze sobą powiązane mostkiem dwusiarczkowym pomiędzy resztami cysteiny odpowiednich peptydów, analogi tej sekwencji, w obrębie której aminokwasy mogą być podstawione, usunięte lub dodane, tak długo, jak długo zachowane jest działanie stymulujące kości u ssaków uzyskane z trójwymiarowej konformacji sekwencji oraz koniugaty polipeptydu lub jego analogów. 4. Polipeptyd wykazujący działanie stymulujące kości u ssaków, obejmujący monomer mający sekwencję, która odpowiada części lub całości sekwencji aminokwasów NH2-Gly-Ile-Gly-Lys-Arg-Thr-Asn-Glu-His-Thr-Ala-Asp-Cys-Lys-Ile-Lys-Pro-Asn-Thr-Leu- His-Lys-Lys-Ala-Ala-Glu-Thr-Leu-Met-Val-Leu-Asp-Gln-Asn-Gln-Pro-CO2H i jego dimery, w których monomery są połączone ze sobą mostkiem dwusiarczkowym pomiędzy resztami cysteiny obu sekwencji, analogi tej sekwencji, w obrębie której aminokwasy mogą być podstawione, usunięte lub dodane, tak długo, jak długo zachowane jest działanie stymulujące kości u ssaków uzyskane z trójwymiarowej konformacji sekwencji oraz koniugaty polipeptydu lub jego analogów. 5. Sekwencja DNA kodująca polipeptyd wykazujący działanie stymulujące kości u ssaków, obejmująca sekwencję nukleotydów GGG ATC GGA AAA CGA ACA AAT GAA CAT

3 ACG GCA GAT TGT AAA ATT AAA CCG AAC ACC TTG CAT AAA AAA GCT GCA GAG ACT TTA ATG GTC CTT GAC CAA AAT CAA CCA i sekwencje, które kodują analogi polipeptydu kodowanego przez nią, w których aminokwasy w sekwencji mogą być podstawione, usunięte lub dodane, tak długo, jak długo zachowane jest działanie stymulujące kości u ssaków uzyskane z trójwymiarowej konformacji sekwencji w polipeptydzie obejmującym tę sekwencję aminokwasów. 6. Sekwencja DNA kodująca polipeptyd wykazujący działanie stymulujące kości u ssaków, obejmująca sekwencję nukleotydów GGG ATC GGA AAA CGA ACA AAT GAA CAT ACG GCA GAT TGT AAA ATT AAA CCG AAC ACC TTG CAT AAA AAA GCT GCA GAG ACT TTA ATG GTC CTT GAC CAA AAT CAA CCA i sekwencje, które kodują analogi polipeptydu kodowanego przez nią, w których aminokwasy w sekwencji mogą być podstawione, usunięte lub dodane, tak długo, jak długo zachowane jest działanie stymulujące kości u ssaków uzyskane z trójwymiarowej konformacji sekwencji w polipeptydzie obejmującym tę sekwencję aminokwasów oraz sekwencje, które hybrydyzują z DNA i kodują sekwencję aminokwasów polipeptydu, który objawia działanie stymulujące kości u ssaków. 7. Wektor kodujący polipeptyd wykazujący działanie stymulujące kości u ssaków, znamienny tym, że obejmuje następującą sekwencję DNA: GGG ATC GGA AAA CGA ACA AAT GAA CAT ACG GCA GAT TGT AAA ATT AAA CCG AAC ACC TTG CAT AAA AAA GCT GCA GAG ACT TTA ATG GTC CTT GAC CAA AAT CAA CCA lub sekwencje, które kodują analogi polipeptydu kodowanego przez nią, w których aminokwasy w sekwencji mogą być podstawione, usunięte lub dodane, tak długo, jak długo zachowane jest działanie stymulujące kości u ssaków uzyskane z trójwymiarowej konformacji sekwencji w polipeptydzie obejmującym tę sekwencję aminokwasów. 8. Wektor kodujący polipeptyd wykazujący działanie stymulujące kości u ssaków, znamienny tym, że obejmuje sekwencję DNA: GGG ATC GGA AAA CGA ACA AAT GAA CAT ACG GCA GAT TGT AAA ATT AAA CCG AAC ACC TTG CAT AAA AAA GCT GCA GAG ACT TTA ATG GTC CTT GAC CAA AAT CAA CCA lub sekwencje, które kodują analogi polipeptydu kodowanego przez nią, w których aminokwasy w sekwencji mogą być podstawione, usunięte lub dodane, tak długo, jak długo zachowane jest działanie stymulujące kości u ssaków uzyskane z trójwymiarowej konformacji sekwencji w polipeptydzie obejmującym tę sekwencję aminokwasów i sekwencje, które hybrydyzują z DNA i kodują sekwencję aminokwasów polipeptydu, który objawia działanie stymulujące kości u ssaków. 9. Sposób wytwarzania i oczyszczania białka wykazującego działanie stymulujące kości u ssaków, znam ienny tym, że prowadzi się hodowlę w ośrodku hodowlanym komórek transformowanych za pomocą sekwencji DNA zawierającej sekwencję: GGG ATC GGA AAA CGA ACA AAT GAA CAT ACG GCA GAT TGT AAA ATT AAA CCG AAC ACC TTG CAT AAA AAA GCT GCA GAG ACT TTA ATG GTC CTT GAC CAA AAT CAA CCA i następnie otrzymane z ośrodka hodowli białka izoluje się i oczyszcza. 10. Sposób wytwarzania i oczyszczania białka wykazującego działanie stymulujące kości u ssaków, znam ienny tym, że prowadzi się hodowlę w ośrodku hodowlanym komórek transformowanych za pomocą sekwencji DNA kodującej sekwencję aminokwasów NH2 Gly-Ile-Gly- Lys-Arg-Thr-Asn-Glu-His-Thr-Ala-Asp-Cys-Lys-Ile-Lys-Pro-Asn-Thr-Leu-His-Lys-Lys-Ala- Ala-Glu-Thr-Leu-Met-Val-Leu-Asp-Gln -Asn-Gln-Pro-CO2H i następnie otrzymane z ośrodka hodowli białka izoluje się i oczyszcza. 11. Macierzyste komórki transformowane sekwencją DNA kodującą polipeptyd wykazujący działanie stymulujące kości u ssaków o sekwencji aminokwasów NH2 Gly-Ile-Gly- Lys-Arg-Thr-Asn-Glu-His-Thr-Ala-Asp-Cys-Lys-Ile-Lys-Pro-Asn-Thr-Leu-His-Lys-Lys-Ala- Ala-Glu-Thr-Leu-Met-Val-Leu-Asp-Gln-Asn-Gln-Pro-CO2H lub jej analogi, w których aminokwasy w sekwencji mogą być podstawione, usunięte lub dodane, tak długo, jak długo zachowane jest działanie stymulujące kości u ssaków uzyskane z trójwymiarowej konformacji sekwencji w polipeptydzie obejmującym tę sekwencję aminokwasów.

4 Macierzyste komórki transformowane sekwencją DNA kodującą polipeptyd wykazujący działanie stymulujące kości u ssaków o sekwencji aminokwasów NH2-Gly-Ile-Gly-Lys -Arg-Thr-Asn-Glu-His-Thr-Ala-Asp-Cys-Lys-Ile-Lys-Pro-Asn-Thr-Leu-His-Lys-Lys-Ala-Ala -Glu-Thr-Leu-Met-Val-Leu-Asp-Gln-Asn-Gln-Pro-CO2H lub analogi tej sekwencji, w których aminokwasy w sekwencji mogą być podstawione, usunięte lub dodane, tak długo, jak długo zachowane jest działanie stymulujące kości u ssaków uzyskane z trójwymiarowej konformacji sekwencji w polipeptydzie obejmującym tę sekwencję aminokwasów oraz sekwencji, które hybrydyzują z DNA i kodują sekwencję aminokwasów polipeptydu, który objawia działanie stymulujące kości u ssaków. 13. Sposób wykrywania obecności białka wykazującego działanie stymulujące kości u ssaków, znamienny tym, że zbiera się próbki surowicy krwi ssaków oraz wystawia się przynajmniej część próbki na działanie przeciwciała powiązanego z systemem sprawozdawczym, w obrębie którego przeciwciało jest zdolne wiązać się z polipeptydem mającym sekwencję NH2 Gly-Ile-Gly-Lys -Arg-Thr-Asn-Glu-His-Thr-Ala-Asp-Cys-Lys-Ile-Lys-Pro-Asn-Thr-Leu-His-Lys-Lys-Ala-Ala-Glu- Thr-Leu-Met-Val-Leu-Asp-Gln-Asn-Gln-Pro-CO2H i w obrębie którego wiązanie się razem białka i przeciwciała powoduje, że system sprawozdawczy wykrywa powyższe wiązanie. 14. Białko wykazujące stymulację kości u ssaków, obejmujące sekwencję aminokwasów określoną jako SEK ID NR 11, które po podaniu ssakom takim jak szczur potęguje wzrost kości ssaka. 15. Białko według zastrz. 14, znamienne tym, że ma co najmniej 50% homologii z sekwencją oznaczoną jako SEK ID NR Białko wykazujące stymulację kości u ssaków obejmujące sekwencję aminokwasów określonąjako SEK ID NR 11 i białko kodowane przez DNA, który hybrydyzuje w wyraźnych warunkach z DNA kodującym białko oznaczone w SEK ID NR Chimeryczny czynnik stymulujący kości wykazujący działanie stymulujące kości u ssaków obejmujący sekwencję aminokwasów oznaczoną jako SEK ID NR 11 lub jej część wykazująca działanie stymulujące kości u ssaków. 18. Polipeptyd wykazujący działanie stymulujące kości u ssaków z układu krążenia, wyizolowany z surowicy krwi, w zasadzie czysty, mający sekwencję końca-n Gly-Pro-Gly-Gly- Ala-Gly-Glu-Thr-Lys-Pro-Ile. 19. Polipeptyd według zastrz. 18, znamienny tym, że jest wyizolowany z surowicy krwi szczura. 20. Polipeptyd według zastrz. 18, znamienny tym, że ma masę cząsteczkową równą około 5000 daltanów oraz jego dimery, polimery i analogi. 21. Zestaw diagnostyczny do określania obecności polipeptydu wykazującego działanie stymulujące kości u ssaków, zdolnego do wywoływania wzrostu szybkości przyłożenia kostnego w próbce, znamienny tym, że obejmuje przeciwciało polipeptydu mającego sekwencję aminokwasów końca-n Gly-Pro-Gly-Gly-Ala-Gly-Glu-Thr-Lys-Pro-Ile powiązane z systemem sprawozdawczym, w obrębie którego system sprawozdawczy w ytw arza w ykryw alną odpowiedź, gdy w stępnie określona ilość polipeptydu i przeciw ciała są ze sobą powiązane. 22. Zestaw według zastrz. 21, znamienny tym, że system sprawozdawczy obejmuje sposoby korelacji odpowiedzi z powyższą wstępnie określoną ilością polipeptydu. 23. Zestaw diagnostyczny do określania obecności polipeptydu wykazującego działanie stymulujące kości u ssaków, zdolnego do wytwarzania wzrostu szybkości przyłożenia kostnego w próbce, znamienny tym, że obejmuje przeciwciało polipeptydu mającego sekwencję aminokwasów NH2-Gly-Ile-Gly-Lys-Arg-Thr-Asn-Glu-His-Thr-Ala-Asp-Cys-Lys-Ile-Lys-Pro -A sn-thr-leu-h is-lys-lys-a la-a la-g lu-thr-leu-m et-v al-leu-a sp-g ln-a sn-g ln-pro- CO2H, powiązane z systemem sprawozdawczym, w obrębie którego system sprawozdawczy wytwarza wykrywalną odpowiedź, gdy wstępnie określona ilość polipeptydu i przeciwciała są ze sobą powiązane. 24. Zestaw według zastrz. 23, znamienny tym, że system sprawozdawczy obejmuje sposoby korelacji odpowiedzi z powyższą wstępnie określoną ilością polipeptydu.

5 Sposób wytwarzania polipeptydu wykazującego działanie stymulujące kości u ssaków i mającego sekwencję aminokwasów końca-n Gly-Pro-Gly-Gly-Ala-Gly-Glu-Thr-Lys-Pro-Ile z surowicy krwi szczura, znamienny tym, że otrzymuje się frakcje białek z surowicy krwi, usuwa się frakcje białek mających masy cząsteczkowe większe niż daltonów oraz izoluje się połipeptyd przez zebranie białek z kolumny chromatografii cieczowej wysokociśnieniowej w odwróconej fazie, upakowanej żelem krzemionkowym posiadającym dołączone do niego trójwęglowe boczne grupy łącznie z elucją polipeptydu z kolumny, stosując jako rozpuszczalnik do elucji co najmniej 62 do 63 procentowy acetonitryl. 26. Sposób diagnozowania stanu chorobowego takiego jak osteoporoza u ssaków, znamienny tym, że zbiera się próbki surowicy krwi ssaka, izoluje się z próbki frakcję białka, usuwa się białka mające masy cząsteczkowe większe niż daltonów, wystawia się przynajmniej część próbki na działanie przeciwciała dla polipeptydu o sekwencji aminokwasów NH2-Gly-Ile-Gly-Lys-Arg-Thr-Asn-Glu-His-Thr-Ala-Asp-Cys-Lys-Ile-Lys-Pro-Asn-Thr- Leu-His-Lys-Lys-Ala-Ala-Glu-Thr-Leu-Met-Val-Leu-Asp-Gln-Asn-Gln-Pro-CO2H, wzajemnie połączonego z systemem sprawozdawczym, w obrębie którego wiązanie się razem przeciwciała i polipeptydu powoduje, że system sprawozdawczy wykrywa to połączenie, po czym wykrywa się to połączenie i kolejno ustala czy ilość polipeptydu zdolnego wywołać wzrost szybkości przyłożenia kostnego przewyższa wstępnie określony poziom, czy też ilość polipeptydu znajduje się poniżej wstępnie określonego poziomu wskazując na stan chorobowy. 27. Sekwencja DNA kodująca polipeptyd wykazujący działanie stymulujące kości u ssaków, stanowiąca dojrzały cdna, obejmujący następującą sekwencję nukleotydów ATG ACT GCT CAA AAT ACA GAC CTT AAC CAA CTA TCC AAC AGT TTC ACT TTA GGG ATC GGA AAA CGA ACA AAT GAA CAT ACG GCA GAT TGT AAA ATT AAA CCG AAC ACC TTG CAT AAA AAA GCT GCA GAG ACT TTA ATG GTC CTT GAC CAA AAT CAA CCA. 28. Polipeptyd wykazujący działanie stymulujące kości u ssaków i jego sekwencja sygnalna, mający następującą sekwencję aminokwasów: NH2-Met Thr Ala Gln Asn Thr Asp Leu Asn Gln Leu Ser Asn Ser Phe Thr Leu Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys Ile Lys Pro Asn Thr Leu His Lys Lys Ala Ala Glu Thr Leu Met Val Leu Asp Gln Asn Gln Pro- CO2H. * * * Przedmiotem wynalazku jest polipeptyd wykazujący działanie stymulujące kości u ssaków oraz sekwencja DNA i wektor kodujące polipeptyd wykazujący działanie stymulujące kości u ssaków. Ponadto, przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania i oczyszczania białka wykazującego działanie stymulujące kości u ssaków, macierzyste komórki transformowane sekwencją DNA, sposób wykrywania obecności białka, białko wykazujące stymulację kości u ssaków, a także chimeryczny czynnik wykazujący stymulację kości u ssaków, polipeptyd wykazujący działanie stymulujące kości u ssaków z układu krążenia, zestaw diagnostyczny do określania obecności polipeptydu, sposób wytwarzania polipeptydu wykazującego działanie stymulujące kości u ssaków oraz sposób diagnozowania stanu chorobowego. Wiadomo, że nawet u dorosłych ludzi kości mogą podlegać odnowie. W pewnych jednak miejscach, takich jak wewnętrzna torebka uszna, po uformowaniu się organu nie można zaobserwować ich odnowy. W innych miejscach, szczególnie w centralnej osi szkieletowej, odnowa ta przejawia się w sposób ciągły w wieku dorosłym. Odnowa kości zachodzi na powierzchni istniejącej kostnej substancji podstawowej, która składa się z białka (głównie kolagenu) oraz substancji mineralnych. Przekształcenie kości rozpoczyna się od zniszczenia kostnej substancji podstawowej przez osteoklasty. Osteoklast to wielojądrowa komórka, która wydziela kwas i enzymy protolityczne prowadząc do rozszczepienia kolagenu substancji podstawowej i uwolnienia substancji mineralnych do obszaru płynu pozakomórkowego. Po tej wstępnej fazie destrukcji kości, czy też fazie resorpcji, następuje formowanie się nowej substancji podstawowej kości.

6 Odkładają się nowe białka kostne i, czasami później, substancje mineralne zaczynają włączać się w nowoukształtowaną substancję podstawową. Formowanie się substancji podstawowej kości i następująca po nim ich mineralizacja są funkcjami osteoblastów, będących komórkami jednojądrowymi. Faza formowania zwykle następuje po okresie nieaktywności (1,2). In vivo resorpcja jawi się jako ściśle sprzężona z fazą kształtowania. Tak więc odnowa kości jest ciągiem wydarzeń, które zachodząw miejscu znanym jako jednostka metabolizmu kości (ang. Bone Metabolizm Unit, przyp. tłum) czy BMU. Osteoblasty i osteoklasty, domniemane pośrednimi w odnowie kości, należą do dwóch różnych rodowodów komórkowych. Te dwa typy komórek nie są uprzednio wytworzonymi komórkami, lecz różnicują się na swoich prekursorów poprzez aktywację komórek (4, 5, 6). Kostna substancja podstawowa może być zachowywana zarówno poprzez całkowite ustanie odnowy kości, jak to jest w przypadku wewnętrznej torebki usznej, jak i poprzez równowagę pomiędzy kształtowaniem się kości i ich resorpcją. W wielu pracach nad zależnością zmian kośćca od wieku obserwowany jest przyrost wszystkich kości ciała podczas okresu wzrostu, tak że masa kośćca osiąga maksimum we wczesnym wieku dorosłym. Po przyroście tym następuje spadek objętości kości wraz z starzeniem się. W przypadku kobiet faza najbardziej gwałtownej utraty kości zachodzi zwykle podczas okresu perimenopauzy, przed fazą wolniejszą, bardziej zrównoważoną. Z tego powodu utrata kości u kobiet jest zwykle poważniejsza niż u mężczyzn. Zrozumienie równowagi kostnej w BMU może więc być przełomem w rozumieniu patogenezy starzenia się szkieletu. W każdym razie, mechanizmy regulujące przemiany kostne są złożone i obecnie niezbyt dobrze zrozumiane. Złożoność mechanizmów kontrolnych daje w wyniku różnorodność podejść do problemu redukcji utraty kości. Ogólnie mówiąc, odnowa kości może być regulowana w dwóch różnych stadiach. Może się to dokonywać w stadium aktywacji komórek prekursorowych. Regulatory komórkowej aktywacji mogą kontrolować nie tylko aktywne BMU w kośćcu, lecz także prawdopodobnie osteoklasty i osteoblasty w pojedynczym BMU. Alternatywnie, odnowa kości może być regulowana na poziomie zróżnicowanych komórek kostnych. Złożoność systemu komórek kostnych czyni trudnym oddzielenie badań nad tymi dwoma poziomami regulacji (3). Regulatory komórek kostnych jawią się jako należące do dwóch kategorii. Pierwsze z nich oddziaływująze specyficznymi receptorami w błonie komórkowej. Jedna klasa tych regulatorów działa poprzez system cyklazy adenylowej z wytworzeniem cyklicznego AMP jako drugiego nośnika informacji działającego w systemie białkowej kinazy K. Parathormon (PTH) i kalcytonina (CT) należą do tej klasy (7). Druga klasa także oddziaływuje z receptorami błony i daje w wyniku wewnątrzkomórkowe wyzwolenie cząsteczki uzyskanej z fosfoinozytydów, co z kolei prowadzi do wzrostu ilości wewnątrzkomórkowego wapnia i aktywacji kinazy C. Trzecia klasa zawiera oddziaływania regulatorów z receptorami powierzchni komórki, ale drugi sygnał jest wytwarzany przez samą cząsteczkę receptora, dając w następstwie aktywację kinazy tyrozynowej. Wiele czynników wzrostu przejawia działanie w ten sposób (8-15). Druga kategoria regulatorów nie oddziałuje z receptorami błony komórkowej, lecz może przechodzić przez błonę komórkową, by wiązać się z receptorami płynu komórkowego. Regulator jest wtedy przenoszony przez błonę jądra komórkowego za pomocą receptora płynu komórkowego, by oddziaływać z DNA, dając w wyniku wzrost transkrypcji specyficznych genów. Ten sposób działania wykazują hormony sterydowe, łącznie z witaminą D (16). Wiele hormonów stymuluje rozrost osteoklastów. Należą do nich 1,25(OH)2D, PTH i prostaglandyna. Receptory PTH i 1,25(OH)2D w osteoklastach nie zostały dotąd jednoznacznie zidentyfikowane. Wydaje się, że te dwa hormony nie wywierają żadnego skutku na osteoklasty w kulturze, chociaż wtedy, gdy osteoklasty są w ko-kulturze z komórkami linii osteoblastów, PHT i 1,25(OH)2D stymulują rozrost osteoklastów. Wydaje się, że IL-1 oraz TNF działają podobnie, jak PTH i 1,25(OH)2D. Inne czynniki wzrostu, takie jak EGF, TFG i PDGF wykazują stymulowanie osteoklastów poprzez wzrost wytwarzania PGE. Kalcytonina i kortykosterydy są znanymi inhibitorami osteoklastów razem z substancjami chemicznymi, takimi jak difosfoniany.

