(21) Numer zgłoszenia: (54)Sposób wytwarzania zasadniczo czystej nitrylazy bakteryjnej

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) POLSKA (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: (51) Int.Cl.5 : C12N 1 5 /5 2 Urząd Patentowy R zeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: (54)Sposób wytwarzania zasadniczo czystej nitrylazy bakteryjnej (30)P ierw szeń stw o: ,US, ,US, (73)U praw niony z patentu: Rhone - Poulenc Agrochimie, Lyon, FR (72)T w órca w ynalazku: David Stalker, Davis, US (43) Z głoszenie ogłoszono: (74) P ełn om ocn ik: BUP 22/87 PHZ Polservice", Warszawa, PL (45) O udzieleniu p atentu ogłoszono: WUP 03/92 (57) 1. Sposób w ytw arzania zasadniczo czystej nitrylazy bakteryjnej o masie cząsteczkowej wynoszącej około 34 kilodaltonów, posiadającej aktyw ność właściwą wynoszącą co najm niej 0,1 μm ola N H 3/m in u tę/m g białka wobec 3,5-dwubromo-4-hydroksybenzonitrylu jako substratu, znam ienny tym, że izoluje się Klebsiella Ozaenae zawierającą sekwencję D N A kodującą nitrilazę, hoduje się K. O zaenae w ytw arzającą nitrilazę w odpow iednim środow isku hodow lanym, przeprowadza się lizę K. Ozaenae i wyodrębnia się wytwarzaną nitrilazę. PL B1

2 Sposób wytwarzania zasadniczo czystej nitrylazy bakteryjnej Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób wytwarzania zasadniczo czystej nitrylazy bakteryjnej o masie cząsteczkowej wynoszącej około 34 kilodaltonów, posiadającej aktywność właściwą wynoszącą co najmniej 0,1 μmola N H 3/m in u tę/m g białka wobec 3,5-dwubrom o-4-hydroksybenzonitrylu jako substratu, znamienny tym, że izoluje się Klebsiella Ozaenae zawierającą sekwencję D N A kodującą nitrilazę, hoduje się K. Ozaenae wytwarzającą nitrilazę w odpowiednim środowisku hodowlanym, przeprowadza się lizę K. Ozaenae i w yodrębnia się w ytw arzaną nitrilazę. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że gen nitrylazy wprowadza się do organizmu gospodarza w formie kasety ekspresyjnej zawierającej gen strukturalny nitrylazy kodujący nitrylazę specyficzną dla 3,5-dw ubrom o-4-hydroksybenzonitrylu p o d k ontrolą regionów regulatorowych transkrypcji i translacji, funkcjonalnych w kom órce roślinnej. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako kasetę ekspresyjną stosuje się kasetę zawierającą co najmniej jedno ramię T-DNA. 4. Sposób według zastrz. 2 albo 3, znamienny tym, że jako kasetę ekspresyjną stosuje się kasetę, w której region inicjacji transkrypcji pochodzi z genu kodującego syntetazę opinową. 5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że gen nitrylazy wprowadza się do organizmu gospodarza w formie kasety ekspresyjnej zawartej w wektorze plazmidowym zdolnym do replikacji w E.coli lub A.Tum efaciens lub w obydwu tych bakteriach. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jak o gen nitrylazy stosuje się sekwencję DN A: ATG GAC ACC ACT TTC AAA GCA GCC GCT GTT CAG GCC GAA CCG GTA TGG ARG GAT GCC GCT Met Asp Thr Thr Phe Lys Ala Ala Ala Val Gin Ala Glu Pro Val Trp Met Asp Ala Ala GCA ACA GCC GAT AAG ACC GTG ACG CTA GTA GCT AAA GCC GCA GCG GCT GGC GCG CAG CTC Ala Thr Ala Asp Lys Thr Val Thr Leu Val Ala Lys Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gin Leu GTC GCA TTT CCC GAA TTG TGG ATT CCG GGC TAC CCA GGA TTC ATG CTC ACG CAC AAC CAA Val ala Phe Pro Glu Leu Trp Ile Pro Gly Tyr Pro Gly Phe Met Leu Thr His Asn Gin ACC GAA ACC CTA CCA TTC ATC ATT AAA TAC CGC AAG CAG GCA ATC GCC GCC GAT GGA CCA Thr Glu Thr Leu Pro Phe Ile Ile Lys Tyr Arg Lys Gin Ala Ile Ala Ala Asp Gly Pro GAA ATC GAA AAA ATT CGC TGC GCG GCT CAG GAG CAT AAC ATT GCG CTC TCC TTT GGG TAC Glu Ile Glu Lys Ile Arg Cys Ala Ala Gin Glu His Asn Ile Ala Leu Ser Phe Gly Tyr AGC GAA CGG GCT GGC CGT ACG CTC TAC ATG TCA CAA ATG CTT ATC GAT GCC GAT GGC ATC Ser Glu Arg Ala Gly Arg Thr Leu Tyr Met Ser Gin Met Leu Ile Asp Ala Asp Gly Ile ACC AAA ATT CGT CGT CGA AAG CTC AAA CCA ACC CGC TTT GAA CGA GAA CTC TTT GGC GAA Thr Lys Ile Arg Arg Arg Lys Leu Lys Pro Thr Arg Phe Glu Arg Glu Leu Phe Gly Glu GGT GAC GGA TCG GAC TTA CAG GTC GCC CAA ACT AGC GTT GGT CGG GTG GGT GCC CTC AAC Gly Asp Gly Ser Asp Leu Gin Val Ala Gin Thr Ser Val Gly Arg Val Gly Ala Leu Asn TGC GCG GAG AAT TTG CAG TCG CTA AAC AAG TTT GCG CTT GCT GCC GAG GGT GAA CAG ATA Cys Ala Glu Asn Leu Gin Ser Leu Asn Lys Phe Ala Leu Ala Ala Glu Gly Glu Gin Ile

3 CAT ATC TCC GCC TGG CCA TTC ACG CTT GGA AGC CCT GTG CTC GTC GGA GAC TCC ATC GGC His Ile Ser Ala Trp Pro Phe Thr Leu Gly Ser Pro Val Leu Val Gly Asp Ser Ile Gly GCC ATC AAC CAG GTC TAC GCG GCC GAG ACG GGG ACC TTC GTT CTC ATG TCG ACG CAG GTG Ala Ile Asn Gin Val Tyr Ala Ala Glu Thr Gly Thr Phe Val Leu Met Ser Thr Gin Val GTT GGA CCG ACC GGC ATC GCC GCC TTC GAG ATC GAA GAC AGG TAC ACC CCG AAT CAG TAT Val Gly Pro Thr Gly Ile Ala Ala Phe Glu Ile Glu Asp Arg Tyr Asn Pro Asn Gin Tyr CTT GGT GGT GGG TAC GCG CGG ATC TAC GGG CCT GAC ATG CAG TTG AAG AGC AAG TCG TTG Leu Gly Gly Gly Tyr Ala Arg Ile Tyr Gly Pro Asp Met Gin Leu Lys Ser Lys Ser Leu TCA CCG ACC GAA GAG GGC ATC GTC TAC GCC GAG ATC GAC CTG TCG ATG CTT GAG GCA GCA Ser Pro Thr Glu Glu Gly Ile Val Tyr Ala Glu Ile Asp Leu Ser Met Leu Glu Ala Ala AAG TAC TCG CTC GAT CCC ACG GGC CAC TAT TCG CGC CCT GAT GTG TTC AGC GTG TCG ATT Lys Tyr Ser Leu Asp Pro Thr Gly His Tyr Ser Arg Pro Asp Val Phe Ser Val Ser Ile AAC CGG CAA CGG CAG CCT GCG GTG TCA GAA GTT ATC GAC TCA AAC GGT GAC GAG GAC CCG Asn Arg Gin Arg Gin Pro Ala Val Ser Glu Val Ile Asp Ser Asn Gly Asp Glu Asp Pro AGA GCA GCA TGC GAG CCC GAC GAG GGG GAT CGT GAG GTC GTA ATC TCT ACG GCA ATA GGG Arg Ala Ala Cys Glu Pro Asp Glu Gly Asp Arg Glu Val Val Ile Ser Thr Ala Ile Gly GTT CTA CCC CGT TAT TGC GGA CAT TCC Val Leu Pro Arg Tyr Cys Gly His Ser połączoną z regionem regulatorowym transkrypcji i znajdującą się pod kontrolą tego regionu, przy czym region ten jest inny niż region inicjacji transkrypcji typu dzikiego dla specyficznej dla brom oksynilu nitrylazy bakteryjnej znajdujący się w Klebsiella. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że jako sekwencję D N A stosuje się sekwencję, w której region regulatorow y transkrypcji jest funkcjonalny w roślinach. 8. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że jako sekwencję D N A stosuje się sekwencję, w której region regulatorow y transkrypcji jest funkcjonalny w bakteriach. 9. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że jako sekwencję D N A stosuje się sekwencję posiadającą otw artą ramę odczytu dla nitrylazy specyficznej dla 3,5-dwubrom o-4-hydroksybenzonitrylu, a na końcu 5' posiada region inicjacji transkrypcji inny niż region typu dzikiego. 10. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że jako sekwencję DNA stosuje się sekwencję zasadniczo hom ologiczną z sekwencją D N A z Klebsiella. 11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako organizm gospodarza, w którym zachodzi ekspresja genu nitrylazy stosuje się kom órki roślinne. * * * Przedm iotem w ynalazku jest sposób w ytw arzania zasadniczo czystej nitrylazy bakteryjnej. Możliwość nadawania m ikroorganizm om i kom órkom pochodzącym z organizm ów wyższych nowych cech genetycznych otw iera szerokie pole dla uzyskania now ych zdolności tych organizmów. Jedna z takich dziedzin dotyczy środków wykorzystywanych ze względu na właściwości cytotoksyczne. Przykładowo, w rolnictwie, stosuje się wiele związków jako środki owadobójcze, chwastobójcze lub podobne. W wielu przypadkach, związki te m ają stosunkow o długi okres trw ania lub przedłużoną aktyw ność resztkową. W wielu sytuacjach wymagane jest działanie wybiórcze z zachowaniem określonych gatunków i niszczeniem innych. Przykładowo, często pożądane jest selektywne niszczenie chwastów przy minimalnym szkodliwym działaniu na rośliny uprawne. Jednak większość środków chwastobójczych o szerokim spektrum działania wykazuje znaczne, szkodliwe działanie na rośliny uprawne, co ogranicza ich używanie do stosowania przed wzejściem roślin lub do bardzo ostrożnego stosowania po wzejściu. Przedmiotem dużego zainteresowania jest zatem możliwość m odyfikowania zdolnych do życia kom órek, nadając im oporność na stresy, takie ja k środki cytotoksyczne.

4 W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr ujawniono użycie bakteryjnego genu aroa do nadania oporności na środek glyphosate kom órkom wrażliwym na ten środek. Hsu i Cam per (Ca. J. M icrobiol, 1976, ) opisali izolację m ikroorganizm ów degradujących ioksynil ze w zbogaconych hodowli z gleby. H su i Clenson (Dissert. A bstr. Intern. B36 / 1976/, nr 8, 3708) opisali degradację m ikrobiologiczną środków chwastobójczych z grupy 3,5-dw uchlorow co-4-hydroksybenzonitryli. Ingram i Pullin (Pastic. Sei. 1974, 5, ) donieśli o trwałości brom oksynilu w trzech typach gleby. Smith (Abstrp. Meeting W eed Soc. Am. 1971, str.16-17) opisał degradację brom o- ksynilu w ciężkiej glebie gliniastej Regina. Smith i Flether (H ort. Res. 1964, 4, 60-62) opisali 3,5-dw uchlorow co-4-hydroksybenzonitryle i m ikroorganizm y glebowe. Przedm iotem wynalazku jest sposób wytwarzania zasadniczo czystej nitrylazy bakteryjnej o m asie cząsteczkowej wynoszącej około 34 kilodaltonów, posiadającej aktyw ność właściwą wynoszącą co najmniej 0,1 μm ola N H 3/m inutę/m g białka wobec 3,5-dwubromo-4-hydroksybenzonitrylu jak o substratu, polegający na tym, że izoluje się Klebsiella Ozaenae zawierającą sekwencję D N A kodującą nitrilazę, hoduje się K. Ozaenae wytwarzającą nitrilazę w odpowiednim środowisku hodowlanym, przeprowadza się lizę K. Ozaenae i wyodrębnia się wytwarzaną nitrilazę. Nitrylazy specyficzne dla bromoksynilu i/lu b ioksynilu znajdują zastosowanie do detoksyfikacji środow iska naturalnego zawierającego brom oksynil i pokrewne środki chwastobójcze i do ochrony kom órek gospodarza przed cytoksycznym działaniem tych środków. Elementy konstrukcyjne zawierające geny kodujące nitrylazę mogą być stosowane do selekcjonowania kom órek gospodarza zaw ierających takie elem enty konstrukcyjne od kom órek gospodarza nie zaw ierających tych elem entów. Dzięki wynalazkowi uzyskano nowe sekwencje DNA, elementy konstrukcyjne, transform o- wane kom órki, rośliny i białka związane z hydrolizą chlorowcowanych hydroksybenzonitryli, zwłaszcza 3,5-dwubromo-4-hydroksybenzonitrylu. Stosując wynalazek m ożna wytwarzać enzym zdolny do hydrolizowania tego związku uzyskując niszczenie aktywności chwastobójczej nitrylu, ochronę k om órek lub gospodarza wrażliwego na ten środek chw astobójczy lub odtruw anie środowiska