7 Obecnie uznaje się, że interleukina 1 może stymulować kolagen i kostne białka niekolagenowe oraz syntezę DNA. Wynik syntezy białek kostnych jest blokowany przez indometacynę, sugerując, że w tym działaniu IL-1 pośredniczy PGE. Wydaje się, że indometacyna nie wpływa na efekt działania IL-1 na syntezę DNA osteoblastów. Badania na kulturze komórek z linii osteoblastów sugerują, że pewne miejscowo wytwarzane czynniki wzrostu stymulują syntezę DNA i kolagenu. W kulturze komórek kostnych PTH czy witamina D wstrzymują syntezę DNA. Ten efekt działania PTH in vitro kontrastuje z efektem in vivo obserwowanym u ludzi i zwierząt eksperymentalnych. Ukazano, że w przypadku szczurów i ludzkich pacjentów z nadczynnością przytarczyc PTH może stymulować odkładanie się zmineralizowanej substancji podstawowej kości. Wstępne kliniczne badania próbne nad skutecznością fragmentu aminokwasowego 1-23 PTH w leczeniu osteoporozy wskazują, że ten fragment PTH może zwiększać objętość beleczek kostnych. Przyczyna tej sprzeczności nie została dotąd w pełni wyjaśniona. Parathormon jest białkiem składającym się w dojrzałej formie z 84 aminokwasów. Początkowo, przenoszony pre-proparathormon jest znacznie większy - jest to presekwencja będąca sekwencją sygnalną, która jest rozcinana, gdy białko wchodzi do szorstkiego retikulum endoplazmatycznego. W aparacie Golgiego presekwencja jest przecinana z pozostawieniem nienaruszonego, dojrzałego hormonu zapakowanego w wydzielającej się granulce. Ukazuje to, że regulacja tempa wydzielania nie jest kierowana tak dalece przez szybkość produkcji wewnątrzkomórkowego białka, lecz przez szybkość wewnątrzkomórkowej destrukcji i szybkość wydzielania. Wewnątrzkomórkowe, dojrzałe białko jest obcinane zarówno na końcu aminowym, jak i karboksylowym. Obcięte białko może być wydzielone do układu krążenia jako fragment nieaktywny. Wydzielanie dojrzałego białka może być stymulowane przez spadek stężenia pozakomórkowego wapnia. Z drugiej strony, stężenie wymywanego wapnia surowicy wykazuje wstrzymanie wydzielania PTH. Dojrzały peptyd jest w układzie krążenia, w wątrobie, gwałtownie cięty w wielu miejscach cząsteczki, łącznie z regionem, w którym mieści się 38 aminokwasów. Mniejszy fragment na końcu aminowym, który zawiera pierwsze 34 aminokwasy, przenosi pełną znaną aktywność w znaczeniu je działania na nerki, jelita i kości. On również w pełni wiąże się z receptorami błony komórkowej, by stymulować produkcję camp. Poziom fragmentu 1-38 w surowicy jest normalnie niemożliwy do zmierzenia, co wskazuje, że ma on krótki czas życia w układzie krążenia. Dłuższy, nieaktywny fragment z końcem karboksylowym ma względnie dłuższy półokres życia i przenosi największą część immunoaktywnego PTH w układzie krążenia. Wszystkie fragmenty z układu krążenia są ostatecznie niszczone w nerkach i wątrobie. Jednym z domniemanych mechanizmów odcedzania krążącego nieaktywnego fragmentu PTH jest filtracja kłębuszka (17). PTH uczestniczy w równowadze wapnia w kośćcu. PTH stymuluje kanalikową resorpcję wapnia przez nerki i wstrzymuje reabsorpcję fosforanów i wodorowęglanów przez niniejsze kanaliki nerkowe. Drugim efektem działania PTH w nerkach jest stymulacja wytwarzania 1,25(OH)2D. Ten metabolit witaminy D jest in vivo stymulatorem osteoklastów, jak i czynnikiem powodującym wzrost jelitowej absorpcji wapnia. We wzroście absorpcji wapnia w jelitach, na skutek stymulacji PTH, pośredniczy ten metabolit witaminy D. In vivo PTH stymuluje osteoklastyczną resorpcję kości z wydzieleniem wapnia do układu krążenia. PTH powoduje również rozrost osteoblastów (18). W wielu przypadkach nadczynności przytarczyc zachodzi utrata kości, chociaż w pewnych przypadkach pierwotnej nadczynności przytarczyc obserwowano wzrost gęstości kręgosłupa (19, 20, 21), tak jak we wtórnej nadczynności przytarczyc komplikujący niewydolność nerkową. Kalu i Walker zaobserwowali, że ciągłe podawanie niskich dawek ekstraktu paratyroidowego prowadzi do stwardnienia kości u szczurów (22). Tam i inni badali efekt niskowapniowej diety na przyłożenie kostnych substancji mineralnych u szczurów poprzez znakowanie tetracyklina i odkryli, że na przekór utracie kości na skutek wzrostu ich histologicznej resorpcji (jako wynik wtórnej nadczynności przytarczyc), szybkość przyłożenia kostnych substancji mineralnych wzrasta (23). Odkryto także, że szybkość przyłożenia kostnych substancji mineralnych wzrosła u 23 chorych z łagodną nadczynnością przytarczyc (24). Po udanym usunięciu gruczolaka przytarczyc u

8 czterech pacjentów szybkość ta powróciła do poziomu obserwowanego w grupie kontrolnej. Odkryto tu także istnienie zależności stymulacji przez PTH tempa przyłożenia substancji mineralnych od dawki. Siła fragmentu 1-34 oraz nienaruszonego hormonu PTH jawią się jako identyczne w przeliczeniu na liczby moli. Jest to zgodne z tym, że fragment 1-34 cząsteczki PTH przenosi aktywność biologiczną nienaruszonego hormonu. Zaobserwowano również, że końcowy wynik działania podawanego PTH na równowagę kośćca zależy od tego, jak hormon ten jest podawany. Dla tej samej dawki dziennej objętość kości wykazuje wzrost zależny od dawki, jeśli dzienna dawka hormonu jest podawana jako pojedynczy zastrzyk, chociaż gdy taka sama dzienna dawka jest podawana poprzez ciągłe wlewanie za pomocą podskórnej miniosmotycznej pompki, rezultatem jest utrata kości. Przerywane zastrzyki nie powodują żadnego efektu w poziomie wapnia w surowicy, podczas gdy wlewanie powoduje zależny od dawki wzrostu wapnia w surowicy. Efekty podawania PTH na te dwa sposoby w szybkości przyłożenia kostnych substancji mineralnych, mierzone poprzez znakowanie tetracykliną, są takie same. Co jest powoduje ten efekt różnicowanie, nie wiadomo (25). Przedstawione ogólne rozumienie procesów wzrostu kości i ich regulacji, różnych podejść do leczenia chorób, łącznie z utratą masy kości i towarzyszących im zaburzeń, jest zilustrowane w literaturze patentowej. Na przykład, zgłoszenie patentowe PCT nr opublikowane 17 września 1992 opisuje białko uzyskane z trzustki świni, które działa obniżająco na poziom wapnia w surowicy w leczeniu zaburzeń kostnych powodujących podniesienie poziomu wapnia w surowicy. Europejskie zgłoszenie patentowe nr opublikowane 23 września 1992 opisuje zastosowanie dwu- lub trójpeptydów, które hamują proteazę cysteinow ą w leczeniu chorób kości. Zgłoszenie patentowe PCT nr opublikowane 3 wrzenia 1992 ujawnia mieszaninę do pobudzania wzrostu kości, mieszaninę zawierającą zaktywowane i morfogenetyczne kostne białko. Europejskie zgłoszenie patentowe nr opublikowane 19 sierpnia 1992 ujawnia zastosowanie mieszaniny komórkowych czynników wzrostu, opracowanej do wykorzystania w chorobach kości, łącznie z redukcją masy kostnej, ponieważ powodują one rozrost osteoblastów. Zgłoszenie patentowe PCT nr opublikowane 17 czerwca 1992 opisują lek zawierający fragment 1-37 końcówki-n ludzkiego PTH. Europejskie zgłoszenie patentowe nr opublikowane 16 września 1991 opisuje białka antagonistyczne parathormonu stosowane do leczenia zaburzeń metabolizmu związanych z wapniem lub kwasem fosforowym, jak osteoporoza. Względnie krótki półokres życia PTH w surowicy krwi i względnie długi efekt przerywanych zastrzyków PTH pozwoliły na postawienie hipotezy, że PTH może w pewien sposób prowadzić do wywołania drugiego czynnika w układzie krążenia. Zbadano więc obecność takiego drugiego czynnika w surowicy krwi szczurów i ludzi. Stwierdzono, że możliwe jest wyizolowanie z surowicy krwi szczura substancji polipeptydowej, która u szczurów niezdolnych do wytwarzania PTH (szczurów z usuniętymi przytarczycami) powoduje wzrost obserwowanej szybkości przyłożenia kostnych substancji mineralnych. Zaobserwowano dalej, że szybkość narastania kości wzrasta z dawką podawanej wyizolowanej substancji, przynajmniej przy badanym zakresie dawek i w czasie badań. Substancja ta została wyodrębniona w dwóch formach, pierwszej - większego polipeptydu o masie cząsteczkowej około dwukrotnie większej niż drugiego polipeptydu. Określono, że pierwszych jedenaście aminokwasów sekwencji mniejszego polipeptydu to Gly Pro Gly Gly Ala Gly Glu Thr Lys Pro Ile (SEK ID NR 1). Pierwszych siedem aminokwasów większego polipeptydu określono jako Gly Pro Gly Gly Ala Gly Glu (SEK ID Nr 2). Podobieństwo tych dwóch sekwencji końcówek NH2, doprowadziło do postawienia tezy, iż większy polipeptyd może być dimerem pierwszego. Sonda molekularna kwasu nukleinowego bazująca na sekwencji aminokwasów peptydu szczura została zsyntetyzowana i użyta do przeszukiwania biblioteki cdna pochodzącego z wątroby poronionego płodu ludzkiego, aby wyizolować ludzki kwas nukleinowy kodujący sekwencję dla ludzkiego polipeptydu narastania kości. Połipeptyd ten został następnie chemicznie zsyntetyzowany według sekwencji Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys Ile

9 Lys Pro Asn Thr Leu His Lys Lys Ala Ala Glu Thr Leu Met Val Leu Asp Gln Asn Gln Pro (SEK ID NR 11). Wydaje się prawdopodobne, że aktywny polipeptyd jest dimerem powyższej sekwencji, dimerem utworzonym poprzez mostek dwusiarczkowy pomiędzy dwoma polipeptydami o przedstawionej sekwencji. Zaobserwowano, że szybkość narastania kości u szczurów wzrasta w sposób zależny od dawki przy podawaniu tego chemicznie zsyntetyzowanego związku. Zgodnie z wynalazkiem polipeptyd wykazujący działanie stymulujące kości u ssaków, obejmuje monomer mający sekwencję aminokwasów NH2-Gly-Ile-Gly-Lys-Arg-Thr-Asn -Glu-His-Thr-Ala-Asp-Cys-Lys-Ile-Lys-Pro-Asn-Thr-Leu-His-Lys-Lys-Ala-Ala-Glu-Thr-Leu -Met-Val-Leu-Asp-Gln-Asn-Gln-Pro-CO2H i jego dimery, mające monomery powiązane ze sobą mostkiem dwusiarczkowym pomiędzy resztami cysteiny obu sekwencji. Zgodnie z wynalazkiem polipeptyd wykazujący działanie stymulujące kości u ssaków obejmuje sekwencję, która odpowiada części lub całości sekwencji aminokwasów NH2- G ly -Ile-Gly-Lys-Arg-Thr-Asn-Glu-His-Thr-Ala-Asp-Cys-Lys-Ile-Lys-Pro-Asn-Thr-Leu-His-Lys- Lys-Ala-Ala-Glu-Thr-Leu-Met-Val-Leu-Asp-Gln-Asn-Gln-Pro-CO2H, analogi tej sekwencji, w obrębie której aminokwasy mogą być podstawione, usunięte lub dodane, tak długo, jak długo zachowane jest działanie stymulujące kości u ssaków uzyskane z trójwymiarowej konformacji sekwencji oraz koniugaty polipeptydu lub jego analogów. Polipeptyd wykazujący działanie stymulujące kości u ssaków, według wynalazku, obejmuje dimer peptydu mającego sekwencję, która odpowiada części lub całości sekwencji aminokwasów NH2-Gly-Ile-Gly-Lys-Arg-Thr-Asn-Glu-His-Thr-Ala-Asp-Cys-Lys-Ile-Lys-Pro-Asn-Thr-Leu- His-Lys-Lys-Ala-Ala-Glu-Thr-Leu-Met-Val-Leu-Asp-Gln-Asn-Gln-Pro-CO2H, w którym peptydy dimeru są ze sobą powiązane mostkiem dwusiarczkowym pomiędzy resztami cysteiny odpowiednich peptydów, analogi tej sekwencji, w obrębie której aminokwasy mogą być podstawione, usunięte lub dodane, tak długo, jak długo zachowane jest działanie stymulujące kości u ssaków uzyskane z trójwymiarowej konformacji sekwencji oraz koniugaty polipeptydu lub jego analogów. Polipeptyd wykazujący działanie stymulujące kości u ssaków, według wynalazku, obejmuje monomer mający sekwencję, która odpowiada części lub całości sekwencji aminokwasów NH2-Gly-Ile-Gly-Lys-Arg-Thr-Asn-Glu-His-Thr-Ala-Asp-Cys-Lys-Ile-Lys-Pro-Asn-Thr-Leu- His-Lys-Lys-Ala-Ala-Glu-Thr-Leu-Met-Val-Leu-Asp-Gln-Asn-Gln-Pro-CO2H i jego dimery, w których monomery są połączone ze sobą mostkiem dwusiarczkowym pomiędzy resztami cysteiny obu sekwencji, analogi tej sekwencji, w obrębie której aminokwasy mogą być podstawione, usunięte lub dodane, tak długo, jak długo zachowane jest działanie stymulujące kości u ssaków uzyskane z trójwymiarowej konformacji sekwencji oraz koniugaty polipeptydu lub jego analogów. Sekwencja DNA kodująca polipeptyd wykazujący działanie stymulujące kości u ssaków, według wynalazku, obejmuje sekwencję nukleotydów GGG ATC GGA AAA CGA ACA AAT GAA CAT ACG GCA GAT TGT AAA ATT AAA CCG AAC ACC TTG CAT AAA AAA GCT GCA GAG ACT TTA ATG GTC CTT GAC CAA AAT CAA CCA i sekwencje, które kodują analogi polipeptydu kodowanego przez nią, w których aminokwasy w sekwencji moga być podstawione, usunięte lub dodane, tak długo, jak długo zachowane jest działanie stymulujące kości u ssaków uzyskane z trójwymiarowej konformacji sekwencji w polipeptydzie obejmującym tę sekwencję aminokwasów. Sekwencja DNA kodująca polipeptyd wykazujący działanie stymulujące kości u ssaków, według wynalazku, obejmuje sekwencję nukleotydów GGG ATC GGA AAA CGA ACA AAT GAA CAT ACG GCA GAT TGT AAA ATT AAA CCG AAC ACC TTG CAT AAA AAA GCT GCA GAG ACT TTA ATG GTC CTT GAC CAA AAT CAA CCA i sekwencje, które kodują analogi polipeptydu kodowanego przez nią, w których aminokwasy w sekwencji mogą być podstawione, usunięte lub dodane, tak długo, jak długo zachowane jest działanie stymulujące kości u ssaków uzyskane z trójwymiarowej konformacji sekwencji w polipeptydzie obejmującym tę

10 sekwencję aminokwasów oraz sekwencje, które hybrydyzują z DNA i kodują sekwencję aminokwasów polipeptydu, który objawia działanie stymulujące kości u ssaków. Wektor kodujący polipeptyd wykazujący działanie stymulujące kości u ssaków obejmuje według wynalazku następującą sekwencję DNA: GGG ATC GGA AA A CGA ACA AAT GAA CAT ACG GCA GAT TGT AAA ATT AAA CCG AAC ACC TTG CAT AAA AAA GCT GCA GAG ACT TTA ATG GTC CTT GAC CAA AAT CAA CCA lub sekwencje, które kodują analogi polipeptydu kodowanego przez nią, w których aminokwasy w sekwencji mogą być podstawione, usunięte lub dodane, tak długo, jak długo zachowane jest działanie stymulujące kości u ssaków uzyskane z trójwymiarowej konformacji sekwencji w polipeptydzie obejmującym tę sekwencję aminokwasów. Wektor kodujący polipeptyd wykazujący działanie stymulujące kości u ssaków obejmuje według wynalazku sekwencję DNA: GGG ATC GGA AAA CGA ACA AAT GAA CAT ACG GCA GAT TGT AAA ATT AAA CCG AAC ACC TTG CAT AAA AAA GCT GCA GAG ACT TTA ATG GTC CTT GAC CAA AAT CAA CCA lub sekwencje, które kodują analogi polipeptydu kodowanego przez nią, w których aminokwasy w sekwencji mogą być podstawione, usunięte lub dodane, tak długo, jak długo zachowane jest działanie stymulujące kości u ssaków uzyskane z trójwymiarowej konformacji sekwencji w polipeptydzie obejmującym tę sekwencję aminokwasów i sekwencje, które hybrydyzująz DNA i kodują sekwencję aminokwasów polipeptydu, który objawia działanie stymulujące kości u ssaków. Sposób wytwarzania i oczyszczania białka wykazującego działanie stymulujące kości u ssaków według wynalazku charakteryzuje się tym, że prowadzi się hodowlę w ośrodku hodowlanym komórek transformowanych za pomocą sekwencji DNA zawierającej sekwencję: GGG ATC GGA AAA CGA ACA AAT GAA CAT ACG GCA GAT TGT AAA ATT AAA CCG AAC ACC TTG CAT AAA AAA GCT GCA GAG ACT TTA ATG GTC CTT GAC CAA AAT CAA CCA i następnie otrzymane z ośrodka hodowli białka izoluje się i oczyszcza. Sposób wytwarzania i oczyszczania białka wykazującego działanie stymulujące kości u ssaków, według wynalazku charakteryzuje się tym, że prowadzi się hodowlę w ośrodku hodowlanym komórek transformowanych za pom ocą sekwencji DNA kodującej sekwencję aminokwasów NH2-Gly-Ile-Gly-Lys-Arg-Thr-Asn-Glu-His-Thr-Ala-Asp-Cys-Lys-Ile-Lys-Pro-Asn -Thr-Leu-His-Lys-Lys-Ala-Ala-Glu-Thr-Leu-Met-Val-Leu-Asp-Gln- A sn-g ln-pro-c O2H i następnie otrzymane z ośrodka hodowli białka izoluje się i oczyszcza. Macierzyste komórki według wynalazku są transformowane sekwencją DNA kodującą polipeptyd wykazujący działanie stymulujące kości u ssaków o sekwencji aminokwasów NH2-Gly-Ile-Gly-Lys-Arg-Thr-Asn-Glu-His-Thr-Ala-Asp-Cys-Lys-Ile-Lys-Pro-Asn-Thr-Leu- His-Lys-Lys-Ala-Ala-Glu-Thr-Leu-Met-Val-Leu-Asp-Gln-Asn-Gln-Pro-CO2H lub jej analogami, w których aminokwasy w sekwencji mogą być podstawione, usunięte lub dodane, tak długo, jak długo zachowane jest działanie stymulujące kości u ssaków uzyskane z trójwymiarowej konformacji sekwencji w polipeptydzie obejmującym tę sekwencję aminokwasów. Macierzyste komórki według wynalazku są transformowane sekwencją DNA kodującą polipeptyd wykazujący działanie stymulujące kości u ssaków o sekwencji aminokwasów NH2-Gly-Ile-Gly-Lys-Arg-Thr-Asn-Glu-His-Thr-Ala-Asp-Cys-Ile-Lys-Pro-Asn-Thr-Leu-His- Lys-Lys-Ala-Ala-Glu-Thr-Leu-Met-Val-Leu-Asp-Gln-Asn-Gln-Pro-CO2H lub analogami tej sekwencji, w których aminokwasy w sekwencji mogą być podstawione, usunięte lub dodane, tak długo, jak długo zachowane jest działanie stymulujące kości u ssaków uzyskane z trójwymiarowej konformacji sekwencji w polipeptydzie obejmującym tę sekwencję aminokwasów oraz sekwencji, które hybrydyzują z DNA i kodują sekwencję aminokwasów polipeptydu, który objawia działanie stymulujące kości u ssaków, Sposób wykrywania obecności białka wykazującego działanie stymulujące kości u ssaków według wynalazku charakteryzuje się tym, że zbiera się próbki surowicy krwi ssaków oraz wystawia się przynajmniej część próbki na działanie przeciwciała powiązanego z systemem sprawozdawczym, w obrębie którego przeciwciało jest zdolne wiązać się z polipeptydem mającym sekwencję NH2-Gly-Ile-Gly-Lys-Arg-Thr-Asn-Glu-His-Thr-Ala-Asp-Cys-Lys-Ile-Lys-Pro-