naturalnego zanieczyszczonego tym środkiem chwastobójczym. Żądany gen strukturalny uzyskuje się z jednokom órkow ego m ikroorganizm u, zwłaszcza z bakterii zdolnej do utylizacji benzonitrylu jako źródła azotu, zwykle zdolnej do utylizacji benzonitrylu jak o jedynego źródła azotu. W niniejszym opisie, term in benzonitryl stosuje się w odniesieniu do chlorow cow anego para-hydroksybenzonitrylu, zwłaszcza do 3,5-dw ujodo-4-hydroksy benzonitrylu lub 3,5-dwubrom o-4-hydroksybenzonitrylu a term inem nitrylaza określa się nitrylazę zdolną do stosow ania chlorowcowanego benzonitrylu jako źródła azotu, zwłaszcza jako jedynego źródła azotu. Enzym ten m ożna otrzymać różnymi drogam i, a dogodnie z bakterii występujących w stanie naturalnym w środowisku zawierającym bromoksynil lub ioksynil. Szczególnie interesujące pod tym względem są bakterie jelitowe, zwłaszcza z gatunku Klebsiella. M ożna stosować Klebsiella pneum oniae, a korzystnie K. pneum oniae var. ozaenae. Zam iast izolacji z gleby, można prowadzić wzrost organizmów w glebie lub w innym środowisku przy zwiększających się stężeniach benzonitrylu i zmniejszających się ilościach alternatywnych źródeł azotu, aż do uzyskania m ikroorganizm ów, które przeżywają na benzonitrylu jako jedynym źródle azotu. N iezależnie od źródła, z którego pochodzi bakteria p rodukująca nitrylazę, należy przeprow a- dzić skrining, dla upewnienia się, że nitrylaza ta wydajnie detoksyfikuje benzonitryl. Ponadto, nitrylaza ta powinna być specyficzna dla benzonitrylu a nie powinna rozkładać innych analogów nie zawierających chlorowca, posiadających inne podstaw niki i podobnych. Nitrylaza otrzym ana sposobem według wynalazku powinna być zatem specyficzna dla benzonitryli zdefiniowanych powyżej a nieaktywna w stosunku do analogów lub znacznie mniej aktywna w stosunku do analogów. Pożądane jest; aby nie występowało znaczne obniżenie szybkości proliferacji, to jest, aby obniżenie szybkości proliferacji utrzymywało się w granicach poniżej 10% w stosunku do bakterii rosnących w obecności norm alnego źródła azotu, na przykład am oniaku, w porów naniu do benzonitrylu jako źródła azotu, w porównywalnych stężeniach. Rezultatu takiego nie obserwuje się w przypadku innych niespecyficznych benzonitryli.

5 Po zidentyfikowaniu jednego lub więcej szczepów gospodarza identyfikuje się sekwencje zawierające kod dla nitrylazy stosując znane techniki. Gen taki może się znajdować w chrom osomie lub w plazmidzie. G enom poddaje się fragm entacji za pom ocą endonukleaz restrykcyjnych, stosując jedną lub kilka endonukleaz. Uzyskuje się fragm enty o wielkości od około 5 kilopar zasad do 50 kilopar zasad. Fragm enty te klonuje się za pom ocą odpowiednich wektorów w dogodnej bakterii, na przykład w E.coli, po czym prowadzi się skrining otrzym anych transform antów na aktywność nitrylazy względem organizm u gospodarza stanow iącego negatywny organizm porównawczy. Z jednego lub więcej klonów, w których zidentyfikowano aktyw ność nitrylazy izoluje się elementy pozachrom osom alne zawierające żądany fragm ent D N A, plazm idy lub wirusy, stosując znane techniki, takie jak liza kom órek gospodarza, precypitacja D N A i wyodrębnienie D N A w ektora plazm idow ego lub wirusow ego od D N A chrom osom alnego. Elem enty pozachrom osomalne rozszczepia się endonukleazą restrykcyjną i żądane fragm enty izoluje się stosując różne techniki rozdziału i identyfikacji fragm entów o różnej wielkości, n a przykład technikę elektroforezy, wirowanie w gradiencie gęstości i podobne. Zależnie od wielkości fragm entu, poddaje się go dalszej obróbce dla zm niejszenia jego rozm iarów, tak, aby ściślej odpow iadały rozm iarom żądanego genu i flankujących regionów regulatorowych. Znane są różne techniki m anipulacji fragm entam i zawierającym i sekwencję kodującą enzym oraz sekwencje regulatorowe flankujące tę sekwencję. W tym celu m ożna stosować częściowe trawienie różnymi enzymami restrykcyjnymi w różnych m ieszaninach reakcyjnych z następnym klonow aniem tych fragm entów dla określenia, który z nich zachow uje zdolność ekspresji nitrylazy. Alternatywnym sposobem jest wyizolowanie i częściowe oznaczenie sekwencji enzymu. W oparciu o znaną sekwencję am inokwasową sporządza się sondy, które stosuje się z kolei do identyfikacji fragm entów zawierających żądany gen. Łącząc takie podejście z trawieniem enzymem restrykcyjnym, klonuje się fragm enty i prow adzi skrining na obecność żądanego genu. Ponadto, w celu usunięcia nukleotydów z jednego lub z obydwu końców fragm entu dla dalszego zmniejszenia ilości zbędnych nukleotydów, stosuje się trawienie egzonuklezazam i, takim i jak B a 131. Alternatywnie, gen klonuje się w odpowiednim gospodarzu i izoluje się informacyjny RNA skrining z sondą, prow adząc identyfikację w odpowiednim układzie translacyjnym in vitro lub in vivo, na przykład, w oocytach Xenopus lub w lizacie retikulocytów lub w podobnym układzie. W yizolowany informacyjny RNA stosuje się do wytworzenia cd N A stosując znane techniki z użyciem odwrotnej transkryptazy i utworzeniem nici kom plem entarnej wobec polimerazy DNA. W tym przypadku, otrzym any gen strukturalny nie jest związany z regionam i regulatorowym i związanym i z transkrypcją. Sekwencję