11 Asn-Thr-Leu-His-Lys-Lys-Ala-Ala-Glu-Thr-Leu-Met-Val-Leu-Asp-Gln-Asn-Gln-Pro-CO2H i w obrębie którego wiązanie się razem białka i przeciwciała powoduje, że system sprawozdawczy wykrywa powyższe wiązanie. Białko wykazujące stymulację kości u ssaków według wynalazku obejmuje sekwencję aminokwasów określoną jako SEK ID NR 11 i po podaniu ssakom takim jak szczur potęguje wzrost kości ssaka. Własność wykazywania stymulacji kości u ssaków jest zachowana również w przypadku gdy białko to ma co najmniej 50% homologii z sekwencją oznaczoną jako SEK ID NR 11. Białko wykazujące stymulację kości u ssaków według wynalazku obejmuje sekwencję aminokwasów określoną jako SEK ID NR 11 i jest nim również białko kodowane przez DNA, który hybrydyzuje w wyraźnych warunkach z DNA kodującym białko oznaczone jako SEK ID NR 11. Chimeryczny czynnik stymulujący kości wykazujący działanie stymulujące kości u ssaków obejmuje, według wynalazku, sekwencję aminokwasów oznaczoną jako SEK ID NR 11 lub jej część wykazującą działanie stymulujące kości u ssaków. Polipeptyd wykazujący działanie stymulujące kości u ssaków z układu krążenia jest, według wynalazku, wyizolowany z surowicy krwi, w zasadzie czysty i ma sekwencję końca-n Gly-Pro-Gly-Gly-Ala-Gly-Glu-Thr-Lys-Pro-Ile. Surowica krwi, z której wyizolowany jest polipeptyd wykazujący działanie stymulujące kości u ssaków jest korzystnie surowicą krwi szczura, przy czym polipeptyd ma korzystnie masę cząsteczkową równą około 5000 daltonów oraz dimery, polimery i analogi tego polipeptydu. Zestaw diagnostyczny do określania obecności polipeptydu wykazującego działanie stymulujące kości u ssaków, zdolnego do wywoływania wzrostu szybkości przyłożenia kostnego w próbce, według wynalazku charakteryzuje się tym, że obejmuje przeciwciało polipeptydu mającego sekwencję aminokwasów końca-n Gly-Pro-Gly-Gly-Ala-Gly-Glu-Thr-Lys-Pro-Ile powiązane z systemem sprawozdawczym, w obrębie którego system sprawozdawczy wytwarza wykrywalną odpowiedź, gdy wstępnie określona ilość polipeptydu i przeciwciała są ze sobą powiązane. Korzystnie według wynalazku system sprawozdawczy obejmuje sposoby korelacji odpowiedzi z powyższą wstępnie określoną ilością polipeptydu. Zestaw diagnostyczny do określania obecności polipeptydu wykazującego działanie stymulujące kości u ssaków, zdolnego do wytwarzania wzrostu szybkości przyłożenia kostnego w próbce, według wynalazku charakteryzuje się tym, że obejmuje przeciwciało polipeptydu mającego sekwencję aminokwasów NH2-Gly-Ile-Gly-Lys-Arg-Thr-Asn-Glu-His-Thr-Ala-Asp -Cys-Lys-Ile-Lys-Pro-Asn-Thr-Leu-His-Lys-Lys-Ala-Ala-Glu-Thr-Leu-Met-Val-Leu-Asp-Gln -Asn-Gln-Pro-CO2H, powiązane z systemem sprawozdawczy, w obrębie którego system sprawozdawczym wytwarza wykrywalną odpowiedź, gdy wstępnie określona ilość polipeptydu i przeciwciała są ze sobą powiązane. Korzystnie według wynalazku system sprawozdawczy obejmuje sposoby korelacji odpowiedzi z powyższą wstępnie określoną ilością polipeptydu. Sposób wytwarzania polipeptydu wykazującego działanie stymulujące kości u ssaków i mającego sekwencję aminokwasów końca-n Gly-Pro-Gly-Gly-Ala-Gly-Glu-Thr-Lys- Pro-Ile z surowicy krwi szczura, według wynalazku charakteryzuje się tym, że otrzymuje się frakcje białek z surowicy krwi, usuwa się frakcje białek mających masy cząsteczkowe większe niż daltonów oraz izoluje się polipeptyd przez zebranie białek z kolumny chromatografii cieczowej wysokociśnieniowej w odwróconej fazie, upakowanej żelem krzemionkowym posiadającym dołączone do niego trójwęglowe boczne grupy łącznie z elucją polipeptydu z kolumny, stosując jako rozpuszczalnik do elucji co najmniej 62 do 63 procentowy acetonitryl. Sposób diagnozowania stanu chorobowego takiego jak osteoporoza u ssaków, według wynalazku charakteryzuje się tym, że zbiera się próbki surowicy krwi ssaka, izoluje się z próbki frakcję białka, usuwa się białka mające masy cząsteczkowe większe niż daltonów, wystawia się przynajmniej część próbki na działanie przeciwciała dla polipeptydu o sekwencji aminokwasów NH2-G ly-ile-g ly-lys-a rg-thr-a sn-g lu-h is-thr-a la-a sp-c ys-lys-ile-lys-

12 Pro-Asn-Thr-Leu-His-Lys-Lys-Ala -Ala-Glu-Thr-Leu-Met-Val-Leu-Asp-Gln-Asn-Gln-Pro- CO2H, wzajemnie połączonego z systemem sprawozdawczym, w obrębie którego wiązanie się razem przeciwciała i polipeptydu powoduje, że system sprawozdawczy wykrywa to połączenie, po czym wykrywa się to połączenie i kolejno ustala czy ilość polipeptydu zdolnego wywołać wzrost szybkości przyłożenia kostnego przewyższa wstępnie określony poziom, czy też ilość polipeptydu znajduje się poniżej wstępnie określonego poziomu wskazując na stan chorobowy. Zgodnie z wynalazkiem sekwencja DNA kodująca polipeptyd wykazujący działanie stymulujące kości u ssaków, stanowiąca dojrzały cdna, obejmuje następującą sekwencję nukleotydów ATG ACT GCT CAA AAT ACA GAC CTT AAC CAA CTA TCC AAC AGT TTC ACT TTA GGG ATC GGA AAA CGA ACA AAT GAA CAT ACG GCA GAT TGT AAA ATT AAA CCG AAC ACC TTG CAT AAA AAA GCT GCA GAG ACT TTA ATG GTC CTT GAC CAA AAT CAA CCA. Zgodnie z wynalazkiem, polipeptyd wykazujący działanie stymulujące kości u ssaków i jego sekwencja sygnalna ma następującą sekwencję aminokwasów: NH2-Met Thr Ala Gln Asn Thr Asp Leu Asn Gln Leu Ser Asn Ser Phe Thr Leu Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys Ile Lys Pro Asn Thr Leu His Lys Lys Ala Ala Glu Thr Leu Met Val Leu Asp Gln Asn Gln Pro-CO2H. Poszczególne figury powoływane dalej w opisie odnoszą się kolejno: Figura 1 przedstawia wykres pasm oksytetracykliny w miejscu kształtowania się kości u królika, któremu podano dwa dożylne zastrzyki oksytetracykliny w odstępie 48 godzin. Strzałki pionowe wskazują punkty, w których podano zastrzyki. D wskazuje odległość pomiędzy tymi punktami na wykresie. Optyczne powiększenie x250; mechaniczne powiększenie x 55,6. Odległość ta może być także oszacowana od piku do piku. Figura 2 to kalibracja urządzenia MPV-CD Instrument do pomiaru szybkości przyłożenia kostnych substancji mineralnych. Siatka mikroskopu jest skanowana w wyposażeniu. Mierzone obserwowane odległości są nakreślone w poprzek odległości w siatce. Słupki błędu w skazują+/-1 odchylenia standardowego (S.D.). Figura 3 to kalibracja kolumny Sephadex G50. Wewnętrzna średnica kolumny wynosi 2,5 cm, a długość 90 cm. Faza ruchoma to 20 nm Tris.Cl (ph 7,2) i 50 mm NaCl z szybkością przepływu 2,5 ml/min. Użytymi standardami masy cząsteczkowej były: ludzka IgG (m. cząst. 110K), albumina surowicy wołu (m. cząst. 66K), albumina jaja kurzego (45K) oraz cytochrom C (12, 4K). Składniki były zbierane w dziesięciomililitrowych frakcjach. Przedstawione są absorpcje poszczególnych frakcji (O.D. 280). Figura 4 przedstawia wpływ pewnych składników surowicy na tworzenie się kości. Szybkość tworzenia się kości jest mierzona poprzez znakowanie tetracykliczną, szczegóły tej metody opisano w tekście. Surowica uzyskana ze szczurów zarówno na diecie z wystarczającą ilością wapnia (0,5% wapnia), jak i na diecie z niedoborem wapnia (0,1% wapnia) jest frakcjonowana według rozmiarów cząsteczki poprzez sączenie molekularne (chromatografia żelowa). Badane frakcje miały masy cząsteczkowe pomiędzy 66K i 45K (liczba szczurów w grupie kontrolnej N=3; liczba szczurów w grupie badanej N=4), pomiędzy 45K i 12,5K (N=4 dla grupy kontrolnej; N=4 dla grupy badanej) i poniżej 12,4K (N=4 dla każdej grupy). Frakcje surowicy od dwóch szczurów zostały zbadane na jednym szczurze z usuniętymi przytarczycami o masie g. Są tu 3 kontrolne i 3 badane grupy. Grupa badana, która otrzymała frakcję surowicy o masie cząsteczkowej poniżej 12,4K, wykazała wyższą szybkość przyłożenia kostnych substancji mineralnych niż odpowiadająca jej grupa kontrolna (P<0,05). Słupki błędu wskazują ± 1 błędu standardowego (S.E.). Figury od 5 do 9 przedstawiają pomiary frakcji o masie cząstecz. <12,4K pobrane od szczurów z niedoborem wapnia, które poddano chromatografii cieczowej wysokociśnieniowej (HPLC) z odwróconą fazą na kolumnie C 18. Występuj e tu jednak pik w niektórych przebiegach wymywany przed 55 minutami przy ok. 50% CH3CN (zaznaczony jako c ). Podczas testowania na szczurze z usuniętymi przytarczycami pik ten wykazał widoczny efekt stymulujący porównywalny z innymi pikami (zaznaczonymi jako C,B,D,E). Kontrolny przebieg, przedstawiony na

13 figurze 9, wykonano na surowicy od normalnych szczurów. Na figurach 6 i 8 najwyższe widmo było badane przy długości fali 214 nm. Figura 10 ukazuje aktywność biologiczną materiału wymytego z kolumny C 18. Zebrane piki zostały zliofilizowane i powtórnie rozpuszczone w 2,5 ml buforu. Następnie 0,4 ml tego roztworu wstrzyknięto badanemu zwierzęciu z usuniętymi przytarczycami. Do pojedynczego piku użyto dwóch zwierząt. Znak x wskazuje szybkość u pojedynczego badanego zwierzęcia a słupek reprezentuje średnią. Z powodu małej liczby nie przeprowadzono żadnej analizy statystycznej. Figura 11 przedstawia efekt zależności od dawki materiału w piku C szybkości tworzenia się kości. Stężenie polipeptydu zostało określone przy użyciu odczynnika Belforda. W pierwszej grupie trzech szczurów (środkowy słupek wykresu) użyto 6 mikrogramów na szczura, w drugiej grupie trzech szczurów (ostatni słupek) użyto 12 mikrogramów na szczura. Grupa kontrolna trzech szczurów (pierwszy słupek) otrzymała bufor nośnikowy. Użyto zwierząt ze wstępnie usuniętymi przytarczycami. Występuje tu reakcja zależna od dawki (P<0,05). Słupki błędu wskazują ± 1 błędu standardowego (S.E.). Figura 12 przedstawia elektroforezę na żelu akrylamidowym frakcji surowicy szczura z deficytem wapnia o masie cząst. pomiędzy 30-3K. Surowica z deficytem wapnia została poddana ultrafiltracji z membranami MWCO (ang. molecular weight cut off) oddzielającymi masy cząst. od 30K do 3K, aby otrzymać frakcję o masie cząst. pomiędzy 30K i 3K. 100 mikrogramów oznaczonej odczynnikiem Belforda frakcji nałożono na żel fosforanoakrylamidowy. Żel był nasączony 100 mm Tris.fosforanem, ph 6,9 z 0,1 % SDS. Próbkę zadawano 100mM Tris.fosforanem, ph 6,9 i 0,1% SDS w 60 C przez 30 minut bez czynnika redukującego. Następnie próbka została naniesiona i elektroforezowana przy stałym napięciu 100 V (ok. 8V/cm) przez 2 godziny, a potem zabarwiona błękitem komazynowym (błękitem Coomassie'go). Zidentyfikowano pięć pasm niskich mas cząsteczkowych, które oznaczono jako TA, TB, TE, TF, TG. Figura 13 przedstawia aktywność biologiczną materiału wymytego z pasm elektroforezy na żelu akrylaminowym. Pasma w żelu zostały wycięte, odpowiednio zebrane i wymoczone w 20 mm Tris.Cl (ph 7,2), 50 mm NaCl, 0,1 % Tritonu X, 1mM DTT i 1 mm PMST przez 48 godzin. Wypłukany materiał był ekstensywnie dializowany wobec buforu zawierającego 20 mm Tris.Cl (ph 7,2), 50 mm NaCl, 1 mm PMST i 1 mm DTT z membraną MWCO 3,5K i zatężony do 500 ml. Składniki białka zostały oznaczone przy użyciu odczynnika Belforda, a następnie 24 mikrogramy materiału przebadano na szczurach przed usunięciem przytarczyc jak poprzednio. Do grupy kontrolnej użyto czterech zwierząt, które otrzymały bufor nośnikowy. Jedynie pasma TA (N=3), TB (N=3) i TE (N=4) zawierały wystarczający do badań materiał. TB i TE wykazały znaczący efekt stymulujący formację kości (P<0,025), podczas gdy TA nie wykazało żadnego efektu. Słupki błędu wskazują ± 1 odchylenia standardowego (S.D.). Figura 14 to chromatogram (HPLC na kolumnie C3) ludzkiego polipeptydu wytworzonego w E. coli. Środowisko E. coli zostało odwirowane przy 12000G dwukrotnie, piętnaście minut za każdym razem. Zostało ono zatężono dziesięciokrotnie za pomocą membrany YMS (MWCO 3K). Stężenie soli w środowisku zostało uprzednio ustawione na 100 mm za pomocą fosforanu sodowego (ph 7,2). Dobrze rozpuszczalny pik został wymyty w warunkach podobnych do tych, w jakich wyizolowano peptyd z ludzkiej surowicy, to jest w 62-63% CH3CN. Figura 15 ilustruje wpływ ludzkiego polipeptydu wytworzonego w E. coli na tworzenie kości u szczurów. Szczurom kontrolnym (N=6) wstrzyknięto bufor nośnikowy. Pierwszej grupie badanych szczurów (N=4) 0,7 jednostek O.D. (280 nm) wytworzonego polipeptydu, a drugiej grupie badanych szczurów (N=6) wstrzyknięto 0,3 jednostek O.D. polipeptydu. Wytworzony produkt wykazał aktywność biologiczną (P<0,05) porównaną z grupa kontrolną. Słupki błędu wskazują ± S.D. Figura 16 przedstawia elektroforetyczny żel trycyna-sds chemicznie zsyntetyzowanego polipeptydu (SEQ ID NO: 11).

14 Figura 17 przedstawia podłużny przekrój niższej prawej kości udowej szczura. Niższą nasadę kości długiej wskazuje strzałka oznaczona A. Zacienione obszary przedstawiają odcinki niższej przynasady kości udowej B oraz środek trzonka C tej kości. Figura 18 przedstawia szybkość przyłożenia kostnego (mikrometrów na dzień) u szczurów, którym wstrzyknięto 25 mikrogramów chemicznie zsyntetyzowanego ludzkiego polipeptydu - pierwszy słupek (N=9). Grupie kontrolnej A - drugi słupek (N=9) - wstrzyknięto 1 ml roztworu 0,1% BSA w 0,1% kwasie octowym. Grupie kontrolnej B - trzeci słupek (N=7) - wstrzyknięto 1 ml roztworu 0,1 % BSA w 0,1% kwasie octowym, który był gotowany przez dziesięć minut w celu denaturacji BSA. Figura 19 przedstawia podłużny odcinkowy przekrój niższej prawej kości udowej szczura. Zacienione pola przedstawiają odcinek A niższej nasady kości użytej do pomiaru przyłożenia kostnego. Chrząstkę nasadową wskazuje strzałka B. Figura 20 przedstawia przekrój poprzeczny odcinkowy niższej kości udowej szczura. Pomiary przyłożenia kostnego przebiegały w trzydziestu miejscach kości beleczkowatej odgrodzonej powierzchnią śródkostną nasady niższej kości udowej. Obszar odcinka jest systematycznie pokrywany, wyszukiwane odcinki wskazują przerywane linie, a strzałki pokazują kierunek ruchu podstawki mikroskopu w celu pokrycia powierzchni badanej próbki. Figura 21 graficznie obrazuje zależność od dawki szybkości przyłożenia kostnych substancji mineralnych (w mikrometrach na dzień) u szczurów, według masy (w mikrogramach) chemicznie zsyntetyzowanego ludzkiego polipepydu (SEQ ID NO: 11), (N=4 dla wszystkich grup). Figura 22 graficznie obrazuje zależność od dawki szybkości przyłożenia kostnych substancji mineralnych (w odsetkach zmiany) u szczurów, według masy (w mikrogramach) chemicznie zsyntetyzowanego ludzkiego polipeptydu (SEQ ID NO: 11). OGÓLNA METODOLOGIA Wywołanie stanu nadczynności przytarczyc u szczurów Użytą do wywołania stanu nadczynności przytarczyc dieta z niedoborem wapnia (Catalogue #113034, Lot #0186-3) została nabyta w firmie Dyets, 2508 Easton Avenue, Bethlehem, Pensylvania 18017, USA. Dieta ta zawiera 0,1% wapnia i 0,05% fosforu. Dieta z wystarczającą ilością wapnia (Catalogue #113035, Lot #01864), użyta dla zwierząt kontrolnych, zawiera 0,5% wapnia i 0,05% fosforu, jak precyzuje producent, Dyets. Obie diety zawierają witaminy D w stężeniu równym 1 i.u./g. Diety te są przygotowane w postaci gałek na paletach. Każdemu zwierzęciu podawano 10 gałek przez cały dzień ze zdemineralizowaną wodą. Badane zwierzęta były poddane diecie przez okres dwóch tygodni. Szczury eksperymentalne Standardowym zwierzęciem badanym był szczur Sprague-Dawley z laboratorium Charles River Laboratory. Użyte były samce szczurów ważące w czasie zakupu od 200 g do 250 g. Szczury były trzymane parami w identycznych klatkach. Znakowanie kości tetracykliną w celu określenia szybkości przyłożenia kostnych substancji mineralnych u szczurów (26) Wykazano, że dawka tetracykliny 24 mg/kg wagi ciała, jeżeli jest wstrzykiwana szczurowi dożylnio, zostaje wydalona z układu krążenia w przeciągu pół godziny. Oznacza to, że po tym czasie poziom tetracykliny w surowicy krwi nie jest mierzalny za pomocą biotestu. Wykazano również, że przerywane znakujące dawki od 6 do 24 mg/kg wagi ciała wpływają w tej samej mierze na szybkość przyłożenia kostnego. Tak więc tetracyklina podawana w tym zakresie dawek w sposób przerywany, to jest jako pulsujące etykiety, jawi się jako sposób znakowania kości wystarczający do badań szybkości przyłożenia kostnych substancji mineralnych. Wykazano jednak również, że w miejscach tworzenia kości, w BMU, odkładanie zmineralizowanej substancji podstawowej kości może zostać przerwane. Takie przerwanie zdarza się najczęściej, gdy odstęp czasu pomiędzy dwiema dawkami tetracykliny jest dłuższy niż 7 dni. Przerwanie takie jest możliwe na skutek istnienia w tym samym obszarze powierzchni kostnej substancji podstawowej więcej niż jednej grupy uaktywnionych osteoblastów. To uaktywnienie osteoblastów może być przypadkowe lub nieprzypadkowe. Aby uniknąć wpływu tego zjawiska