D N A zawierającą gen strukturalny zdolny do ekspresji nitrylazy m ożna łączyć z wieloma różnymi innymi sekwencjami D N A w celu w prowadzenia go do odpowiedniej kom órki gospodarza. Sekwencja towarzysząca będzie zależeć od rodzaju gospodarza, sposobu w prow adzania sekwencji D N A do gospodarza i od tego, czy pożądane jest utrzym anie charakteru episom alnego czy integracja. Dla gospodarzy prokariotycznych istnieje wiele różnych wektorów, które m ożna stosować do w prow adzania sekwencji D N A poprzez transform ację, konjugację lub transfekcję. Takie sekw encje D N A obejm ują wiele różnych plazm idów, takich jak pbr322, pacyc184, pm B9, prk290 i podobne, kosmidy, takie jak pvk100 lub wirusy, takie jak P22 i podobne. W prowadzenie D N A do gospodarzy eukariotycznych m ożna prowadzić wieloma różnym i technikam i, takimi jak transform acja za pom ocą D N A strąconego wobec jonów wapnia, wymagająca nie podlegającej replikacji sekwencji D N A, plazm idu lub m inichrom osom u, transform acja za pom ocą sekwencji zawierającej T-D N A w Agrobacterium, m ikroinjekcja za pom ocą m ikropipety lub elektroporacja. Od tego, czy w konstrukcji D N A jest obecny kom petentny układ replikujący będzie zależeć, czy D N A ten będzie podlegał replikacji jako element episomalny czy też będzie on zintegrowany z genomem gospodarza i będzie następow ała ekspresja genu strukturalnego w gospodarzu. M ożna

6 stosować elementy episom alne, takie jak plazmidy wywołujące nowotwory, na przykład Ti lub Ri lub ich fragm enty albo wirusy, na przykład, CAMV, TM V, lub ich fragm enty, nie zabijające kom órki gospodarza, w których to elem entach episom alnych obecny jest gen strukturalny, usytuow any w sposób, który pozwala na ekspresję tego genu strukturalnego. Szczególnie przydatne są fragm enty posiadające funkcję replikacyjną a nie posiadające innych funkcji, takich jak onkogeneza, wirulencja i podobne. Fragm enty otrzym ane ze źródła wytwarzającego nitrylazę klonuje się, stosując odpowiedni w ektor klonujący. Klonowanie prow adzi się w odpowiednim m ikroorganiźm ie jednokom órkowym, na przykład w bakterii takiej jak E.coli. Korzystne jest zastosowanie kosmidu, gdzie przez częściowe lub w yczerpujące traw ienie otrzym uje się fragm enty o rozm iarach zbliżonych do żądanych. Przykładow o, kosm id pvk100 m ożna częściowo traw ić odpow iednim enzymem restrykcyjnym i poddaw ać ligacji z fragm entam i uzyskanymi w wyniku częściowego lub wyczerpującego traw ienia plazm idu, chrom osom u lub ich fragm entu. Jedynie fragm enty o żądanych rozm iarach będą mogły być upakow ane i w prow adzone przez transdukcję do organizm u gospodarza. Organizm gospodarza selekcjonuje się w oparciu o cechę oporności na benzonitryl. Szczepy przyjm ujące m ożna modyfikować, nadając im odpowiednie cechy genetyczne, pozwalające na selekcję tych kom órek, które ulegały transdukcji (transduktantów ). W m ikroorganizm ach, transduktanty te m ożna stosować do konjugacji z innymi m ikroorganizm ami, stosując ewentualnie plazmid mobilizujący. D la dalszego zmniejszenia rozm iarów fragm entu zawierającego gen strukturalny nitrylazy m ożna stosować wiele technik. Przykładowo, m ożna izolować wektor kosmidowy, trawić go różnymi endonukleazam i restrykcyjnymi, na przykład EcoRI, Bg 1II, Sm al i podobnym i i otrzym ane fragmenty klonować w odpowiednim wektorze, dogodnie, w poprzednio użytym wektorze kosmidowym. Zam iast wektorów kosmidowych m ożna stosować różne dostępne w ektory klonujące o małych rozm iarach, jak pacyc177 i pacyc184. T ak więc, m ożna klonować fragm enty o rozm iarach poniżej 5 kilopar zasad, zwykle poniżej 4 kilopar zasad a bardziej korzystnie, poniżej 2 kilopar zasad nadając oporność na benzonitryl. Pożądane jest, aby fragm ent taki miał długość około 1 kilopary zasad a mniejszą od 5 kilopar zasad, korzystnie mniej niż 4 kilopary zasad, konkretnie zaś, co najmniej 1047 par zasad, bardziej konkretnie, łącznie z regionami flankującym i, co najmniej 1100 par zasad, korzystnie poniżej 1,5 kilopar zasad. Szczególnie korzystny jest fragment Bg1II-Sm al pochodzący z Klebsiella ozaenae a jeszcze bardziej korzystny, fragm ent PstI-HincII o długości 1210 par zasad. Ekspresję enzymu nitrylazy m ożna uzyskać w dowolnym dogodnym źródle prokariotycznym lub eukariotycznym, takim jak bakterie, drożdże, grzyby nitkow ca, kom órki roślin i podobne. Tam, gdzie enzym nie jest wydzielany przez kom órkę, m ożna stosować liżę kom órek i izolować nitrylazę znanymi drogam i. D o takich użytecznych sposobów izolowania należy chrom atografia, elektroforeza, chrom atografia powinowactwa i podobne techniki. D ogodną drogą jest konjugacja brom oksynilu poprzez odpow iednie grupy funkcyjne, na przykład, grupę karboksylow ą z nierozpuszczalnym nośnikiem i użycie tego połączenia jako wypełnienia do izolacji nitrylazy. Aktywność właściwa nitrylazy powinna wynosić co najmniej około 0,1 μmola am oniaku (m inutę/m g białka), zwykle co najmniej około 0,5 lub więcej w warunkach opisanych przez H arp era (Biochem. J., 1977, 167, ). Oczyszczony enzym m ożna stosować w różny sposób. M ożna go stosować bezpośrednio do oznaczeń brom oniksynilu, ioksynilu i innych pokrewnych benzonitryli. Enzym ten, w postaci skonjugow