15 na pomiary szybkości odkładania się kostnych substancji mineralnych, zastosowano odstęp 48 godzin pomiędzy znakowaniem. Używano wyłącznie chlorowodorku tetracykliny, którego półokres życia w surowicy wynosi 8 godzin, przy zastosowaniu dawki terapeutycznej. Tetracyklina jest wzbudzana za pomocą długich promieni UV (to jest w zakresie bliskim zakresowi niebieskiemu), emitowane jest wtedy jasne, żółte promieniowanie fluorescencyjne, wykrywalne w odcinkach pasma obserwowanego za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Tetracyklina znakuje powierzchnię kości, gdy nowowykształcony kolagen substancji podstawowej zaczyna wchłaniać wapń. Gdy powierzchnia taka jest podzielona na odcinki, tetracyklina uwidacznia się jako żółte pasmo fluorescencyjne. Kolejna podana dawka tetracykliny ujawnia się jako drugie pasmo, umieszczone na powierzchni pierwszego pasma. Odległość pomiędzy dwoma pasmami odpowiada grubości kostnej substancji podstawowej wykształconej w odstępie czasu pomiędzy dwiema dawkami. Szybkość odkładania się kości może być obliczona poprzez podzielenie odległości przez odstęp czasu pomiędzy dawkami. Błędy pomiaru mogą być tu wprowadzone przez cięcia, które nie są prostopadłe do powierzchni rosnącej kości. Aby zredukować ten błąd, użyto jedynie miejsc, w których dwa pasma były oddzielone i równoległe do siebie. Pomiary dokonane w 10 przypadkowo wybranych miejscach spełniających ten warunek, były wybrane tak, aby dać odczyty bliskie średniej arytmetycznej szybkości. Użytym systemem pomiaru był fotometr z świetlnym mikroskopem skaningowym Leitz'a MPV-CD zaopatrzony w źródło promieni UV dostarczanych ze stabilizowanej lampy rtęciowej o mocy 100W. Odcinki były ogólnie powiększane przy użyciu obiektywu x 16, z zastosowaniem ruchomej szczeliny skaningowej; intensywność pasm fluorescencyjnych była wzmacniana i rejestrowana. Sygnał świetlny był przenoszony do wyjścia cyfrowego i rejestrowany profil intensywności tetracykliny. Odległość pomiędzy pikami intensywności przyjęto za odległość pomiędzy dwoma pasmami tetracykliny, jak jest to przedstawione na figurze 1. Urządzenie przenosi błąd mechaniczny poniżej 5%. Mierzona odległość była okresowo kalibrowana za pomocą siatki mikroskopu i uzyskano dobrą korelacje, jak pokazuje figura 2. Miejsca w kośćcu do badań szybkości przyłożenia kostnych substancji mineralnych u szczurów Generalnie, jako miejsce pomiarów wybrano niższą przynasadę prawej kości udowej. Miejsce to znajduje się około 1 mm nad płytką wzrostu niższej kości udowej i rozciąga się ku trzonkowi na odległość około 5 mm. Histologiczne przygotowanie kostnego materiału szczura Próbka kości była wycięta z ciała zwierzęcia po jego uśmierceniu. Następnie była natychmiast utrwalona w 10% wodnym roztworze formaldehydu buforowego do ph 7,2 za pomocą buforu fosforanowego. Niskie ph spowodowałoby wymywanie tetracykliny z kostnej substancji podstawowej. Po 24 godzinach konserwacji próbka była poddana następującej obróbce: 80% etanol 24 godziny 95% etanol 24 godziny Etanol absolutny 24 godziny Etanol absolutny 24 godziny Aceton 24 godziny Ośrodek Spurr'a: aceton, 1:1 24 godziny Ośrodek Spurfa.aceton, 1:4 24 godziny Ośrodek Spurr'a 24 godziny Następnie próbkę osadzono w świeżej zmianie ośrodka Spurr'a i utwardzano w temp. 45 C przez 24 godziny, a potem utwardzano w temp. 80 C przez kolejne 24 godziny. Utwardzony blok pocięto na odcinki o grubości 400 mikrometrów przy użyciu piłowego mikrotomu Leitz'a wyposażonego w ostrze diamentowe. Względnie grube odcinki były oszlifowane pomiędzy płytkami-matówkami, wstępnie zszorstkowanymi za pomocą proszku karborundowego, do końcowej grubości równej około 10 mikrometrów, przy użyciu wody jako smaru. Te cienkie, nie zabarwione odcinki były suszone i osadzone w urządzeniu Permount (Fisher).

16 Usunięcie przytarczyc u szczurów w celu testowania skutku badanego materiału na przyłożenie kostne Samcom szczura Sprague-Dawley o wadze około 200g do 250 g usunięto przytarczyce pod narkozą nembutalną. Przytarczyce zostały zniszczone poprzez powtarzane zamrażanie i rozmrażanie. Jeden tydzień po tej operacji zwierzęta zostały ponownie znieczulone i pobrano im z żyły ogonowej po 0,5 ml krwi. Potem zwierzęta były pozbawione pożywienia przez noc. Następnego ranka zostały ponownie znieczulone i pobrano im z żyły ogonowej po 0,5 ml krwi. Przed i po poście mierzony był poziom wapnia w surowicy. Spadek poziomu wapnia w surowicy w stanie postu do 1,8 mm lub niżej przyjęto jako wskaźnik udanego zabiegu. Wtedy badany materiał był wstrzykiwany do kości ogonowej, po czym następowała pierwsza dawka tetracykliny wstrzykniętej domięśniowo. Druga etykieta tetracykliny była podawana 48 godzin później, po czym po 24 godzinach zwierzęta były uśmiercane poprzez uśpienie dwutlenkiem węgla. Wtedy pobierano próbki kości do pomiaru szybkości przyłożenia kostnych substancji mineralnych. Wstępne przeszukiwanie białek i polipeptydów surowicy szczura za pomocą chromatografii żelowo-sączeniowej Zakres mas cząsteczkowych białek i polipeptydów występujących w surowicy szczura jest szeroki, a liczba białek i peptydów krążących we krwi - bardzo duża. Do początkowej klasyfikacji białkowych składników surowicy na pewne zakresy rozmiarów cząsteczkowych oraz do testowania biologicznego skutku tych klas wywieranego na przyłożenie zmineralizowanej kostnej substancji podstawowej zastosowano metodę chromatografii żelowo-sączeniowej (sączenie molekularne). MATERIAŁY I METODY Użyta została szklana kolumna Pharmacia o wewnętrznej średnicy 2,5 cm i długości 90 cm. Zastosowano Sephadex G 50 z Sigmy, który daje nośnik o średnio drobnych ziarnach. Wysuszony nośnik Sephadexu (25 g) wsypano do kolby stożkowej o pojemności 1000 ml i dodano 800 ml zdejonizowanej wody zawierającej 0,02% NaN3 dodanego w celu spęcznienia suchego nośnika. Mieszaninę tę pozostawiono na noc w temperaturze pokojowej, aby nośnik spęczniał. Po spęcznieniu nośnika, zbiornik do ładowania połączono z górnym końcem kolumny i pozwolono, by spęczniały nośnik osadzał się w kolumnie przez około trzy godziny. Wtedy zbiornik ten został usunięty i zainstalowano górną nasadę kolumny. Następnie kolumna została zrównoważona za pomocą buforu zawierającego 20 mm Tris.Cl ph 7,2 i 50 mm NaCl. Bufor był dostarczany za pomocą skalibrowanej pompki perystaltyęznej (Pharmacia) przy szybkości 2,5 ml na min. W czasie tej procedury zauważono, że nośnik osiadł w kolumnie i niezbędne było stopniowe dopełnienie jej (nośnikiem, aż do całkowitego wypełnienia). Wtedy została ona ponownie zrównoważona za pomocą tego samego buforu przez kolejne trzy godziny w temp. 4 C. Kolumna Sephadex G 50 została skalibrowana za pomocą następujących wzorów mas molekularnych: Ludzka IgG m. cząst ,00 mg BSA m. cząst ,00 mg Albumina jaja kurzego m. cząst ,25 mg Cytochrom C m. cząst ,00 mg. Pochodziły one z firmy Sigma. Do załadunku rozpuszczono je w 2 ml zdejonizowanej wody. Wzorce mas molekularnych zostały załadowane (na kolumnę, przyp. tłum.) i przepuszczone z buforem kalibrującym z szybkością 2,5 ml na min., tak że zebrano 50 frakcji po dziesięć mililitrów. Absorpcja UV przy 280 nm poszczególnych frakcji była mierzona za pomocą spektrofotometru Varian UV/VIS. Użyto czterdziestu samców szczura Sprague-Dawley o masach 173 g i 212 g w momencie przybycia do laboratorium. Cztery spośród tych szczurów zachorowały w czasie eksperymentu (zdiagnozowane jako infekcja układu oddechowego) i zostały wyeliminowane. 36 pozostałych szczurów podzielono na grupy badaną i kontrolną po 18 szczurów na grupę. Szczurom z grupy badanej podawano dietę z niedoborem wapnia, a tym z grupy kontrolnej dietę z wystarczającą ilością wapnia, opisane powyżej. Następnie wszystkie szczury zostały uśmiercone a surowica ze-

17 brana i zgromadzona. Stężenie wapnia i fosforu w zebranej surowicy zmierzono przy użyciu metody i wyposażenie zakupionej w firmie Wortington. Przygotowanie surowicy do chromatografii żelowo-sączeniowej Próbki pośmiertnej krwi pobrane od pojedynczych szczurów odwirowano przy 2000 rpm przez 15 minut w wirówce Beckman J6B, przy użyciu rotora JS 4,2. Surowica od szczurów z tej samej grupy została zebrana razem. PMSF (Sigma) oraz ditiotreitol (Biorad) dodano odpowiednio do stężenia równego 1 mm, po czym surowicę przechowywano zamrożoną w temp. -85 C. Do sączenia molekularnego zamrożona surowica została rozmrożona i odwirowana w wirówce Beckman J2-21 przy g przez 30 minut, przy użyciu rotora JA 17, aby oddzielić próbki poszczególnych materiałów i tłuszcz. Chromatografia żelowo-sączeniowa badanej surowicy szczura Dziesięć mililitrów surowicy załądowano i rozdzielono chromatograficznie przy użyciu tego samego buforu, co przy równoważeniu. Przed załadowaniem kolumna była równoważona buforem przez trzy godziny, a następnie przepuszczono przez nią próbkę przy szybkości przepływu 2,5 ml na minutę, zbierając eluat w 10-mililitrowych frakcjach. Zebrane frakcje były gromadzone według masy cząsteczkowej, a następnie dializowane w 1000 ml 20 mm Tris.Cl ph 7,2 zawierającego 1 mm PMSF i 1 mm DTT, przy użyciu woreczka dializacyjnego Spectrofor o średnicy 2,5 cm z MWCO Dializę prowadzono przez 24 godziny w temp. 4 C, trzykrotnie zmieniając bufor dializacyjny. Próbki po dializie zostały następnie zliofilizowane w liofilizatorze Virtus, a potem przechowywane w temp. -20 C. Badanie biologicznej aktywności frakcji surowicy Istnieje pewna trudność w porównywaniu aktywności frakcji według ich mas ze względu na zróżnicowanie stężeń poszczególnych składników frakcji. Jednemu badanemu zwierzęciu podano odpowiednie frakcje pochodzące od dwóch dowolnie wybranych szczurów. Dawka była rozpuszczona w 0,5 ml 20 mm Tris. Cl ph 7,2 oraz 50 mm NaCl i wstrzyknięta domięśniowo zwierzęciu z usuniętymi przytarczycami. Zaraz potem dożylnio podano mu dawkę chlorowodorku tetracykliny w sposób opisany powyżej. Po 24 godzinach podano następną dożylną dawkę tetracykliny, a po następnych 24 godzinach szczura zabito i oszacowano szybkość przyłożenia kostnych substancji mineralnych, to przedstawiono powyżej. Wstępne wyniki obejmujące izolację polipeptydów szczura Profil elucji znaczników molekularnych przedstawia figura 3 oraz tabela 1 TABELA 1 Profil elucji znaczników molekularnych w sączeniu molekularnym Masa cząsteczkowa Objętość elucji > ml ml ml ml < ml Nie wykryto żadnej niekwestionowanej różnicy pomiędzy stężeniami wapnia i fosforu w surowicy szczurów na diecie z niedoborem wapnia i szczurów na diecie z wystarczającą ilością wapnia, chociaż stężenie wapnia jest niższe u pierwszej grupy (2,55 mm w porównaniu z 2,85 mm dla surowicy szczurów na diecie z wystarczającą ilością wapnia). Stężenie fosforu wynosiło 0,33 mm w pierwszej i 0,43 mm w drugiej grupie szczurów. Różnice te mogą być wynikiem wyrównawczej wtórnej nadczynności przytarczyc u szczurów na diecie z niedoborem wapnia, chociaż nie zostało to potwierdzone testem PTH u tych szczurów.

18 Frakcje surowicy od szczurów kontrolnych i badanych zostały zebrane według zakresów mas cząsteczkowych wyróżnionych w tabeli pierwszej. Spośród 40 szczurów poddanych zabiegowi usunięcia przytarczyc jedynie 25 przeżyło tę operację. Poziom wapnia w surowicy tych 25 szczurów w czasie otrzymywania pokarmu wynosił 2,57 ± S.D. 0,05 mm, a w czasie postu wynosił 1,70 ± S.D. 0,04 mm. Na tej podstawie wysnuto wniosek, że u tych zwierząt operacja udała się. Frakcje o masie cząsteczkowej większej niż oraz pomiędzy i nie zostały zbadane, ponieważ liczba obecnych w nich białek była zbyt wielka, by mogły być one podane w pojedynczej dawce nie powodując chorobowego skutku u zwierząt. Tak więc, badane były tylko trzy frakcje surowicy z wystarczającą ilością wapnia i surowicy z niedoborem wapnia. Do każdej frakcji użyto 4 zwierząt. Jeden ze szczurów, który otrzymał frakcję surowicy z wystarczającą ilością wapnia o masie cząsteczkowej pomiędzy i 45000, padł podczas znieczulenia przy dożylnym podawaniu tetracykliny. Wyniki przedstawia figura 4. Odkryto wystarczająco znaczącą różnicę pomiędzy przyłożeniem kostnych substancji mineralnych szczurów, które otrzymały frakcję z wystarczającą ilością wapnia o masie cząsteczkowej mniejszej niż 14500, i szczurów, które otrzymały odpowiadającą frakcję surowicy z niedoborem wapnia (P<0,05). Te wstępne wyniki wskazywały, że frakcja surowicy zawierająca składniki o masach cząsteczkowych mniejszych niż może wywierać stymulujący skutek na szybkość przyłożenia zmineralizowanej substancji podstawowej kości. Eksperymenty obejmujące składniki surowicy o niskich masach cząsteczkowych uzyskam z surowicy szczura z niedoborem wapnia MATERIAŁY I METODY Użyto pięćdziesięciu samców szczura Sprague-Dawley, o masie ciała pomiędzy 200 g i 250 g. Połowie szczurów podano dietę z niedoborem wapnia, a połowie - dietę z wystarczającą ilością wapnia. Szczury te zostały uśmiercone poprzez uśpienie w dwutlenku węgla po przebywaniu na odpowiedniej diecie przez 2 tygodnie. Pośmiertną krew pobrano poprzez nakłucie serca natychmiast po śmierci, przenosząc ją do ampułki próżniowej do surowicy. Surowica była zbierana poprzez odwirowywanie na wirówce Beckman J6B przy 2000 rpm przez 20 minut w temp. 4 C. Próbki surowicy gromadzono z podziałem na surowicę badaną (z niedoborem wapnia) i surowicę kontrolną (z wystarczającą ilością wapnia), a 100 mikrolitrów użyto do oszacowania stężeń wapnia i fosforu. PMSF (fluorek fenylometylosulfonylowy) oraz DTT (ditiotreitol) dodano odpowiednio do stężenia 1 mm, po czym surowicę zamrożono w temp. -85 C. Procedura frakcjonowania surowicy szczura: chromatografia żelowo-sączeniowa i następująca po niej hplc w odwróconej fazie Wstępne sączenie molekularne z użyciem kolumny Sephadex G 50 przeprowadzono w sposób opisany powyżej. Frakcję o masie cząsteczkowej < zebrano, poddano dializie i zliofilizowano jak poprzednio. Zliofilizowany materiał rozpuszczono w 5 ml buforu składającego się z 25 mm Tris. Cl ph 7,5, 150 mm NaCl, 1 mm PMSF oraz 1 mm DTT. Stwierdzono, że część materiału nie jest rozpuszczalna; została ona zgranulowana poprzez odwirowanie w wirówce Beckman J2-21 przy g, przy użyciu rotora JA 17, i usunięta. Do oznaczania białek użyto 800 mikrolitrów rozpuszczonego materiału. Odpowiednio, 0,5 mg materiału i 1 ml powyższego buforu przesączono przed załadowaniem na kolumnę przez sączek do próbek firmy Hewlett Packard. Użytą kolumną była preparatywna kolumna C 18 firmy Beckman, 2,12x150 cm. Systemem doprowadzania rozpuszczalnika był systemem doprowadzającym Beckman Gradient Solvent z detektorem Beckman UV model 167. Dane były analizowane przy użyciu oprogramowania Beckman System Gold. Próbkę wstrzyknięto ręcznie za pomocą strzykawki Valeo i wymywano przy szybkości strumienia 2 ml na minutę. Gradient został ustalony w następujący sposób: Rozpuszczalnik A: woda z 0,1% kwasem trifluorooctowym Rozpuszczalnik B: 95% acetonitryl w wodzie z 0,1% kwasem trifluorooctowym

19 Program: 0-5' 100% A 0% 5-75' 40% A 60% B 75-80' 100% A 0% B 80' Koniec Frakcje były zbierane co 0,5 minuty w zbiorniku frakcji firmy Gilson Model 202 i odpowiadające piki czterech przepływów gromadzone oraz liofilizowane. Stężenie wapnia w zgromadzonej surowicy grupy badanej wynosiło 2,50 mm, a dla zebranej surowicy grupy kontrolnej 2,87 mm. Stężenie fosforu było równe 0,35 mm dla surowicy badanej i 0,45 mm dla surowicy kontrolnej. Stężenia białek w ponownie rozpuszczonym po zliofilizowaniu materiale wynosiły 1,2 mg na ml dla próbki badanej i 1,5 mg ml dla próbki kontrolnej. Profile elucji dla materiału badanego i kontrolnego przedstawiają figury od 5 do 9. Zauważono pewne różnice pomiędzy profilami elucji przepływów surowicy badanej i surowicy kontrolnej. W materiale badanym obecny był odrębny pik wymyty jeszcze przed 55 minutami w trzecim spośród czterech przepływów. W materiale kontrolnym wystąpiły dwa piki pojawiające się tuż po 55 minutach. Badanie wpływu frakcji otrzymanych z surowicy szczurów na diecie z niedoborem wapnia na szybkość przyłożenia kostnego MATERIAŁY I METODY Biologiczne badania skutków działania różnych frakcji na szybkość przyłożenia kostnych substancji mineralnych były prowadzone tylko dla surowicy grupy badanej. Celem tych doświadczeń było znalezienie składnika mającego aktywność biologiczną. Odpowiadające piki z 4 przepływów były więc zgromadzone i rozpuszczone w 2,5 ml 10 mm Tris.Cl ph 7,2 i 50 mm NaCl. Do badań użyto materiału o objętości 0,8 ml, a pozostały materiał zamrożono do dalszego użycia. Dziesięciu szczurom usunięto przytarczyce i każdemu badanemu zwierzęciu wstrzyknięto po 0,4 ml materiału zebranego z każdego piku. Do każdego z pięciu zebranych pików, oznaczonych od A do E na figurach od 5A do 8, użyto po dwa zwierzęta. Szybkość przyłożenia kostnych substancji mineralnych została oszacowana poprzez znakowanie tetracykliną według metody już opisanej. Spośród pięciu badanych pików, piki A, B, D i E wykazały mniej więcej taki sam wpływ na szybkość przyłożenia kostnych substancji mineralnych, podczas gdy pik C wykazał się jako powodujący większą szybkość niż inne grupy, patrz figura 10. Zależność od dawki szybkości przyłożenia kostnych substancji mineralnych dla konkretnej frakcji wyodrębnionej z surowicy szczura metodą hplc w odwróconej fazie Materiał z piku C (1,7 ml) rozpuszczono i pobrano z niego próbkę 400 mikrolitrów, którą rozcieńczono do 800 mikrolitrów w celu oznaczenia stężenia białka metodą Belforda. W pozostałej części ustawiono za pomocą tego samego buforu rozpuszczającego stężenie równe 3 mikrogramy na 100 mikrolitrów. Dziewięciu szczurom usunięto przytarczyce, stężenia wapnia w ich surowicy pobranej w czasie postu i w czasie podawania pożywienia wykazały skuteczność operacji. Trzy szczury otrzymały 6 mikrogramów badanego materiału z piku C w objętości 200 mikrolitrów, poprzez zastrzyk dożylny. Trzy szczury otrzymały 3 mikrogramy materiału poprzez wstrzyknięcie objętości doprowadzonej do 200 mikrolitrów za pomocą buforu rozpuszczającego. Trzy szczury otrzymały 200 mikrolitrów buforu rozpuszczającego jako grupa kontrolna. Szybkość przyłożenia kostnych substancji mineralnych oznaczano w sposób opisany uprzednio. Szybkość przyłożenia u szczurów kontrolnych oznaczono jako równą 0,81 mikrometrów na dzień (S.D.=0,09), dla szczurów, które otrzymały 3 mikrogramy piku C, 1,51 mikrometrów na

20 dzień (S.D.=0,23) i dla szczurów, które otrzymały 6 mikrogramów piku C, 2,36 mikrometrów na dzień (S.D.=0,25). Wystąpiła tu znacząca różnica pomiędzy grupami (P<0,05). Patrz figura 11. W ten sposób wykazano, że klasa białek lub peptydów odkryta w surowicy szczurów poddanych diecie z niedoborem wapnia przez dwa tygodnie jest zdolna stymulować przyłożenia kostnych substancji mineralnych u szczura. Efekt ten jest zależny od dawki do 6 mikrogramów na około 300 g szczura. Elektroforetyczne frakcjonowanie frakcji o niskiej masie cząsteczkowej surowicy szczurów na diecie z niedoborem wapnia Składniki surowicy mające masy cząsteczkowe mniejsze niż zostały poddane chromatograficznemu rozdzieleniu według mas cząsteczkowych za pomocą elektroforezy żelowej na żelu poliakrylowym. MATERIAŁY I METODY 20 samcom szczura Sprague-Dawley podawano dietę z niedoborem wapnia przez trzy tygodnie. Masa zwierząt w momencie przybycia do laboratorium wynosiła od 209 g do 245 g. Po dwóch tygodniach diety ich masa wynosiła od 248 g do 302 g. Następnie szczury zostały uśmiercone poprzez uśpienie dwutlenkiem węgla, a pośmiertna krew pobrana poprzez nakłucie serca. Próbki surowicy zebrano i zgromadzono w sposób opisany powyżej. Stężenie wapnia w surowicy oznaczano na 2,56 mm, a fosforu na 0,33 mm. Całkowita objętość surowicy wynosiła 92 ml. Dodano PMSF i DTT odpowiednio do stężenia 1 mm. Następnie surowicę odwirowano przy g przez 30 minut w wirówce Beckman J2-21, przy użyciu rotora JA 17. Zbierana i zatężana poprzez ultafiltrację była frakcja o masie cząsteczkowej pomiędzy 3000 i Surowica była najpierw ultrafiltrowana w zatężaczu Amicon 50 ml z błoną YM 30, punkt oddzielenia masy cząsteczkowej wynosił Przesącz zbierano. Gdy objętość pozostałości spadła z początkowej 92 ml do 10 ml, dodano bufor zawierający 10 mm Tris.Cl ph 7,2, 50 mm NaCl, 1 mm PMSF oraz 1 mm DTT i dalej prowadzono ultrafiltrację aż do zmniejszenia się objętości pozostałości z powrotem do 10 ml. Drugi przesącz połączono z pierwszym, a końcowa pozostałość została wyrzucona. Zebrany przesącz był dalej poddawany ultrafiltracji, przy użyciu tego samego zatężacza, z błoną YM 3, punkt oddzielenia masy cząsteczkowej wynosił Tym razem odrzucony został przesącz a pozostałość zachowana. Gdy objętość pozostałości spadła do 10 ml, dodano do niej 40 ml tego samego, co wcześniej, buforu i ultrafiltrację kontynuowano. Procedura ta została raz powtórzona. Gdy końcowa objętość pozostałości spadła do 10 ml, przeniesiono ja do drugiego zatężacza Amicon ze zdolnością 10 ml i dalej zatężano do końcowej objętości 1 ml. Ultrafiltrację prowadzono przy 55 psi oczyszczonego azotu w temp. 4 C. Elektroforeza na żelu akrylamidowym Użyto aparatu pionowego Hoeffer Mighty Smali. 15% żel fosforanowy o grubości 0,75 mm był rozwijany i elektroforezowany w następujący sposób: Żel rozdzielający 30% akrylamid (19:1) 15 ml 1 M Tris. fosforan ph 6,9 3 ml 10% SDS 0,3 ml 10% nadtlenodwusiarczan amonowy 150 μl TEMED 50 μl Woda do 30 μl Żel wypełniający 30% akrylamid (19:1) 2,3 ml 1 M Tris.fosforan ph 6,9 1 ml 10% SDS 0,1 ml 10% nadtlenodwusiarczan amonowy 50 μl TEMED 30 μl Woda do 10 ml Bufor 1 M Tris.fosforan ph 6,9 15 ml 10% SDS 3 ml Woda do 300 ml

21 Żel poddano wstępnej elektroforezie przy stałym napięciu 100 V przez 30 minut. Próbki elektroforezowano przy stałym napięciu 100 V przez 2 godziny. W chłodnicy aparatu krążyła woda o temperaturze 20 C. Stężenie białek oszacowano metodą Belforda. Do próbki dodano Tris.fosforan ph 6,9 oraz SDS do końcowego stężenia równego stężeniu buforu. Stężenia białka ustawiono na 100 mikrogramów na 15 mikrolitrów. Całkowita objętość próbki była równa 1,65 ml. Przed naniesieniem na żel próbkę inkubowano przez 30 minut w temp. 60 C. Znacznik niskiej masy cząsteczkowej BDH potraktowano w ten sam sposób, jak próbkę. Stężenie ustawiono na 1 mikrogram pojedynczego znacznika na 12 ml. 15 mikrolitrów próbki oraz znacznik naniesiono do zbiorników o średnicy 0,5 cm. Wyniki elektroforezy na żelu fosforanowym przedstawia figura 12. Jest tu jedno bardzo duże i kilka mniejszych pasm wyższych mas cząsteczkowych. Obecnych jest także kilka pasm niższych mas cząsteczkowych, które oznaczono jako TA do TE. Biologiczna aktywność składników surowicy szczura frakcjonowanych za pom ocą elektroforezy żelowej Zbadane biologiczne aktywności poszczególnych pasm w żelu fosforanowym przedstawia figura 12. Rozdzielono chromatograficznie i zbadano 1,5 ml ultrafiltrowanej próbki pozostałej z poprzedniej części. Stężenie próbki ustawiono za pomocą tego samego buforu nośnikowego, zawierającego 100 mm Tris.fosforanu (ph 6,9), 0,1% SDS. Następnie, przed naniesieniem, próbka była inkubowana w temp. 60 C przez 30 minut. Żel akrylamidowy został przygotowany tak samo, jak w poprzedniej części, z tym, że jego grubość wynosiła 1 mm. Naniesiona do zbiornika objętość wynosiła 20 mikrolitrów na zbiornik. Żel poddano wstępnej elektroforezie przez pół godziny, a następnie elektroforezowano próbkę przy stałym napięciu 100V przez dwie godziny. Całkowitą objętość 1,5 ml elektroforezowano na 10 porcjach żelu. Materiały o wyższych masach cząsteczkowych nie były badane. Pięć pasm, od TA do TE, wycięto, po uprzednim zabarwieniu błękitem komazynowym (błękit Coomassiego, przyp. tłum.). Odpowiednie pasma zebrano i zagruntowano w postaci małych kawałków w rurkach ze szkła krzemionkowego, w 5 ml buforu zawierającego 10 mm Tris.Cl (ph 7,2), 50 mm NaCl, 1 mm DTT, 1 mm PMSF oraz 0,1% Tritonu X-100, przez 24 godziny w temp. 4 C. Po wymoczeniu bufor został przeniesiony do spektroforowego woreczka dializacyjnego z błona MWCO Materiał był dializowany wobec 100-krotnej objętości buforu zawierającego Tris.Cl (ph 7,2), 50 mm NaCl i 1 mm DTT w temp. 4 C przez 48 godzin przy użyciu 5 zmian buforu. Zdializowane próbki były następnie zatężane do 500 mikrolitrów za pomocą zatężacza Amicon o zdolności 10 ml, przy użyciu błony YM 3 z MWCO mikrolitrów próbki rozcieńczono wodą do 800 mikrolitrów i oszacowano w niej stężenie białka przy użyciu odczynnika Belforda. Za pomocą buforu dializacyjnego doprowadzono stężenia materiałów do 12 mikrogramów na 100 mikrolitrów. Szesnastu samcom szczura Sprague-Dawley usunięto przytarczyce w celu przeprowadzenia testów ze znakowaniem tetracykliną w sposób opisany powyżej. Poziom wapnia w ich surowicy przed i po usunięciu przytarczyc wynosił odpowiednio 2,51 (S.D. = 0,002) i 1,53 (S.D. = 0,001). Materiał (200 mikrolitrów) wstrzyknięto każdemu zwierzęciu. Do badania materiału wymytego z każdego pasma użyto po 4 szczury. Czterem szczurom grupy kontrolnej wstrzyknięto 200 mikrolitrów buforu nośnikowego. Spośród pięciu zebranych pasm trzy zawierały materiał wystarczający do badań. Dostępne ilości materiałów wynosiły 50 mikrogramów dla pasma TE, 55 mikrogramów dla pasma TB oraz 59 mikrogramów dla pasma TA. Stężenia białek dla pasm TC i TD były zbyt małe, aby mogły być wykryte, i nie zostały one zbadane. Jeden szczur, który otrzymał TA, oraz jeden, który otrzymał TB, padł na skutek znieczulenia w czasie nakłuwania żyły ogonowej. Figura 13 ukazuje wpływ badanego materiału na szybkość przyłożenia kostnych substancji mineralnych u szczurów z usuniętymi przytarczycami. Grupa kontrolna szczurów, która

22 otrzymała bufor, wykazała szybkość przyłożenia równą 1,27 mikrometra na dzień (S.D. = 0,21 ). Szczury, które otrzymały badany materiał, wykazały szybkość równą 1,27 mikrometra na dzień (S.D. = 0,21), 2,14 mikrometra na dzień (S.D. = 0,14) oraz 2,24 mikrometra na dzień (S.D. = 0,28) odpowiednio dla pasm TA, TB i TE. Szybkości dla pasm TB i TE były znacząco wyższe, niż u grupy kontrolnej i dla pasma TA (P<0,025). Widać także, że w tym doświadczeniu z niewyjaśnionych przyczyn szybkość dla grupy kontrolnej jest wyższa niż w poprzednim doświadczeniu. Doświadczenie wykazało więc, że są co najmniej dwa aktywne polipeptydy, o masach cząsteczkowych równych około 6-6,5 kilodaltonów (TB) i około kilodaltonów (TE). Relacja pomiędzy tymi dwoma polipeptydami nie jest znana na podstawie tych wyników. Oznaczenie sekwencji aminokwasów w pasmach wyizolowanych ze składników frakcjonowanej elektroforetycznie surowicy szczura MATERIAŁY I METODY Do sekwencjonowania użyto 100 mikrolitrów materiału otrzymanego z opisanej wcześniej ultrafiltracji. Materiał ten został rozcieńczony o stężenia równego 100 mikrogramów na 15 mikrolitrów przy użyciu buforu o następującym składzie: 100 m M Tris. fosforanu ph 6,9, 0,1%SDS, 1 mm DTT oraz 50 mm NaCl. Elektroforezę na żelu fosforanowym przeprowadzono w ten sam sposób, jak zostało to opisane w poprzedniej części. Grubość żelu wynosiła 1 mm. Na żel naniesiono 100 mikrolitrów materiału w pięciu szlakach i użyto znaczników masy cząsteczkowej BD H. Zastosowano małą jednostkę transferową Hoeffer'a. Żel nałożono na błonę PVDF (Millipore) i przez 1 godzinę prowadzono proces transferu przy stałym napięciu równym 250 V. W procesie tym została użyta podwójna warstwa błony, aby mieć pewność, że wszystkie białka znajdujące się w żelu zostały przez nią zatrzymane. Po zakończeniu transferu błonę wybarwiono błękitem komazynowym, następnie wycięto z niej pojedyncze pasma do znakowania. Sekwencja została oznaczona w laboratorium sekwencjonowania według dobrze znanej procedury: Sekwencja TB (SEQ ID NO:1): Gly Pro Gly Gly Ala Gly Glu Thr Lys Pro Ile Sekwencja TE (SEQ ID NO:2): Gly Pro Gly Gly Ala Gly Glu Odkryto zatem, że TB i TE są spokrewnionymi ze sobą peptydami, co najmniej sześć pierwszych aminokwasów z ich końców-n ma tę samą sekwencję. Z rezultatów tych nie wynika jasno, czy TB jest aktywnym fragmentem TE, lub TE jest dimerem TB. Eksperymenty obejmujące syntetyczny ludzki polipeptyd Przeszukiwanie ludzkiej biblioteki cdna w celu znalezienia sekwencji dna kodującej polipeptyd z układu krążenia Na bazie sekwencji aminokwasów określonej dla polipeptydu wyizolowanego z surowicy szczura zsyntetyzowano sondę kwasu nukleinowego i przeszukano ludzka bibliotekę cdna. Jak wiadomo, głównym miejscem syntezy białek i polipeptydów surowicy układu krążenia jest wątroba. Znany jest też fakt, iż pacjenci cierpiący na chroniczne zaburzenia wątroby, zwykle cierpią także na utratę kości. Z tego powodu przeszukiwaniu poddano bibliotekę ludzkiego cdna pochodzącego z tkanki wątroby. MATERIAŁY I METODY Wyizolowane cdna z biblioteki płodu Użyto ludzkiej biblioteki cdna z Clontech. Biblioteka ta była przygotowana z ludzkiego 22-tygodniowego płodu o nieokreślonej płci. Matka miała grupę krwi 0 (katalog #HL1064A). Do wyizolowanego z wątroby mrna dołączono primer oligod T i przy użyciu odwrotnej transkryptazy zsyntetyzowano pierwszą nić cdna. Następnie otrzymany produkt poddano trawieniu za pomocą nukleazy S1 i przy użyciu polimerazy DNA dosyntetyzowano drugą nić. Otrzymana tępo zakończona podwójna nić DNA została połączona z łącznikiem ECoR1 i wklonowana do faga lambda gt10. Następnie była namnażana biblioteka cdna. Wykonano serie rozcieńczeń tej biblioteki przy użyciu pożywki SM. Sporządzono kulturę E. coli C600 hfl w pożywce LB zawierającej

23 ,2% maltozę i prowadzono hodowlę w stałej fazie późnego wzrostu (zwykle po jednej nocy hodowania). Objętość 100 mikrolitrów zawiesiny rozcieńczonej biblioteki dodano do 300 mikrolitrów SM i 600 mikrolitrów hodowanej przez noc kultury E. coli C600 hfl, a otrzymaną mieszaninę inkubowano przez 20 minut w temp. 37 C. Potem zawiesinę tę umieszczono w 3 ml 0,7%) agarozy i trzymano w stanie ciekłym w 50 C. Następnie natychmiast wylano j ą na okrągłą szalkę o średnicy 90 mm zawierającą pożywkę LB zestaloną agarem i uprzednio ogrzaną do temp. 37 C. Wylana agaroza uległa zestaleniu w temperaturze pokojowej, po czym szalki z kulturą były inkubowane w temperaturze 37 C aż do pojawienia się widocznych łysinek, to jest łysinek o średnicy trochę mniejszej niż 1 mm. Rozcieńczenie, które dawało miano odpowiadające łysinek na szalkę, zaznaczono i użyto do dalszego namnażania. Następnie biblioteki cdna zostały unieruchomione na błonie nitrocelulozowej. Każdą bibliotekę cdna utrzymywano na poziomie stężenia łysinek na szalkę o średnicy 90 mm. Gdy łysinka osiągnęła średnicę nieco mniejszą od 1 mm, szalkę zostawiano na noc w temp. 4 C. Następnego dnia na powierzchni agarozy rozłożono nitrocelulozową bibułę 0,45 z Amersham i pozostawiono ją na 3 minuty. Przy użyciu igły błona została nakłuta do szalki agarowej, w trzech lub więcej asymetrycznie rozłożonych miejscach, w celu przyszłego porównania błony (lub jej radiografu) do szalki. Następnie błonę ściągnięto i ułożono stroną DNA do góry na szalkę do hodowli, zawierającą 0,4N NaOH, tak aby pływała w tej pozycji przez 20 minut. Wtedy została ona przeniesiona do 6xSSC na 20 minut i wysuszona powietrzem w celu przygotowania do hybrydyzacji. Za pomocą syntetyzera oligonukleotydów Cyclone-plus (Milligen) i przy użyciu chemii fosfoarmidytów zsyntetyzowano sondę oligonukleotydową, składającą się z 32 merów. Sonda ta została zsyntetyzowana z grupą DMT pozostawioną nienaruszoną do następnego oczyszczenia poprzez HPLC w odwróconej fazie. Zsyntetyzowano ją w ilości 0,2 mikromola. Po syntezie usunięto z sondy grupy osłaniające za pomocą 4 ml wodorotlenku amonowego, prowadząc ten zabieg przez 24 godziny w temperaturze pokojowej. Odblokowany materiał wysuszono w zatężaczu Speedvac w 4 porcjach. Użyta sonda kwasu nukleinowego miała następującą sekwencję (SEQ ID NO:3): Gly Pro Gly Gly Ala Gly Glu Thr Lys Pro 5 -GG(TC)CC(TC)GG(TC)GG(TC)GC(TC)GG(TC)GA(AG)AC(TC)AA(AG)CC(TC)AT-3 Zasady w nawiasach wskazują zdegenerowane kodony. Hipotetycznemu białku, odpowiadającemu temu kwasowi nukleinowemu, nadano numer identyfikacyjny SEQ ID NO:4. Sondę oczyszczono za pomocą HPLC w odwróconej fazie. Całość wysuszonego materiału rozpuszczono w 1 ml 100 mm TEAA (ph 7,0). Próbkę przesączono przez sączek do próbek firmy Hewlett Packer i naniesiono na półpreparatywną kolumnę C 18 semiprep Beckman o wymiarach 7,5x150 mm. Następnie rozdzielano ją chromatograficznie na urządzeniach firmy Beckman w sposób opisany uprzednio. Program gradientów był następujący: Rozpuszczalnik A: Rozpuszczalnik B: 100 mm TEAA ph 7,2 Acetonitryl Czas (minuty) Czas trwania 0 95% A 5% B 5 80% A 40% B % A 50% B % A 5% B 5 65 KONIEC