anej z określoną oznaczoną substancją, na przykład z h aptenem, antygenem lub przeciwciałem może znaleźć zastosowanie jako środek do znakowania w próbach diagnostycznych. Próby takie są opisane w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr , i W tych opisach patentowych podane są szczegółowo sposoby konjugowania oraz oznaczania stężenia oznaczanej substancji. Sekwencję DNA kodującą nitrylazę m ożna stosować na wiele sposobów. Sekwencja ta może być użyta jako sonda przy izolowaniu nitrylaz typu dzikiego lub zmutowanych. M ożna ją również stosow ać do integracji z gospodarzem przez rekom binację tego gospodarza, w celu nadania mu oporności na benzonitryl. W zastosow aniu do kom órek roślinnych, gen strukturalny zaw arty w elemencie konstrukcyjnym m ożna w prow adzać do ją d ra kom órki roślinnej m etodą injekcji m ikropipetą w celu jego

7 integracji przez rekom binację z genom em gospodarza. A lternatyw nie, gen strukturalny w prow a- dza się do gospodarza roślinnego m etodą elektroporacji. Jeśli gen strukturalny uzyskuje się ze źródła posiadającego regulatorowe sekwencje sygnalne, które nie są rozpoznawane przez gospodarza roślinnego, wtedy dla uzyskania ekspresji tego genu niezbędne jest w prow adzenie odpow iednich sygnałów regulatorow ych. Przy stosowaniu wirusa lub plazm idu, na przykład plazm idu wywołującego nowotwór, po wykonaniu jego mapy restrykcyjnej wybiera się miejsce restrykcyjne w dół od prom otora, przy którym ma być dokonana insercja genu strukturalnego w odpowiedniej odległości od tego prom o- tora. Jeśli w sekwencjach D N A nie występuje odpowiednie miejsce restrykcyjne, trawi się je kilkakrotnie egzonukleazą, taką jak Ba131 i w prowadza syntetyczne miejsce rozpoznaw ane przez endonukleazę restrykcyjną (linker). Szczególnie korzystne jest zastosowanie plazm idu wywołującego nowotwór, takiego jak Ti lub Ri, za pom ocą których gen nitrylazy m ożna wprowadzać do chrom osom ów kom órek roślinnych. Zastosowanie plazm idów Ti lub Ri jest opisane w publikacjach zgłoszeń PCT n r WO 84/02913, i oraz w publikacji zgłoszenia europejskiego EPO , jak również w publikacji M atzke'go i C hiltona w J. M ol. Appl. G enetics, 1981, Stosując prawe ram ię lub obydwa ram iona T-D N A, w którym ram iona flankują kasetę ekspresyjną zawierającą gen strukturalny nitrylazy pod kontrolą transkrypcyjnych i translacyjnych sygnałów regulatorowych inicjacji i zakończenia rozpoznawanych przez gospodarza roślinnego, można zintegrować kasetę ekspresyjną z genomem gospodarza i uzyskać ekspresję enzymu nitrylazy w kom órce gospodarza w różnych etapach różnicow ania. D la uzyskania ekspresji w kom órkach roślinnych m ożna przygotowywać różne elementy konstrukcyjne. Elementy te zawierają kasetę ekspresyjną zdolną do funkcjonow ania w roślinach, dając ekspresję nitrylazy w gospodarzu roślinnym. W celu umożliwienia transkrypcji stosuje się różne regiony inicjacji transkrypcji tzw. regiony prom otorow e, zarówno konstytutywne jak i indukowane. Jeśli w niepodlegającym translacji regionie 5' brak kodonu A T G to region inicjacji tran s- krypcji łączy się z genem strukturalnym kodującym nitrylazę uzyskując sekwencje inicjacji tran s- krypcji za kodonem inicjacji, zwykle w obrębie 200 zasad od kodonu inicjacji. Koniec 3' genu strukturalnego będzie zawierał jeden lub więcej kodonów stopu, które łączy się z regionem zakańczania transkrypcji funkcjonalnym w gospodarzu roślinnym, przy czym ten region term inatorow y może być związany z tym samym lub innym genem strukturalnym, co region inicjacji. Kaseta ekspresyjna charakteryzuje się tym, że zawiera w kierunku przebiegu transkrypcji: region inicjacji, gen strukturalny pod kontrolą regionu inicjacji transkrypcji oraz region zakańczania kontrolujący zakańczanie transkrypcji i tw orzenia inform acyjnego RNA. Jako regiony regulatorow e transkrypcji i translacji korzystnie stosuje się regiony prom otorowe i term inatorowe dla związków opiniowych, pozwalające na konstytutyw ną ekspresję genu nitrylazy. Alternatyw nie, m ożna stosować inne prom otory i/lu b term inatory, zwłaszcza prom o- tory um ożliwiające w gospodarzu roślinnym ekspresję indukow aną lub regulow aną. D o regionów prom otora uzyskiwanych z plazm idu Ti należą prom otory opinowe, takie jak prom otor syntetazy oktopiny, prom otor syntetazy nopaliny, prom otor syntetazy agropiny, p ro - m otor syntetazy m anopiny i podobne. M ogą być również stosowane prom otory wirusowe, takie jak prom otor regionu VICA M V lub prom otor o pełnej długości (358), prom otory związane z genami karboksylanów ribulozo-1,5-bisfosforanowych, na przykład m ała jednostka, geny związane z faseoliną, grom adzeniem białka, β-conglycyniny, tw orzeniem celulozy i podobne. Różne sekwencje m ożna ze sobą łączyć w znany sposób. Region prom otora identyfikuje się poprzez region w kierunku 5' od genu strukturalnego, przykładow o gen opinowy oraz dokonuje się jego selekcji i izolacji przez m apow anie restrykcyjne i sekw encjonow anie. Podobnie, region term inatorow y izoluje się jako region w kierunku 3' od genu strukturalnego. Otrzym ane sekwencje klonuje się i łączy w takiej orientacji aby uzyskać konstytutyw ną ekspresję genu nitrylazy w gospodarzu roślinnym.