24 Niewłaściwa (uszodzona, przyp. tłum.) sekwencja wypłynęła jako pierwsza, a właściwa (nieuszkodzona, przyp. tłum.) sekwencja - około 35 minut później. Pik został zebrany i wysuszony. Następnie dodano 1 % TFA, aby usunąć DMT, i ponownie próbkę wysuszono. Aby zobojętnić pozostający po wysuszeniu TFA, dodano objętość 100 mikrolitrów 3% wodorotlenku amonowego. Materiał ponownie wysuszono i rozpuszczono w wodzie. 100 mikrolitrów rozpuszczonego materiału przepuszczono przez spun-kolumnę G25 o objętości 0,1 ml, a następnie zmierzono stężenie DNA poprzez pomiar absorpcji przy 260 nm. Przyjęto, że jednostka 1 O.D. przy 260 nm odpowiada stężeniu około 33 mikrogramów na mililitr. Następnie sondę poddano działaniu kinazy. 50 pmoli sondy poddano działaniu kinazy przy użyciu kinazy DNA T4 (Pharmacia) z 50 pmolami ATP znakowanego izotopem fosforu P-32 o aktywności >3000 Ci na mol i 10 uci/mikrolitr (Amersham). Sonda została następnie zastosowana do hybrydyzacji z DNA unieruchomionym na błonie nitrocelulozowej. Wysuszone nitrocelulozowe błony inkubowano w temp. 42 C w roztworze do prehybrydyzacji przez dwie godziny. Objętość roztworu wynosiła 50 ml. Następnie do roztworu dodano 50 pmoli znakowanej sondy i pozostawiono do hybrydyzacji w temp. 42 C na noc. W 50 ml roztworu do hybrydyzacji umieszczono 50 błon. Następnego dnia każdą błonę przemyto czterokrotnie w 300 ml 2xSSC w temperaturze pokojowej, każdorazowo około pięciu minut. Następnie błony inkubowano w 50 ml 1xSSC w temp. 68 C przez 1 godzinę, przemyto jeden raz w 1xSSC w temperaturze pokojowej i wysuszono. Na każdą nakłutą część bibuły nakroplono objętość 1 mikrolitra radioaktywnego znacznika (którego 0,5 ml daje 1000 cykli na sekundę), aby zaznaczyć pozycję błony. Następnie błony nałożono na superczuły film Amersham hyper film z ekranem wzmacniającym, pozostawiając je na 18 godzin w temperaturze 85 C. W celu uzyskania potwierdzenia dodatni klon był jednokrotnie przeszczepiony i namnażany na szalce agarozowej oraz poddany ponownej hybrydyzacji. Po przeszukaniu łysinek zidentyfikowano jeden dodatni klon. Amplifikacja sekwencji cdna ludzkiego czynnika wzrostu kości, obecnego w układzie krążenia Klon cdna był namnażany według procedury Maniatisa i in. (27). Dodatnia łysinka HL 1-7 została pobrana za pomocą sterylnej pipety Pasteura i umieszczona w 1 ml 60% SM i 40% gliceryny najpierw w temp. 37 C przez 2 godziny, a następnie w temp. 4 C przez noc. W 10 ml pożywki LB z 0,2% maltozą zaszczepiono jedną kolonię E. coli C600 hfl. Kultura rosła przez noc w temp. 37 C w inkubatorze ze wstrząsaniem (Queue) przy 200 rpm. Następnego ranka zaszczepiono 100 mikrolitrów zawiesiny HL 1-7 w 300 mikrolitrach SM i 600 mikrolitrach hodowanej przez noc kultury E. coli C600 hfl, po czym inkubowano w temp. 37 C przez 20 minut. Oczko tej kultury zostało następnie rozsmarowane na szalce z agarem LB i inkubowane w temp. 30 C, dopóki nie pojawiły się widoczne kolonie. Poszczególne kolonie wyselekcjonowano, ponumerowano i każdą z nich rozsmarowano ezą na dwóch szalkach z agarem LB. Jedna z szalek była inkubowana w temp. 30 C, a druga w temp. 40 C. Jedynie kolonie, które rosły w temp. 30 C a lizowały w temp. 40 C, zostały użyte do namnażania HL 1-7. Jedna lizogenizowana kolonia HL 1-7 została zaszczepiona w 10 ml pożywki LB zawierającej 0,2% maltozę i hodowana w inkubatorze ze wstrząsaniem w temp. 30 C aż do zgęstnienia. Zmierzono O.D. przy 600 nm. Przyjęto, że jednostka 1 O.D. przy 600 nm odpowiada stężeniu E. coli równemu 8x108 komórek na ml. Objętość 500 ml podgrzanej pożywki NZCYM użyto do zaszczepienia 1010 komórek i następnych 500 ml tej pożywki zostało podobnie zaszczepionych. W obu butlach z pożywką prowadzono hodowlę przez noc w inkubatorze ze wstrząsaniem przy 200 rpm w temp. 37 C. Następnego ranka do każdej 500-mililitrowej kultury dodano 10 ml chloroformu i kontynuowano inkubację przez 30 minut. Po schłodzeniu kultur do temperatury pokojowej dodano DNAzę i RNAzę do stężenia 1 mikrogram na ml. Przez pół godziny kultury były przechowywane w temperaturze pokojowej, a następnie dodano do nich NaCl do stężenia 1 M. Kultury pozostawiono na lodzie przez jedną godzinę, a następnie w ciągu 10 minut odwirowano szczątki bakteryjne przy użyciu siły g nie większej niż Do każdej z 500-mililitrowych kultur dodano 50 g PEG 8000, a po rozpuszczeniu PEG kultury pozostawiono

25 na lodzie na następną godzinę. Fag został zgranulowany poprzez odwirowanie w temp. 4 C przy g przez 10 minut, a sklarowana ciecz - odrzucona. Z osadu ponownie utworzono zawiesinę w 16 ml TM i poddano jednorazowej ekstrakcji z równą objętością chloroformu. Do fazy wodnej dodano 4 ml gliceryny, po czym przeprowadzono odwirowywanie w gradiencie w następujący sposób. Warstwę CsCl (s.gr. 1,6) ułożono na dnie sterylnej tuby ultrawirówki Beckman'a, a na niej ułożono warstwę CsCl (s.gr. 1,4). Zawiesinę HL 1-7 naniesiono na gradient CsCl i odwirowywano przy rpm w temp. 4 C przez 2 godziny w ultrawirówce Beckman L8-70, przy użyciu rotora Ti60 z ustawionym kątem. Cząstki faga pojawiły się jako niebieski prążek pomiędzy dwiema warstwami gradientu CsCl. Przy użyciu igły zamocowanej na strzykawce cząstki te zostały odessane z tuby wirówki poprzez nakłucie jej ścianki. Zawiesinę wyekstrahowano jednokrotnie fenolem, następnie jednokrotnie mieszaniną fenol/chloroform 1:1, następnie dwukrotnie chloroformem. DNA faga został odzyskany poprzez strącenie etanolem (dodanie NaCl do stężenia 0,5 M i dwóch objętości etanolu, a następnie mrożenie w temp. -85 C przez 10 minut). Ilość zebranego DNA oszacowano metodą absorpcji przy 260 nm. Rozmiar otrzymanego DNA został następnie określony przy użyciu elektroforezy na żelu agarozowym. 15 mikrogramów DNA HL 1-7 poddano trawieniu w objętości 150 mikrolitrów buforu trawiącego, zawierającego bufor 2xPharmacia one-phor-all. Trawienie prowadzono przy użyciu 25 jednostek ECoR1 (Pharmacia) w temp. 37 C przez 1,5 godziny. Po trawieniu DNA oczyszczono za pomocą ekstrakcji fenolowo-chloroformowej i strącania etanolem w sposób opisany powyżej. Spęczniały żel agarozowy 1,2%, o stopniu czystości GTG, wylano na grubość 0,5 cm. Użyto grzebienia z pięcioma wgłębieniami o szerokości 8 mm. Strawiony DNA nałożono do jednego z wgłębień, używając jako wzorca DNA faga Pharmacia Fi X 174. Żel elektroforezowano buforem TBE przy napięciu 8 V na cm żelu. Następnie żel zabarwiono bromkiem etydyny. Do określenia rozmiaru DNA za pomocą elektroforezy kapilarnej użyto wodnego roztworu DNA o stężeniu 10 mikrogramów na mililitr. Użyty bufor składał się z 89 mm kwasu ortoborowego i 89 mm Tris ph 8,5, 2 mm EDTA oraz 5% hydroksypropylometylo-celulozy (Sigma). Zastosowano urządzenie do elektroforezy kapilarnej firmy Beckman, Model Próbkę wprowadzono do powlekanej rurki kapilarnej DB17, o długości 27 cm i wewnętrznej średnicy 100 mikrometrów (J&W Scientific Inc) przy użyciu siły elektrokinetycznej, przy napięciu 7 kv przez 7 sekund, po czym pod ciśnieniem wstrzykiwano do niej czop wodny przez 5 sekund. Elektroforezę prowadzono przy stałym napięciu 6,25 kv przez 12 minut. Absorpcje przy 260 nm zmierzono przy użyciu oprogramowania Beckman System Gold Software. Jako standardu użyto znacznika molekularnego Boehringer Manheim DNA molecular marker VI. Następnie DNA faga poddano namnażaniu PCR. DNA faga wytrącono z 1 ml zawiesiny faga za pomocą etanolu. Białka połączone z fagiem oderwano przy użyciu 4 M nadchloranu sodowego, po czym przeprowadzono dwie ekstrakcje fenol/chloroform, a następnie dwie kolejne ekstrakcje chloroformem. Poprzez dwukrotne strącenie etanolem DNA został odzyskany i przepłukany wodą na sączku Centricon 30 (Amicon). Końcowa objętość roztworu DNA została doprowadzona wodą do 0,5 ml. Proces PCR prowadzono w aparacie z automatycznie regulowanym cyklem temperaturowym (thermocycler, M.J. Research Inc.). Użyty bufor zawierał 50 mm KCl, 10 mm Tris.Cl (ph 8,3), 2,5 mm MgCl2. 0,1% żelatynę, 0,45% Tween 20 oraz 0,45% NP 40. Bufor zawierał 50 pmoli każdego z namnażanych primerów (Clontech cat.#5411), 0,125 mm dntps, 1 mm DTT oraz 2,5 jednostki polimerazy DNA Tag. Objętość 10 mikrolitrów oczyszczonego faga została użyta jako templet. Jeden z primerów, o następującej sekwencji: 5'- AAG CTT CAC ACC ACG AAC CAG - 3' (SEQ ID NO:5), rozpoczyna start syntezy od strony 5' w miejscu cięcia DNA Hind III w górę od miejsca ECoR1. Drugi primer, HL 1-7, o następującej sekwencji: 5' - TTA TGA GTA TTT CTT CAA GGG - 3' (SEQ ID NO:6), rozpoczyna start syntezy w dół od miejsca cięcia ECoR1.

26 Program PCR był następujący: Krok (minuty) Temperatura ( C) Czas Krok (minuty) Temperatura ( C) Czas cykl do kroków 4-6 x 30 cykli stop Produkt jednokrotnie ekstrahowano przy użyciu mieszaniny chloroform/fenol i dwukrotnie przy użyciu chloroformu, a następnie wytrącono etanolem i rozpuszczono w 100 mikrolitrach wody. Wydajność otrzymanego DNA faga wynosiła około mikrogramów na litr kultury. Odzyskany DNA był dostatecznie czysty i wykazywał stosunek absorpcji 260 do 280 równy w przybliżeniu 1,7. Wyniki pomiarów wielkości, zarówno przy użyciu elektroforezy agarozowej, jak i elektroforezy kapilarnej, wskazują, że badany DNA składał się z około 300 par zasad. Wielkość odcinka ustalona za pomocą elektroforezy kapilarnej wynosi około 600 par zasad, lecz odcinek ten zawiera dodatkowych 285 par zasad z wektora 5' ( od miejsca cięcia Hind III do miejsca cięcia ECoR1). Sekwencjonowanie cdna faga hl mikrogramów DNA faga zdenaturowano za pomocą wodorotlenku sodu i strącono octanem sodu (ph 4,5) oraz etanolem, po czym został on dołączony do primerów (Clontech cat.#6184 i 6186). Sekwencjonowanie przeprowadzono metodą Sanger'a z didezoksynukleotydami, przy użyciu zestawu sekwencjonującego zawierającego polimerazę DNA T7 firmy Pharmacia (jako znacznik radiochemiczny został użyty 32P datp z Amersham, aktywność właściwą> 3000Ci/mmol i 10 mikroci/mikrolitr). Sekwencjonowanie prowadzono na żelu Base Runner Unit (IBI) o długości 45 cm. Proces ten przebiegał przy użyciu stałej mocy równej 45 watów. Po jego zakończeniu żel został wysuszony i wyeksponowany na film Amersham Hyperfilm na noc w temp. -85 C, a następnie wywołany. Wyniki sekwencjonowania są przedstawione poniżej. Dojrzały cdna koduje 53 aminokwasy, z których 17 pierwszych może przedstawiać sekwencję sygnalną. 5 - TTT CGC TTT ATT CAT AGC GGT AAT T A A TGA TCA AGA CAG TTG ATT ACT Met Thr Ala G ln Asn Thr Asp Leu CGT AAG CAC TAT TAA AAA TTT GCA A TG ACT GCT CAA AAT ACA GAC CTT Asn G ln Leu Ser Asn Ser Phe Thr L e u Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn AAC CAA CTA TCC AAC AGT TTC ACT T T A GGG ATC GGA AAA CGA ACA AAT Glu His Thr Ala Asp Cys Lys Ile Lys Pro Asn Thr Leu His Lys Lys GAA CAT ACG GCA GAT TGT AAA ATT A A A CCG AAC ACC TTG CAT AAA AAA Ala Ala Glu Thr Leu Met Val Leu Asp G ln Asn G ln Pro TER GCT GCA GAG ACT TTA ATG GTC CTT G A C CAA AAT CAA CCA TAA AGG ATC TGC AGC TTA TGT CTT CTA GTT TAT CTT TTG CAT AAA AAA GCT GCA GAG ACT TTA ATG GTA ATT GCC AAA ATC A A C CAT AAA GGA TCT GC

27 Powyższa sekwencja kwasu nukleinowego została oznaczona jako SEQ ID NO:7, a sekwencja aminokwasów jako SEQ ID NO:8. Wielkość polipeptydu zmniejszonego o lidera wynosiła około Jest ona porównywalna z wielkością pasma TB polipeptydu wyizolowanego z surowicy szczura. Sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca część powyższej sekwencji, oznaczona jako SEQ ID NO:9, została następnie wklonowana do plazmidu w celu jej ekspresji, co jest opisane w następnej części pracy. W tym miejscu warto podkreślić, że osoba o wystarczających umiejętnościach mogłaby uzyskać podobne wyniki używając odpowiednich wektorów i nośników ekspresji innych, niż wybrane w tej pracy. Ekspresja sekwencji dna kodującej część sekwencji cdna otrzymanego z biblioteki cdna wątroby płodu ludzkiego W celu dokonania ekspresji zsyntetyzowano następującą sekwencję, poprzez syntezę oligonukleotydu, aby wklonować ją w plazmid. ECoR 1 START Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr 5 - AATTCTTAGGATCCTAGGATG GGG ATC GGA AAA CGA ACA AAT GAA CAT ACG GAATCCTAGGATCCTAC CCC TAG CCT TTT GCT TGT TTA CTT GTA TGC Ala Asp Cys Lys Ile Lys Pro Asn Thr Leu His Lys Lys Ala Ala Glu GCA GAT TGT AAA ATT AAA CCG AAC ACC TTG CAT AAA AAA GCT GCA GAG CGT CTA ACA TTT TAA TTT GGC TTG TGG AAC GTA ITT TTT CGA CGT CTC Thr Leu Met Val Leu Asp G ln Asn G ln Pro TER ACT TTA ATG GTC CTT GAC CAA AAT GAA CCA TAA AGA TCT TGA TCGA - 5 TGA AAT TAC CAG GAA CTG GTT TTA CTT GGT ATT TCT AGA ACT HIND III Kodująca nić powyżej przedstawionej sekwencji kwasu nukleinowego jest oznaczona jako SEQ ID NO:9, nić niekodująca sekwencji jest oznaczona jako SEQ ID NO: 10, a powyższa sekwencja polipeptydu jest oznaczona jako SEQ ID NO: 11. W tej konstrukcji znajdują się dwa miejsca restrykcyjne umożliwiające dołączenie plazmidu puc 8 rozciętego przez ECoR1 i Hind III. Skonstruowany plazmid został więc wprowadzony do komórek E. coli szczepu JM 103. Transformowane klony były selekcjonowane poprzez wysiewanie bakterii na szalkę LB agarową zawierającą 35 mikrogramów na mililitr ampicyliny. Skonstruowana sekwencja nie zawiera tej, którą uważa się za sekwencję sygnalną zakodowaną w klonie cdna. Sekwencja aminokwasów Gly-Ile-Gly-Lys- niesie pewne podobieństwo do sekwencji pierwszych czterech aminokwasów polipeptydu szczura, dlatego podejrzewa się, że jest to początek dojrzałego peptydu w polipeptydzie ludzkim. Bakterie były hodowane przez osiem godzin w pożywce Terrific, aby uzyskać fazę wolnego wzrostu. Pożywka Terrific składa się z 17 mm buforu fosforanu potasu o ph 7,2, 4% glicerynę oraz 35 mikrogramów na mililitr ampiciliny w tryptonie i ekstrakcie z drożdży znajdujących się w pożywce LB. Po ośmiu godzinach hodowli bakterie odwirowano, aby wymienić pożywkę w celu ekspresji. Pożywka, w której dokonano ekspresji, składała się z: 2% Casamino acid, 17 mm buforu fosforanowego (ph 7,2), 4% gliceryny, 40 mikromoli tiaminy, 2 mm IPTG oraz 35 mikrogramów na mililitr ampicyliny. Granulki bakterii rozproszono w pożywce o objętości równej pierwotnej objętości pożywki Terrific. Hodowlę kontynuowano w inkubatorze ze wstrząsaniem w temp. 37 C przez noc przy 200 rpm. Kultura była odwirowywana dwukrotnie (15 minut za każdym razem przy g) w celu całkowitego zgranulowania bakterii. Wtedy pożywkę zatężono dziesięciokrotnie przy użyciu błony YM3. Objętość 1ml tego materiału poddano HPLC w odwróconej fazie na kolumnie C3, w takich samych warunkach, jak to opisano wcześniej. Przy użyciu 62-63% acetonitrylu wymyto jeden, dobrze rozpuszczalny pik. Czas elucji jest taki sam, jak dla polipeptydu wyizolowanego z ludzkiej surowicy i przedstawiony na figurze 14.