8 M odyfikując kom órki roślin upraw nych przez w prow adzenie genu funkcjonalnego w yrażającego się wytwarzaniem enzymu nitrylazy, m ożna stosować brom oksynil, ioksynil lub analogiczny środek chwastobójczy w wielu różnych hodowlach roślin uprawnych w stężeniach zapewniających całkowite niszczenie chwastów przy jednoczesnym pozostawaniu roślin uprawnych w stanie nienaruszonym. W ten sposób uzyskuje się popraw ę ekonomiki hodowli, gdyż zużytkowanie nawozów sztucznych i wody jest bardziej wydajne i unika się niepożądanych skutków obecności chwastów. Kasetę ekspresyjną dającą ekspresję enzymu nitrylazy m ożna wprowadzać do wielu odm ian roślin, zarów no jednoliściennych jak i dwuliściennych, takich jak kukurydza, pszenica, soja, tytoń, bawełna, pom idory, ziemniaki, gatunki Brassica, ryż, orzeszki ziemne, petunia, słonecznik, burak cukrowy, traw a kwietnikowa i podobne. Gen może być obecny w kom órkach lub w częściach roślin takich jak callus (twardzina), tkanka, korzenie, bulwy, odrośle, rozłogi, małe roślinki, kiełkujące nasiona, liście, sadzonki, pyłek kwiatow y i podobnych. Przy hodowli roślin uprawnych opornych na benzonitryl m ożna stosować wiele różnych form użytkowych środka chwastobójczego w celu ochrony tych roślin przed chwastami, zwiększając wzrost roślin uprawnych i zmniejszając zużycie środków odżywczych. Przykładowo, bromoksynil m ożna stosować po wzejściu roślin do niszczenia chwastów w hodow lach zabezpieczonych roślin upraw nych takich jak słonecznik, soja, kukurydza, bawełny i podobne, w formie czystego związku lub w postaci złożonych form użytkowych w kombinacji z innymi produktam i. Na pola m ożna stosować ogólnie przyjęte ilości środków chwastobójczych w form ach użytkowych, tak, aby uzyskać stężenie 0,112-4,48 kg/ha, korzystnie 0,224-2,24 k g /h a bromoksynilu. Inne środki chwastobójcze stosuje się w ilości 0,112-4,48 k g/ha składnika aktywnego. Formy użytkowe powinny zawierać inne dodatki, takie jak detergenty, środki pom ocnicze, środki rozpryskujące, zagęszczające, stabilizatory i podobne. Stosuje się tu m okre lub suche form y użytkowe, między innymi proszki, koncentraty tworzące emulsje, koncentraty ciekłe i inne znane w technice. Roztwory środka chwastobójczego stosuje się w znany sposób, na przykład przez rozpylenie, naw adnianie, opylanie. W ynalazek ilustruje następujący przykład nie ograniczając jego zakresu. Przykład. M ateriały i metody. Enzymy restrykcyjne i ligazę T4 do reakcji ligacji stosowano zgodnie z zaleceniami producenta. K lonow anie i analizę m olekularną prow adzono według przepisów podanych w wydawnictwie: M aniatis i wsp. 1982, M olecular Cloning: A Laboratory M anual, Cold Spring H arbor L aboratory, New York. Analizę klonów prow adzono w sposób opisany przez Ish-H orow itza i wsp., Nuci. Acids Res., 1981,9, D o wszystkich prób klonowania stosowano E.coli, szczep MM294 (H anahan, Mol. Biol., 1983, 166, ). Antybiotyki stosowano w stężeniach: chloram fenikol /Cm/: 25 μg/m l; tetracyklina /T c /: 10 μg/m l; penicylina /A p /: 300 μg/m l. Transform acje plazmidowego D N A w E.coli prow adzono według M andela i Higa, J. Mol.- Biol., 1970, 53, W yizolow ano i przeprow adzono skrinig bakterii w yodrębnionych z próbek gleby zanieczyszczonej brom oksynilem. Jeden z m ikroorganizm ów zidentyfikow ano jak o Klebsiella pneum o- niae, p o d gatunek ozaenae. Po częściowym oczyszczeniu i scharakteryzow aniu substancji specyficznych dla brom oksynilu uzyskano z tego organizmu aktywny enzym-nitrylazę, o pozornym ciężarze cząsteczkowym równym 34 kilodaltonów. W wyniku prowadzenia wielokrotnych hodowli pochodnych K. ozaenae na stałym agarze L, wyizolowano w ariant, który nie wykazywał już zdolności utylizacji brom oksynilu jako jedynego źródła azotu, jeśli jego wzrost prow adzono w ciekłej pożywce o określonym składzie, zawierającej w litrze: 1,5 g K H 2PO 4, 3,5 g K2H P O4, 0,1 g MgSO4-7H2O, 50 mg ekstraktu drożdżowego, po 0,1 % cytrynianu, glicerolu i bursztynianu oraz pierwiastki śladowe. Podłoże to zostało opisane przez Barnetta i Ingraham a J. Appl. Bacteriol., 1975, 18, i znane jest jako wielowęglowa pożywka YETE. Ta wielowęglowa pożywka YETE zawierała ponadto 0,05% bromoksynilu. Jakkolw iek om awiany organizm nie utylizuje brom oksynilu jako jedynego źródła azotu, może on rosnąć, uzyskując pełną gęstość na pożywce L zawierającej 0,05% brom oksynilu. W yselekcjonowano kolonię w ariantu K. ozaenae i prow adzono jej wzrost w 10 ml pożywki L. Ponadto, z płytek

9 LB zawierających brom oksynil wybrano 3 niezależne kolonie K. ozaenae i prowadzono ich wzrost w tych samych warunkach. Te same 4 kolonie K. ozaenae hodow ano jednocześnie w 10 ml pożywki L z dodatkiem 0,05% brom oksynilu. W zrost hodowli prow adzono do uzyskania pełnej gęstości przy tem peraturze 30 C i z każdej hodowli w ypreparow ano plazmidowy DNA techniką m inipreparatywną opisaną przez Ish-Horow itza i wsp., Nuci. Acids Res., 1981, 9, Nietrawione plazmidowe DNA poddano elektroforezie w 0,5% żelu agarozowym i pasm a plazm idu uwidaczniano przez barw ienie brom kiem etidium. W jednym wariancie K. ozaenae, rosnącym bądź w obecności bądź w nieobecności b ro m o- ksynilu ujaw niono pojedynczy plazm id o wielkości 68 kilopar zasad. W trzech koloniach K. ozaenae wykazano większe plazmidy (90 kilopar zasad) przy prow adzeniu wzrostu w obecności 0,05% bromoksynilu. W nieobecności brom oksynilu, w dwóch spośród trzech kolonii K. ozaenae były obecne obydwie formy plazm idu. D ane te wskazują na konwersję większych plazmidów w mniejsze form y z towarzyszącą utratą około 22 kilopar zasad plazmidowego D N A przy zaprzestaniu selekcji brom oksynilem. Wszystkie cztery kolonie hodow ano w 200 ml pożywki L zawierającej 0,05% bromoksynilu. Następnie niszczono kom órki w prasie francuskiej, supernanty uzyskane po wirowaniu z dużą szybkością dializowano wobec buforu zawierającego 0,05M KPO 4 ph 1,5/ i 2,5 mm ditiotreitolu (DTT), po czym w oddzielnych surowych ekstraktach oznaczono aktywność nitrylazy specyficzną dla bromoksynilu. Surowy ekstrakt, uzyskany z w ariantu K. ozaenae nie zawierał oznaczalnych ilości aktywności nitrylazy, podczas gdy pozostałe surowe ekstrakty K. ozaenae wykazywały specyficzną aktywność nitrylazy równą odpowiednio 0,124, 0,105 i 0,143 μmoli NH3/minutę/m g białka. Prowadzono wzrost zawiesiny kom órek (200 ml) w tem peraturze 30 C do punktu środkowego logarytmicznej fazy wzrostu na pożywce M9 (Miller 1972), zawierającej 0,1% glukozy i 0,04% bromoksynilu. Surowe ekstrakty uzyskano przez zniszczenie kom órek, ultrawirowanie i dializę supernantu w buforze zawierającym 0,05 M KPO 4 (ph 7,5) i 2,5 mm DTT. We wszystkich próbach stężenie substratu wynosiło 3 mm bromoksynilu. W ydzielanie NH3 m onitorow ano m etodą H arpera (Biochem. J. 1977, 888, ). Zdolność wariantu K. ozaenae do wzrostu na pożywce L zawierającej bromoksynil może być wynikiem nabytej przez ten organizm nieprzepuszczalności dla tego związku. Jednak organizm ten nie może rosnąć na określonych pożywkach utylizując brom o- ksynil jako jedyne źródło azotu. Reasum ując, okazało się, że kod genetyczny dla nitrylazy K. ozaenae znajduje się w plazm i- dach. Gen (geny) kodujące ten enzym są usytuowane w segmencie plazmidowego DNA o wielkości 22 kilopar zasad odrywanym sam orzutnie z plazm idu K. ozaenae przy zaprzestaniu selekcji brom oksynilem. Ekspresja nitrylazy specyficznej dla brom oksynilu z K. ozaenae w E.coli. Z K. ozaenae w warunkach selekcyjnych z dodatkiem 0,05% bromoksynilu preparuje się plazmidowy DNA i D N A ten transform uje się do E.coli, szczep MM294 (thi, gyra96, endl-, HsdR17). Selekcję transform antów prowadzi się na nie zawierającym azotu (N-) stałym m inim alnym podłożu agarozowym (zawierającym w litrze: 1,5g K H 2PO 4, 3,5g K2H PO 4, 0,1 g - MgSO4 7H 20 i 0,1% glukozy) z dodatkiem 0,05% brom oksynilu jako jedynego źródła azotu. Po 5 dniach inkubacji na płytkach selekcyjnych pojawiło się 10 kolonii. Kolonie te posiewa się ezą na płytki z agarem L zawierającym 0,05% bromoksynilu i testuje się na obecność w MM294 auksotroficznego m arkera tiaminy. W żadnej z kolonii rosnących na podłożu minimalnym w nieobecności tiaminy nie wykazano, że jest to szczep E.coli MM294. Wszystkie kolonie miały zdolność wzrostu na podłożu M9 wzbogaconym w tiaminę i 0,05% bromoksynilu jako jedynego źródła azotu. Nie zaobserwowano wzrostu na tym podłożu w nieobecności brom oksynilu. D o dalszej analizy wybrano dwie z tych kolonii. Analiza surowego ekstraktu z preparatów E. coli MM294 zawierających plazmid o wielkości 90 kilopar zasad na aktywność nitralizy specyficznej dla bromoksynilu wykazała aktywność właściwą rów ną 0,216 μmola NH 3/m inutę/m g. W szczepach E. coli MM294 zawierających mniejsze plazm idy aktyw ność nitrylazy była nieoznaczalna. W iększy plazm id E.coli o wielkości 90 kilopar zasad oznaczono symbolem pbrx 1 a mniejszy plazm id o wielkości 68 kilopar zasad oznaczono symbolem pb rx1. D la potwierdzenia, że szczep E. coli MM294 zawierający plazm id pb rx1 wytwarza właściwy m etabolit jak o wynik reakcji nitrylazy specyficznej dla brom oksynilu, prow adzi się wzrost 2 ml

10 hodowli E. coli MM294 (pb rx1) w czasie 24 godzin w tem peraturze 30 C na pożywce M9 z dodatkiem 0,05% bromoksynilu. Próbkę przesączu hodowli poddaje się chrom atografii HPLC na kolumnie C18. Cała zawartość brom oksynilu w przesączu hodowli przechodzi w nowy pik m etabolitu. Ten pik m etabolitu zidentyfikowano m etodą analizy spektralnej jako kwas 3',5'-dwubromo-4- hydroksybenzoesowy (DBHB). Tak więc, produkt ekspresji zawartego w E. coli plazm idu - nitrylaza specyficzna dla brom oksynilu, jest taki sam, jaki występuje w K. ozaenae. K lonow anie genu nitrylazy specyficznej dla brom oksynilu w E. coli. D la zbadania, czy segment DN A kodujący enzym specyficzny dla brom oksynilu nadaje się do klonowania w E. coli, trawi się plazm id pb rx1 enzymem Bam HI, otrzym ując dwa pasm a o wielkości 53 i 37 kilopar zasad. Fragm enty po trawieniu Bam H I poddaje się ligacji do miejsca dla Bam HI w wektorze plazmidowym pacyc 184zE. coli (Chang i