28 Po oczyszczeniu, z 50 ml kultury otrzymano około 1 mg polipeptydu, szacując za pomocą odczynnika Belforda. Biologiczna aktywność produktu ekspresji Do badań użyto nowych samców szczura o masie gramów. Grupa kontrolna otrzymała bufor nośnikowy zawierający 50 mm fosforanu sodu (ph 7,2). Jedna grupa badana otrzymała 0,7 jednostek O.D. polipeptydu otrzymanego w wyniku ekspresji, a druga grupa badana otrzymała 0,3 jednostek O.D. tego polipeptydu. Jak pokazuje figura 15, wydaje się, że produkt otrzymany w wyniku ekspresji wykazuje skutek stymulujący kształtowanie się kości. Eksperymenty obejmujące chemicznie zsyntetyzowany ludzki polipeptyd Według konwencjonalnych chemicznych metod fazy stałej (28) zsyntetyzowano polipeptyd o sekwencji aminokwasów odpowiadającej sekwencji wyselekcjonowanego z biblioteki cdna kwasu nukleinowego (SEQ ID NO:7). Wybrana sekwencja była następująca (SEQ ID NO:11): G ly - Ile-Gly-Lys-Arg-Thi- Asn-Glu-His-Thr-Ala-Asp-Cys-Lys-Ile-Lys- Pro-Asn-Thr-Leu-His-Lys-Lys-Ala-Ala-Glu-Thr-Leu-Met-Val-Leu-Asp- G ln-asn-gln-pro Syntetyczny peptyd był czysty w 99% w oparciu o jego profil HPLC. Został on natychmiast oznaczony metodą spektroskopii masowej i analizy aminokwasów. Oznaczona masa cząsteczkowa wynosiła 4043,36 daltonów. Teoretyczna masa monomeru jest równa 4043,66 daltonów. Wyniki analizy aminokwasów polipeptydu były następujące: Asp (5) 5,23; Thr (4) 3,74; Glu (4) 4,49; Gly (92) 1,72; Ala (3) 3,09; Val (1) 1,09; Met (1) 1,04; Ile (2) 1,54; Leu (3) 3,20; His (2) 2,07; Lys (5) 4,90; Arg (1) 0,99; Pro (2) 2, mg polipeptydu rozpuszczono w 15 ml 0,1 % kwasu octowego, podzielono na piętnaście porcji po 1 ml i zliofilizowano. Peptyd był przechowywany w temp. -20 C. Przed badaniem syntetyczny polipeptyd poddano elektroforezie na żelu trycyna-sds. Większość polipeptydu występuje w postaci dimerycznej, jak wskazuje rysunek nr 16. Do podania szczurom wykonano badany roztwór peptydu poprzez rozpuszczenie jednej porcji peptydu (1 ml) w 1 ml zdejonizowanej wody, otrzymując stężenie 1 mikrograma na 1 mikrolitr. Do 350 mikrolitrów tego roztworu dodano unieczynniony na gorąco 1 % BSA w 0,1 % kwasie octowym (patrz następny paragraf) do końcowej objętości równej 14 mililitrów. Otrzymano w ten sposób ostateczne stężenie peptydu równe 25 mikrogramów na mililitr. Przygotowano surowicę wołu poprzez rozpuszczenie 0,5 g BSA (Sigma) w 40 ml zdejonizowanej wody. Po dodaniu 50 mikrolitrów kwasu octowego objętość uzupełniono zdejonizowaną wodą do 50 ml. Końcowa mieszanina miała więc stężenie 1% BSA w 0,1% kwasie octowym. Ten nośnik do iniekcji był inkubowany w łaźni wodnej o temperaturze 56 C przez 90 minut, w celu unieczynnienia BSA. Roztwór był przechowywany w temp. 4 C. Przygotowano unieczynniony na gorąco peptyd dla grupy kontrolnej B (patrz następna część) poprzez rozpuszczenie 350 mikrolitrów peptydu (przygotowanego), jak wcześniej opisano w tej części) w zdejonizowanej wodzie. Roztwór ten gotowano następnie w zamkniętej polipropylenowej probówce (Sarsted) przez 10 minut w kuchence mikrofalowej. Następnie go ochłodzono i dodano do niego nośnik, przygotowany dla aktywnego polipeptydu, do końcowej objętości równej 14 ml. Tak więc stężenie unieczynnionego peptydu wyniosło również 25 mikrogramy na mililitr. Roztwór do znakowania tetracykliną przygotowano poprzez rozpuszczenie 360 mg zasady tetracykliny (Sigma) w 50 ml zdejonizowanej wody uzyskując stężenie 7,2 mg na ml. Każdy szczur ważył około 300 g, tak więc ilość podanej tetracykliny (1 ml roztworu znakującego) wyniosła około 24 mg na kg wagi ciała.

29 Biologiczna aktywność chemicznie zsyntetyzowanego peptydu Użyto samców szczura Sprague-Dawley z laboratorium Charles River Laboratory ważących około 250 g. Zwierzęta były pojedynczo przechowywane w klatkach i utrzymywane na nieograniczonej diecie składającej się z wody wodociągowej oraz pokarmu Purina Rat Chow. Jeden ml każdego roztworu podano szczurom domięśniowo do uda. W każdej grupie eksperymentalnej było po 12 szczurów: Grupa kontrolna A - Każde zwierzę otrzymało 1 ml 0,1% BSA w 0,1% kwasie octowym poprzez domięśniowy zastrzyk w prawy największy mięsień pośladkowy. Po tym nastąpiło wewnątrzotrzewne wstrzyknięcie 1 ml roztworu znakującego tetracykliną. Grupa kontrolna B - Każde zwierzę otrzymało 1 ml 0,1% BSA w 0,1 % kwasie octowym zawierającym peptyd, który był gotowany przez 10 minut (patrz powyżej) poprzez domięśniowy zastrzyk w prawy największy mięsień pośladkowy. Po tym nastąpiło wewnątrzotrzewne wstrzyknięcie 1 ml roztworu znakującego tetracykliną. Grupa badana - Każde zwierzę otrzymało 1 ml badanego roztworu (25 mikrogramów peptydu w 1 ml nośnika, patrz powyżej) poprzez domięśniowy zastrzyk w prawy największy mięsień pośladkowy. Po tym nastąpiło wewnątrzotrzewne wstrzyknięcie 1 ml roztworu znakującego tetracykliną. 48 godzin później każdemu szczurowi ponownie podano roztwór znakujący tetracykliną. Po 24 godzinach od podania drugiej dawki tetracykliny zwierzęta zostały uśmiercone poprzez uśpienie dwutlenkiem węgla. Próbki krwi pobrano poprzez nakłucie serca natychmiast po zatrzymaniu oddechu zwierzęcia. Do pomiaru alkalicznej fosfatazy kości pobrano około 3 ml heparynizowanej krwi. Jest to wskaźnik tworzenia się kości. Pomiary wykonywano według rutynowej, konwencjonalnej techniki pomiaru ludzkiej alkalicznej fosfatazy kości. Wyniki nie były rozstrzygające. Próbki kości do badań histologicznych i do oznaczenia szybkości wzrostu kości wybrano z: prawej kości udowej, prawej kości piszczelowej, prawej kości ramieniowej, prawej kości biodrowej oraz trzonu piątego kręgu. Przed spreparowaniem próbki przechowywano w temp. 4 C. Preparowanie prawej kości udowej do badań histologicznych i określenia szybkości przyłożenia kostnych substancji mineralnych pod wpływem chemicznie zsyntetyzowanego ludzkiego polipeptydu Odcięto mięśnie, ścięgna oraz okostną z prawej kości udowej zwierząt z trzech grup. Przekroje niższej przynasady kości udowej i środka trzonka tej kości pobrano w sposób opisany poniżej i zilustrowany na figurze 17. Przekroje kości przeniesiono do 80% etanolu i łagodnie wytrząsano przez noc. Przekrój kości udowej poddano następującym etapom obróbki: 1. Odwodnienie dwiema zmianami 100% etanolu - przez 2 godziny na każdą zmianę. 2. Odtłuszczenie przy użyciu 100% acetonu przez 2 godziny. 3. Poddanie działaniu mieszaniny aceton/ośrodek Spurr'a 1:1 przez noc. Skład ośrodka Spurr'a jest następujący: NSA (bezwodnik nonylobursztynowy) 130 g ERL (dwutlenek winylocykloheksenowy) 50 g DER (eter diglicydylowy) glikolu propylenowego 30 g DMAE (dimetylaminoetanol) 2 g Przekroje kostne przeniesiono do 100% ośrodka Spurr'a i pozostawiono na 6 godzin w celu infiltracji ośrodka do tkanki kostnej. Następnie ośrodek ten został zastąpiony nową jego porcją i zastosowano podciśnienie 25 psi przez 15 minut. Przekroje z niższej przynasady kości udowej zostały ustawione niższą powierzchnią przekroju na pokrywającej dno formy warstwie, po czym układ ten pozostawiono na noc w 55 C, tak aby zaszła polimeryzacja żywicy, tj. ośrodka Spurr'a. Częściowo spolimeryzowane bloki tkanki z niższej przynasady kości udowej były następnie przechowywane w 80 C przez

30 kolejnych dwanaście godzin. Jednocześnie, śródtrzonki były pozostawione w ciekłej żywicy na drugą noc, a następnie przechowywane przez dwanaście godzin w 80 C. Następnego dnia został wycięty jeden odcinek o grubości 400 mikrometrów w płaszczyźnie w połowie odległości pomiędzy dwiema powierzchniami przekroju bloków tkankowych z niższej przy nasady kości udowej. Te grube odcinki zostały ręcznie oszlifowane w celu zmniejszenia ich grubości pomiędzy dwiema płytkami zszorstkowanymi przy użyciu proszku karborundowego (gruby z piaskiem nr 100) do końcowej grubości około 8 mikrometrów. Jako smaru przy szlifowaniu użyto wody. Oszlifowane, cienkie odcinki zostały następnie osadzone bez barwienia do badania. Odcinki każdego śródtrzonka kości udowej zostały spreparowane w podobny sposób z płaszczyzn w połowie odległości pomiędzy dwiema powierzchniami przekroju kości udowej. Odcinki tkanek z niższej przynasady kości udowej zostały przypadkowo wybrane do ślepej próby pomiaru przyłożenia kości. Bezbarwne, plastyczne, osadzone próbki były systematycznie przeglądane pod fluorescencyjnym mikroskopem z obiektywem x 16 i okularami x 10, aby pokryć kość beleczkowatą w przestrzeni zamkniętej przez powierzchnię śródkostną. Do badań wybrano przypadkowo miejsca formacji kości z dwoma pasmami tetracykliny ostro określonymi w celu zminimalizowania błędu skutkiem ukośnych cięć poprzez tworzące się powierzchnie. Rejestrowana w mikrometrach odległość pomiędzy dwoma pasmami tetracykliny była dzielona przez 2 (odstęp pomiędzy znakowaniem wynosił 2 dni), aby otrzymać szybkość mierzoną w mikrometrach na dzień. Zmierzono trzydzieści przypadkowo wybranych miejsc dla każdego zwierzęcia a średnia arytmetyczna wzięta do analizy straty stycznej. Wyniki są umieszczone w tabeli 2 i przedstawione na figurze 18. TABELA 2 Porównanie grupowych średnich arytmetycznych pomiędzy grupami Grupa badana Grupa kontrolna A Grupa kontrolna B średnia 1,35 mikrom/d 1,03 mikrom/d 0,99 mikrom/d S.D mikrom/d 0,04 mikrom/d 0,07 mikrom/d N t. d.f. P Grupa badana a grupa kontrolna A 11,18 16 <0,001 Grupa badana a grupa kontrolna B 3,96 14 < 0,005 Grupa kontrolna A a grupa kontrolna B 0,62 14 >0,5 Zależny od dawki efekt wywołany przez chemicznie zsyntetyzowane białko na wzrost kości Czterdzieści samców szczura Sprague-Dawley podzielono na cztery grupy, każda po dziesięć szczurów. Średnia waga grup od 1 do 4 wynosiła odpowiednio 294 g, 297 g, 296 g i 279 g. Tak jak w poprzednich doświadczeniach, przygotowano wyjściowy roztwór peptydu o stężeniu 1 mg na ml w 1% kwasie octowym. Pominięto BSA. W następujący sposób przygotowano trzy roztwory, z których każdy zawierał inne stężenie chemicznie zsyntetyzowanego polipeptydu: Roztwór peptydu 1: 1,1 ml wyjściowego roztworu rozcieńczono do 5,5 ml przy użyciu 0,1% kwasu octowego, aby uzyskać stężenie peptydu równe 100 mikrogramów na 0,5 ml roztworu. Roztwór peptydu 2: 0,55 ml wyjściowego roztworu rozcieńczono do 5,5 ml przy użyciu 0,1% kwasu octowego, aby uzyskać stężenie peptydu równe 50 mikrogramów na 0,5 ml roztworu. Roztwór peptydu 3: 0,3 ml wyjściowego roztworu rozcieńczono do 6 ml przy użyciu 0,1% kwasu octowego, aby uzyskać stężenie peptydu równe 25 mikrogramów na 0,5 ml roztworu.

31 Grupa kontrolna D- Znakujący roztwór tetracykliny przygotowano poprzez rozpuszczenie 288 mg zasady tetracykliny w 40 ml zdejonizowanej wody do granicznego stężenia 7,2 mg na ml. Każdemu szczurowi podano (patrz poniżej) 1 ml roztworu, to jest około 24 g na kg wagi ciała. Cztery grupy szczurów potraktowano w następujący sposób: Grupa badana A - Każde zwierzę otrzymało domięśniowy zastrzyk 0,5 ml roztworu peptydu 1 (100 mikrogramów peptydu), a następnie 1 ml roztworu tetracykliny wewnątrzotrzewnie. Grupa badana B - Każde zwierzę otrzymało domięśniowy zastrzyk 0,5 ml roztworu peptydu 2 (50 mikrogramów peptydu), a następnie wewnątrzotrzewnie 1 ml roztworu tetracykliny. Grupa badana C - Każde zwierzę otrzymało domięśniowy zastrzyk 0,5 ml roztworu peptydu 3 (25 mikrogramów peptydu), a następnie wewnątrzotrzewnie 1ml roztworu tetracykliny. Każde zwierzę otrzymało domięśniowy zastrzyk 0,5 ml 0,1 % roztworu kwasu octowego, a następnie wewnątrzotrzewnie 1 ml roztworu tetracykliny. Żaden ze szczurów nie otrzymał peptydu. Drugi znakujący roztwór tetracykliny przygotowano przez rozpuszczenie 288 mg zasady tetracykliny (Sigma) w 40 ml zdejonizowanej wody do granicznego stężenia 7,2 mg tetracykliny na ml. Każdy szczur otrzymał wewnątrzotrzewnie 1 ml znakującego roztworu tetracykliny (około 24 mg na kg wagi ciała) w około 48 godzin po początkowej dawce, a następnie został uśmiercony poprzez uśpienie dwutlenkiem węgla około 24 godziny później. Od każdego szczura pobrano w przybliżeniu 3 ml pośmiertnej krwi poprzez nakłucie serca, którą przełożono do probówek zawierających heparynę. Plazmę przechowywano w temperaturze -20 C. Z każdego zwierzęcia wycięto następujące próbki kości: obie kości udowe, obie kości piszczelowe, obie kości biodrowe oraz dwa pierwsze kręgi ogonowe. Te kostne próbki zakonserwowano w 10% formaldehydzie buforowanym do ph 7,4 za pomocą 20 mm buforu fosforanowego. Przygotowanie prawej kości udowej do określenia zależności szybkości przyłożenia kości od dawki Badano niższą nasadę kości długiej prawej kości udowej zamiast niższej przynasady kości udowej. Niższa nasada długiej kości udowej została wycięta w sposób przedstawiony na figurze 19. Tkanka kostna była łagodnie wytrząsana przez 6 godzin w 80%) etanolu, a następnie przeniesiona do 95% etanolu. Następnie tkanka kostna została przeniesiona do 100% etanolu, który został wymieniony po ośmiu godzinach. Następnego dnia tkankę kostną przeniesiono do acetonu. Po około dwudziestu siedmiu godzinach została ona przeniesiona do mieszaniny acetonu i ośrodka Spurr a w stosunku 1:1. Po około osiemnastu godzinach tkankę przeniesiono do 100% ośrodka Spurr'a i łagodnie wytrząsano przez dwadzieścia cztery godziny. Ośrodek Spurr'a został wymieniony, a tkankę przechowywano w nim w tem. 37 C przez następne dwadzieścia cztery godziny. Od tego momentu fragmenty niższej nasady kości długiej zaczęły wyglądać jak częściowo spolimeryzowane, to znaczy masa plastyczna przekształciła się w mętną galaretę. Fragmenty te przeniesiono do inkubatora i przechowywano w temp. 45 C przez około 4 i pół godziny w celu utwardzenia osadzającego się ośrodka. Końcowy etap przechowywania był prowadzony w temp. 80 C przez cztery godziny. Odcinek 400 mikrometrów został wycięty z fragmentu kości na poziomie 1 mm poniżej wyższej powierzchni cięcia. Gruby odcinek oszlifowano ręcznie do końcowej grubości około 8 mikrometrów pomiędzy dwiema szklanymi płytkami zszorstkowanymi przy użyciu proszku karborundowego. Jako smaru przy szlifowaniu użyto wody. Te cienkie odcinki osadzono bezbarwne w urządzeniu Permount (Fischer). Użyto metody pomiaru opisanej w związku z poprzednim etapem doświadczeń. Szybkość była mierzona w 30 miejscach formacji kości w kości beleczkowatej zamkniętej przez powierzchnie śródkostne niższej nasady długiej kości udowej. Całe pole odcinka było systematycznie pokry-

32 wane w sposób przedstawiony na figurze 20. Przed pomiarem próbki zostały odpowiednio oznaczone. Wyniki są zestawione w tabeli 3. TABELA 3 Porównanie średnich arytmetycznych pomiędzy grupami Grupa A (100 μg) Grupa B (50 μg) Grupa C (25 μg) Grupa D (0 μg) Średnia (μm/dzień) 1,32 1,15 1,05 0,85 S.D. 0,07 0,05 0,03 0,04 GRUPA t d.f. P A vs B 6,64 8 <0,01 B vs C 5,46 8 <0,01 C vs D 13,80 8 <0,01 Wyniki zawarte w tabeli trzeciej są zilustrowane na figurach 21 i 22. Wyniki te wskazują, że efekt stymulujący chemicznie zsyntetyzowanego polipeptydu u szczurów wzrasta z ilością podanego peptydu w obrębie zastosowanego zakresu dawek i odstępów czasu. Jest oczywiście zrozumiałe, bez intencji ograniczania się w ten sposób, że istnieje wiele możliwych podstawień aminokwasów podczas zabezpieczania trójwymiarowej struktury odpowiedzialnego za efekt stymulujący kości polipeptydu przedstawionego w tej pracy. Tak więc, można oczekiwać, że byłaby możliwa wzajemna wymiana na przykład pomiędzy niepolamymi alifatycznymi obojętnymi aminokwasami: glicyną, alaniną, proliną, waliną oraz izoleucyną. Mogłoby również zajść podstawienie polarnych alifatycznych obojętnych aminokwasów, takich jak seryna, treonina, mationina, cysteina, asparagina i glutamina. Jak to było powiedziane, znaczenie może mieć łączenie się peptydów poprzez mostki dwusiarczkowe, a jeśli tak, to reszta pojedynczej cysteiny powinna utrzymać się nienaruszona. Także inne aminokwasy, zdolne do tworzenia wiązań dwusiarczkowych, nie powinny podlegać substytucji w innych miejscach sekwencji. Prawdopodobne byłyby także podstawienia pomiędzy naładowanymi kwasowymi aminokwasami, jak kwas asparaginowy i glutaminowy, tak jak możliwe byłyby podstawienia pomiędzy naładowanymi zasadowymi aminokwasami, do których należy lizyna i arginina. Podstawienia pomiędzy aminokwasami aromatycznymi, obejmującymi fenyloalaninę, histydynę, tryptofan i tyrozynę, byłyby także możliwe. Te rodzaje podstawień i wzajemnych wymian są dobrze znane osobom znającym zagadnienie. Również inne substytucje mogły mieć miejsce. Co do delecji jednego lub więcej aminokwasów, możliwa byłaby delecja niewielkiej liczby aminokwasów z każdego końca sekwencji. Dalej, symetryczne lub prawie symetryczne delecje najprawdopodobnej mogłyby zajść w czasie podtrzymywania trójwymiarowej konfiguracji. Delecje wewnętrzne, choć prawdopodobne w ograniczonym zakresie, powinny być nieliczne i prawdopodobnie nie powinny dotyczyć liczby aminokwasów większej niż pięć. Addycja aminokwasów byłaby bardzo prawdopodobna na końcach sekwencji i, tak jak delecja, symetryczna lub prawie symetryczna na końcówce tak karboksylowej, jak i aminowej. Wewnętrzna addycja, choć prawdopodobna w ograniczonym zakresie, mogła być niewielka i nie powinna dotyczyć większej liczby aminokwasów niż pięć, z preferencją ich mniejszej liczby. Spośród powyżej wymienionych modyfikacji sekwencji najbardziej prawdopodobne są addycje, delecje lub substytucje na końcówkach, jako że takie modyfikacje mogą służyć wielu funkcjom, na przykład identyfikacji grup na użytek badań radioimmunologicznych czy łączeniu się grup.

33 Synteza przeciw ciał chemicznie zsyntetyzowanego białka (seq id no 11) Chemicznie otrzymane białko (SEQ ID NO 11) było sprzężone z KLH (hemocyjanina) za pomocą trzech różnych poprzecznych wiązań w sposób opisany poniżej. Sprzęganie aldehydem glutarowym W 2,5 ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) wykonanej z 2,7 mm KCl, 1,2 mm KH2PO4, 139 mm NaCl, 8,1 mm Na2HPO4 rozpuszczono 5 mg peptydu (SEQ ID Nr 11) uzyskując końcowe stężenie białka równe 2 mg/ml. 10 mg KLH rozpuszczono w 5,0 ml PBS uzyskując końcowe stężenie 2 mg/ml. Do 1,25 ml roztworu KLH dodano 1,25 ml roztworu peptydu. Aldehyd glutarowy dodano do końcowej wartości stężenia 0,25%. Ostateczny roztwór mieszano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po zmieszaniu roztwór był dializowany wobec 1 litra PBS. PBS był wymieniany trzykrotnie. Sprzęganie karbodiimidem (edc) Roztwory peptydu i KHL przygotowano w sposób opisany w poprzedniej części. Do 1,25 ml roztworu KHL dodano 1,25 ml roztworu peptydu. Do w ten sposób otrzymanego roztworu dodano 2,5 mg EDC. Roztwór ten był stale mieszany w temperaturze pokojowej przez 4 godziny, po czym dializowany wobec 1 litra PBS. PBS był wymieniany trzykrotnie. Sprzęganie estrem m-maleimidobenzoilo-n-hydroksy bursztynowym (mbs) Do 500 mikrolitrów H2O dodano 5 mg peptydu a ph ustawiono na 8,5 za pomocą NaOH, tak aby otrzymać końcowe stężenie 10 mg/ml. Bezwodnik kwasu metylomaleinowego (cytrakonowego) rozcieńczono wodą do stężenia 10 mg/ml. 500 mikrolitrów roztworu bezwodnika dodano do 100 mikrolitrów roztworu peptydu z jednoczesnym ustawieniem ph na 8,5 pomiędzy każdym dodaniem. Roztwór był następnie nieprzerwanie mieszany w temperaturze pokojowej przez 1godzinę. Następnie dodano 100 mikrolitrów 1M buforu fosforanu sodu (ph 7,2), a potem 900 mikrolitrów 100 mm buforu fosforanu sodu (ph 7,2). Sulfo-MBS rozcieńczono wodą do stężenia 25 mg/ml i 400 mikrolitrów tego roztworu dodano do roztworu peptydu, aby otrzymać stężenie MBS około 5 mg/ml. Roztwór ten stale mieszano w temperaturze pokojowej przez 30 minut. 6 mikrolitrów beta-merkaptoetanolu dodano, uzyskując końcowe stężenie betamerkaptoetanolu równe 35 mm. Roztwór ten mieszano nieprzerwanie w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. KHL rozpuszczono w PBS do stężenia 3 mg/ml i do tego roztworu dodano roztwór peptydu. Otrzymany roztwór stale mieszano w temperaturze pokojowej przez 3 godziny, po czym dializowano wobec 1 litra PBS, używając trzech zmian PBS. Ostateczne stężenie peptydu wynosiło około 1 mg/ml, a ostateczne stężenie KHL było równe około 1,5 mg/ml. Generacja przeciwciała Roztwory syntetycznego peptydu zostały wstrzyknięte królikom w następujący sposób. Po 250 mikrolitrów roztworu peptydu sprzęgniętego aldehydem glutarowym i EDC zmieszano razem z 500 mikrolitrami adiuwantu Freud'a. Roztwór ten został wstrzyknięty domięśniowo w tylne nogi królika, po 500 mikrolitrów na nogę. Całkowita ilość wstrzyknięto peptydu wynosiła 0,5 mg. 500 mikrolitrów syntetycznego peptydu sprzężonego z KLH za pomocą MBS zmieszano z 500 mikrolitrami adiuwantu Freud'a. Roztwór ten wstrzyknięto do tylnych nóg drugiego królika, po 500 mikrolitrów na nogę. Całkowita ilość wstrzykniętego peptydu wynosiła 0,5 mg. Syntetyczny peptyd załadowano na dwie linie, po 1,5 mikrograma i 4 mikrogramy, żelu (18% rozdzielającego, 5% wypełniającego). Żel był suszony bibułą przez noc przy 30V i zablokowany 3% mlekiem w PBS. Następnie był inkubowany przez noc z surowica królika rozcieńczoną w stosunku 1:250 w 1% mieszaninie mleko/pbs, po czym przez 1 godzinę nastąpiła inkubacja z kozią przeciwkróliczą fosfatazą alkaliczną rozcieńczoną w stosunku 1:1000. Następnie żel był rozwijany z substratem. Syntetyczny peptyd był widzialny dzięki zabarwieniu błękitem komazynowym. Peptyd był wykrywany u każdego królika po drugim pobraniu krwi, a nie był wykrywany w surowicy żadnego z królików przed immunizacją. Oddziaływanie pomiędzy unieruchomionym peptydem i przeciwciałami surowicy były badane dalej poprzez powierzchniowy rezonans plazmonowy, przy użyciu BIAcore18. Syntetyczny peptyd został kowalencyjnie unieruchomiony na matrycy dekstranowej poprzez połączenie aminowe. Surowicę królika o różnych rozcieńczeniach wstrzykiwano przez powierzchnię przez 5 mi-

34 nut a przeciwciała graniczyły z unieruchomionym oznaczanym peptydem. Miano zdefiniowano jako ostatnie rozcieńczenie surowicy dające pozytywną odpowiedź, to jest większą niż 50 jednostek rezonansu. Stosując to podejście wykryto przeciwciała obecne w surowicy obu królików oraz to, że wzajemne oddziaływanie może być zablokowane poprzez preinkubację surowicy z peptydem. Odkryto także, że przeciwciała surowicy królików nie oddziaływują z unieruchomionym, niezwiązanym peptydem. Metodologia i produkty mogą być więc rozwijane poprzez zastosowanie przeciwciał polipeptydu w celu wykrycia polipeptydu, z którym wiąże się przeciwciało. Na przykład, przeciwciało może być powiązane lub sprzężone z którymś z dobrze znanych systemów sprawozdawczych w celu pozytywnego wskazania powiązań polipeptydu z przeciwciałem. Dobrze znany system sprawozdawczy obejmuje testy radioimmunologiczne (RIAs), czy też testy immunoradiometryczne (IRMAs). Alternatywnie, testy z zastosowaniem immunosorbentu połączonego z enzymem (ELISA) mogłyby mieć razem z RIAs i IRMAs względnie wysoki stopień czułości, lecz generalnie nie polegałyby na użyciu izotopów promieniotwórczych. M ogą być wytworzone substancje wykrywalne wizualnie, a przynajmniej wykrywalne spektrofotometrycznie. Zastosowanymi badaniami mogłyby być testy fluorescencji substancji wiązanej przez enzym. Warto zaznaczyć fakt, iż tak jak w niniejszym wynalazku, jest wiele systemów sprawozdawczych, które mogą być użyte do wykrycia obecności danego polipeptydu. Dzięki standaryzowanemu zbiorowi próbek i badań mogłaby być właściwie określona ponadprogowa obecność polipeptydu w surowicy krwi. Mogłyby być rozwijane metody bazujące na antygenowej odpowiedzi na chemicznie zsyntetyzowany ludzki polipeptyd (SEQ ID NO: 11) a warianty otrzymanego polipeptydu, opisane powyżej, takie jak substytucja, delecja, addycja aminokwasów (i koniugacja) wytwarzane i wstępnie przeszukiwane, jako potencjalne czynniki stymulujące wzrost kości. Te spośród nich, które reagowałyby pozytywnie z przeciwciałem już poznanego peptydu, mogłyby być badane in vivo pod względem efektu stymulującego wzrost kości, na przykład przy użyciu, systemu dla szczurów opisanego w niniejszej pracy. System sprawozdawczy polegający na połączeniu z przeciwciałem mógłby być użyty w metodzie określania, czy surowica krwi badanego obiektu zawiera niedobór polipeptydu. Poprzez podanie normalnego progu stężenia takiego polipeptydu w surowicy krwi dla danego typu obiektu badanego, mogłyby być dalej rozwijane zestawy badawcze. Jak wiadomo, dalsza korzyść może wynikać z chimerycznej formy białka. Na przykład, sekwencja DNA kodująca całe białko lub jego część może w ten sposób być powiązana z sekwencją kodującą część od strony końca-c beta-galaktozydazy E. coli, w celu wytworzenia białka połączonego (fusion protein). Na przykład system ekspresji dla glikoprotein F i G ludzkiego oddechowego syncycjalnego wirusa jest ujawniony w opisie patentowym USA nr , wydanym w 22 lutego 1994 i przytoczony w wykazie bibliografii.

35 BIBLIOGRAFIA 1. Tam, C.S Patogeneza metabolicznych chorób kości: Przegląd. W: Choroby metaboliczne kości: Mechanizmy komórkowe i tkankowe, wyd. Tam, C.S., Heersche, J.N.M. i Murray, T.M. CRC Press, Boca Raton. 2. Parfitt, A.M., Villanueva, A.R., Mathews, C.H.E., Aswani, S.A Kinetyka substancji podstawowej a mineralne przyłożenie w osteoporozie i osteodystrofii nerkowej : związek szybkości odnowy z morfologią komórki, Metab Bone Dis Rei Res, 2(S), Parfitt, A.M., Sprzężenie pomiędzy formacją i resorpcją kości: Krytyczna analiza koncepcji i jej związku z patogenezą osteoporozy. Metab Bone Dis Rei Res 4,1. 4. Coccia, PF., Krivit, W., Cerveuka, J., Clawson, C., Kersey, J., Kim, T.H., Nesbit, M.E., Ramsey, N.K.C., Warkeutin, P.I., Teitelbaum, S.L., Kahn, A.J., Brown, D.M Skuteczna transplantacja szpiku kości w dziecięcej osteoporozie złośliwej. New Eng J. Med, Marks, S.C. Jr., Walker, D.G Hematogeniczne pochodzenie osteoklastów: dowód pochodzący od myszy z marmurkowatością kości (mikroftalamicznych) leczonych komórkami śledziony od dawców, mysz Geige'go. Am J Anat 161,1. 6. Owen, M Rodowód komórek osteogenicznych i ich relacja do systemu zrębowego. W; Bone and Mineral research, Vol 3, wyd. Peck W.A. Amsterdam, Yamamoto, I Regulacja receptorów parathormonu w komórkach kostniakomięsaka szczura. J.J.B.M. 3, Canalis, E Interleukina-1 wywiera niezależne efekty na syntezę kwasu dezoksyrybonukleinowego i kolagenu w kulturach tkanki kostnej sklepienia czaszki szczura, Endocrinol 118, Centrella, M., Canalis, E Przenoszący i nieprzenoszący czynnik wzrostu jest obecny w ośrodku kondycjonowanym przez tkankę kostną sklepienia czaszki płodu szczura. Proc Natl Acad Sci, U.S.A. 82, Canalis, E Efekt czynników wzrostu w replikacji i różnicowaniu komórek kostnych. Clin Orthop 183, Chyun, Y.S., L.G Stymulacja tworzenia kości prostaglandyną E 2. Prostaglandyny, 27, Canalis, E Efekty czynnika wzrostu 1 z linii insuliny na DNA i syntezę białek w hodowanych tlankach sklepienia czaszki szczura. J Clin Invest, 66, Klein, D.C., Raisz, L.G Prostaglandyny: stymulacja resorpcji kości w hodowli tkankowej. Endocrinol Tashijan, A.H., Jr., Voekel, E.F., Lazarro, M., Singer, F.R., Roberts, A., Derynck, R., Winkler, M.E., Levine, L Ludzkie przenoszące czynniki wzrostu a i b stymulują wytwarzanie prostaglandyny i resorpcję kości w hodowanej tkance sklepienia czaszki myszy. Proc N atl Acad Sei, U.S.A. 82, Chen, T.L., Cone, C.M., Morey-Holton, E., Feldman, D. 1982, Regulacja glukokortykoidowa receptorów 1,25(OH)2D3 w kulturze komórek kostnych myszy. J. Biol Chem 257, Roodman, G.D Perspektywy: Interleukina-6: czynnik osteotropiczny. J. Bone Miner Res, 7, Serge, G.V Wydzielanie, metabolizm i heterogeniczne wydzielanie parathormonu. W: Primer w metabolizmie chorób kostnych i zaburzeń metabolizmu substancji mineralnych. Wydanie pierwsze, wyd. Favus, M.J., Kelseyville, California. 18. Selye, H O stymulacji tworzenia nowej tkanki kostnej za pomocą ekstraktu parathormonu i napromieniowanego ergosterolu. Endocrinol 16, Aitken, R.E., Kerr, J.L., Loyd, H.M., Pierwotna nadczynność przytarczyc z osteosklerozą i zwapnieniem w chrząstce stawowej. Am J Med 37, Connor, T.B., Freijances, J., Stoner, R.E., Martin, L.G., Jowsey, J Osteoskleroza uogólniona w pierwotnej nadczynności przytarczyc. Trans Am Clin Climatol Assoc 85, 185.

36 Gennant, H.K., Baron, J.M., Paloyan, E., Jowsey, J Osteoskleroza w pierwotnej nadczynności przytarczyc. Am J Med 59, Kalu, D.N., Pennock, J., Doyle, F.H., Foster, G.V Parathormon a eksperymentalna osteoskleroza. Lancet 1, Tam, C.S., Harrison, J.E., Reed, R., Criuckshank, B Szybkość przyłożenia kości jako wskaźnik metabolizmu kości. Metabolizm 27, Tam, C.S., Bayley, T.A., Harrison, J.E., Murray, T.M., Birkin, B.L, Thompson, D Biopsja kości w diagnozie pierwotnej nadczynności przytarczyc.w: Copp, D.H., Talmage, R.V. (wyd.) Endokrynologia metabolizmu wapnia. Experta Medica, Amsterdam, str. 427 (streszczenie). 25. Tam, C.S., Heersche, J.N.M., Murray, T.M., Parsons, J.A Parathormon stymuluje szybkość przyłożenia niezależnie od jego działania resorpcyjnego: Różnicujące efekty podawania przerywanego i ciągłego. Endocrinol 110, Tam, C.S., Anderson, W Znakowanie kości tetracykliną in vivo. Calcif Tiss res 30, Klonowanie molekularne, podręcznik laboratoryjny (Wydanie drugie), Sambroot, J., Fritsch. E.F., Maniatis, T., Cold Spring Harbor Press, Chemia organiczna, wyd. Loudon, G., Marc (Wyd.), Addison-Wesley Publishing Company, Massachusetts, 1984.

37 WYSZCZEGÓLNIENIE SEKWENCJI (1) OGÓLNE INFORMACJE: (i) (ii) ZGŁASZAJĄCY: Cherk Shing Tam TYTUŁ WYNALAZKU: CZYNNIK STYMULUJĄCY KOŚCI (iii) NUMER SEKWENCJI: 11 (iv) ADRES KORESPONDENCYJNY: (A) ADRESAT: Blake, Cassels & Graydon (B) ULICA: Box 25, Commerce Court West (C) MIASTO: Toronto (D) STAN: Ontario (E) PAŃSTWO: Kanada (F) KOD POCZTOWY (ZIP): M5L 1A9 (v) (vi) (vii) (viii) (ix) POSTAĆ CZYTELNA DLA KOMPUTERA: (A) TYP NOŚNIKA: Dyskietka, 3,5 cala, 1,4 Mb poj. (B) KOMPUTER: COMPAQ, zgodny z IBM AT (C) SYSTEM OPERACYJNY: MS-DOS 5.1 (D) OPROGRAMOWANIE: Word Perfect DANE DOT. ZGŁOSZENIA: (A) NUMER ZGŁOSZENIA: (B) DATA ZGŁOSZENIA: (C) KLASYFIKACJA DANE DOT. PIERWSZEŃSTWA: (A) NUMER ZGŁOSZENIA: US 08/031,036; US 08/120,127 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 12 MARCA 1993; 13 WRZEŚNIA 1993 DANE DOT. RZECZNIKA/AGENTA: (A) NAZWISKO: Gray, Brian W. (B) NUMER REJESTRU: (C) ZNAKI/NUMER SPRAWY: 46913/00008 TELEKOMUNIKACYJNE DANE: (A) TELEFON: C416) (B) TELEFAX: (416) lub (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID: 1: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 11 kwasów aminowych (B) TYP: kwas aminowy CD) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID: 1: Gly Pro Gly Gly Ala Gly Glu Thr Lys Pro Ile

38 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID: 2: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 7 kwasów aminowych (B) TYP: kwas aminowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID: 2: Gly Pro Gly Gly Ala Gly Glu 1 5 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID: 3: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 32 zasadowych par (B) TYP: kwas nukleinowy (C) KONFORMACJA ŁAŃCUCHA: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID: 3 GGY CCY GGY GGY GCY GGY GAR ACY AAR CCY AT 32 Gly Pro Gly Gly Ala Gly Glu Thr Lys Pro Ile (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID: 4: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 10 kwasów aminowych (B) TYP: kwas aminowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID: 4: Gly Pro Gly Gly Ala Gly Glu Thr Lys Pro (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID: 5: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 21 zasadowych par (B) TYP: kwas nukleinowy (C) KONFORMACJA ŁAŃCUCHA: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID: 5 AAG CTT CAC ACC ACG AAC CAG 21 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID: 6: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 21 zasadowych par (B) TYP: kwas nukleinowy (C) KONFORMACJA ŁAŃCUCHA: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa

39 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID: 6 TTA TGA GTA TTT CTT CAA GGG 21 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID: 7: Ci) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 329 zasadowych par (B) TYP: kwas nukleinowy (C) KONFORMACJA ŁAŃCUCHA: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cdna do mrna (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID: 7 TTTGGCTTTA TTCATAGCGG TAATTAATGA TCAAGACAGT TGATTACTCG TAAGCACTAT 60 TAAAAATTTG CA ATG ACT GCT CAA AAT ACA GAC CTT AAC CAA CTA TCC 108 Met Thr Ala Gln Asn Thr Asp Leu Asn Gln Leu Ser AAC AGT TTC ACT TTA GGG ATC GGA AAA CGA ACA AAT GAA CAT ACG GCA 156 Asn Ser Phe Thr Leu Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala GAT TGT AAA ATT AAA CCG AAC ACC TTG CAT AAA AAA GCT GCA GAG ACT 204 Asp Cys Lys Ile Lys Pro Asn Thr Leu His Lys Lys Ala Ala Glu Thr TTA ATG GTC CTT GAC CAA AAT CAA CCA TAAAGGATCT GCAGCTTATG 251 Leu Met Val Leu Asp Gln Asn Gln Pro TCTTCTAGTT TATCTTTTGC ATAAAAAAGC TGCAGAGACT TTAATGGTAA TTGCCAAAAT 311 CAACCATAAA GGATCTGC 329 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID: 8: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 53 kwasów aminowych (B) TYP: kwas aminowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID: 8: Met Thr Ala Gln Asn Thr Asp Leu Asn Gln Leu Ser Asn Ser Phe Thr Leu Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys Ile Lys Pro Asn Thr Leu His Lys Lys Ala Ala Glu Thr Leu Met Val Leu Asp Gln Asn Gln Pro 50

40 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID: 9: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI : (A) DŁUGOŚĆ: 141 zasadowych par (B) TYP: kwas nukleinowy (C) KONFORMACJA ŁAŃCUCHA: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (iv) ANTI-SENSE: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID: 9 AATTCTTAGG ATCCTAGGAT G GGG ATC GGA AAA CGA ACA AAT GAA CAT ACG 51 Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr GCA GAT TGT AAA ATT AAA CCG AAC ACC TTG CAT AAA AAA GCT GCA GAG 99 Ala Asp Cys Lys Ile Lys Pro Asn Thr Leu His Lys Lys Ala Ala Glu ACT TTA ATG GTC CTT GAC CAA AAT GAA CCA TAAAGATCTT GA 141 Thr Leu Met Val Leu Asp G ln Asn Gln Pro (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID: 10: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 141 zasadowych par (B) TYP: kwas nukleinowy (C) KONFORMACJA ŁAŃCUCHA: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (iv) ANTI-SENSE: tak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID: 10 AGCTTCAAGA TCTTTATGGT TCATTTTGGT CAAGGACCAT TAAAGTCTCT GCAGCTTTTT 60 TATGCAAGGT GTTCGGTTTA ATTTTACAAT CTGCCGTATG TTCATTTGTT CGTTTTCCGA 120 TCCCCATCCT AGGATCCTAA G 141 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID: 11: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 36 kwasów aminowych (B) TYP: kwas aminowy (D) TOPOLOGIA: liniowa

41 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID: 11: Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys Ile Lys Pro Asn Thr Leu His Lys Lys Ala Ala Glu Thr Leu Met Val Leu Asp Gln Asn Gln Pro 35

42 FIG. 1 FIG. 2

43 FIG. 3 FIG. 4

44 FIG. 5A FIG. 5B

45 FIG. 6 FIG. 7

46 FIG. 7A FIG. 8

47 FIG. 9

48 FIG. 10 FIG. 11

49 FIG. 12 FIG. 13