Coen, J. Bactieriolog., 1978,134, 1141) i transform uje do szczepu E. coli MM294. Klonowanie do miejsca Bam HI w pacyc 184 powoduje w wyniku insercji inaktywację genu oporności na tetracyklinę. W yselekcjonowano 10 opornych na chloramfenikol i wrażliwych na tetracyklinę kolonii MM294, wypreparowano z nich DNA m etodą m inipreparatywnej analizy klonów i DNA traw iono enzymem Bam HI. Cztery klony zawierały fragm ent Bam H I o długości 37 kilopar zasad a jeden klon zawierał po trawieniu Bam HI większy fragm ent D N A - pb rx1 o długości 53 kilopar zasad. Pięć klonów zawierało klonowany fragm ent Bam HI znaleziony również w plazmidzie pb rx1, korespondujący z segmentem DNA pozostającym po samorzutnej delecji 22 kilopar zasad plazmidowego DNA. Wszystkie 10 klonów hodowano w 200 ml pożywki L w obecności 20 μg/m l chloram fenikolu (selekcjonując w ten sposób plazmid), sporządzono surowe ekstrakty i oznaczono w nich aktywność nitrylazy specyficznej dla bromoksynilu. Cztery klony zawierające fragm ent Bam HI o długości 37 kilopar zasad wykazywały aktywność nitrylazy w zakresie 0,140 μmola uwalnianego N H 3/m in u tę/m g białka, podczas gdy w pozostałych 6 klonach nie stwierdzono wykrywalnej aktywności nitrylazy. D ane te wskazują na fakt, że gen kodujący nitrylazę specyficzną dla bromoksynilu jest zlokalizowany we fragmencie Bam HI o długości 37 kilopar zasad klonowanym z plazmidu pbrx1 i że segment DNA o długości 22 kilopar zasad odszczepiony sam orzutnie przy zaprzestaniu selekcji brom oksynilem jest usytuowany wewnętrznie względem fragmentu BamHI o długości 37 kilopar zasad. Dla potwierdzenia orientacji fragmentów BamHI w odniesieniu do wektora pacyc 184, traw iono DNA z powyższych 4 klonów za pom ocą EcoRI i analizow ano elektroforetycznie w 0,07% żelu agarozowym. Analizowano również połączone produkty trawienia EcoRI plazmidów pb rx1 i pb rx1. Zdefiniowano zarówno orientację fragmentu Bam HI o długości 37 kilopar zasad w odniesieniu do wektora pacyc 184 jak i plazmidów oznaczonych odpowiednio jako pbrx2 i pbrx3. Zaobserwowano ponadto, że te trzy fragmenty EcoRI są usytuowane wewnętrznie w stosunku do segmentu DNA o długości 22 kilopar zasad ulegającego sam orzutnej delecji z plazmidów pbrx2 i pbrx3. Wielkości tych fragmentów EcoRI wynoszą odpowiednio 18 kilopar zasad, 3 kilopary zasad i 1,9 kilopar zasad. Gen kodujący nitrylazę specyficzną dla brom oksynilu powinien być zlokalizowany w obrębie jednego z tych trzech fragm entów EcoRI, o ile ten gen strukturalny nitrylazy nie jest rozdzielony miejscem dla endonukleazy EcoRI. Badano lokalizację specyficznej dla brom oksynilu nitrylazy E. coli (pbrx3). U zyskano następujące wyniki:

11 Tabela 1 Nitrylaza specyficzna dla bromoksynilu jest w E. coli enzymem periplazmatycznym Warunki prowadzenia hodowli a/ Aktywność właściwa nitrylazy b/ Komórki traktowane toluenem (pożywka-l) 0,829 Komórki traktowane lizozymem (pozywka-l) 0,796 Całe komórki (pożywka-l) 0,770 Całe komórki (pożywka-l + Brx1) 1,25 Całe komórki (M9) 0,950 Całe komórki (M9 + Brx 1 ) 1,45 Całe komórki (pacyc184 /M 9) 0 a/ prowadzono wzrost komórek E. coli MM294 zawierających plazmid pbrx3 do uzyskania fazy stacjonarnej w hodowlach 5 ml w temperaturze 37 C we wskazanej pożywce. Tam gdzie wskazano, hodowle zawierały 20 μg/m l chloramfenikolu i 0,04% bromoksynilu (Bral). Z każdej hodowli pobierano próbkę 1 ml, przemywano raz buforem nitrylazy (0,1 M KPO4 (ph 7,5) i komórki zawieszano w 0,1 ml tego samego buforu. W próbkach 50 μl oznaczano aktywność nitrylazy według Harpera (Biochem. J., 1977, 167, ), z dodatkiem lub bez dodatku 3 mm bromoksynilu jako substratu. b/ w μmolach NH3/m inutę/m g. Białko oznaczano przy OD600= 1,4, to jest 109 komórek/ml = 150 μg. Powyższe dane wskazują, że enzym nitrylaza zlokalizowany jest w kom órce w przestrzeni periplazmatycznej. D rugą obserwacją jest fakt, że ekspresja enzymu zachodzi w nieobecności brom oksynilu w pożywce, co wskazuje, że do ekspresji tego enzymu nie jest wymagane indukow a- nie brom oksynilem. Dalsze oczyszczanie nitrylazy specyficznej dla brom oksynilu. Przeprow adzono dalsze oczyszczanie nitrylazy z K. ozaenae uzyskując następujące wyniki: Tabela 2 Oczyszczanie z E. coli nitrylazy specyficznej dla bromoksynilu (materiał wyjściowy - 6 g komórek) Frakcja Objętość Białko μmoli NH3/minutę S.Ab Ekstrakt surowy a/ 100 ml 210 mg 18,15 0, % NH4SO4 6 ml 83 mg 26,77 0,250 D E A E Sephadex 56 ml 19 mg 15,52 0,820 a/ Prowadzono wzrost komórek w temperaturze 30 C do punktu środkowego logarytmicznej fazy wzrostu na pożywce M9 zawierającej 0,04% bromoksynilu i glukozę. Surowe ekstrakty preparowano przez rozbicie komórek, ultrawirowanie i dializę w buforze zawierającym 0,05 M KPO4 (ph 7,5) 1 2,5 mm DTT. We wszystkich próbach oznaczania nitrylazy, stężenie substratu wynosiło 3 mm. b/ μmole NH3/m in/ng. Kolumnę o pojemności 2,5 cm2 X 10 cm równoważono w buforze zawierającym 0,05 M KPO4 (ph 7,5) i 2,5 mm i 1 mm EDTA. Po podaniu próbki, kolum nę rozwijano ilością 300 ml liniowego gradientu 0,02 M do 0,40 M NaCl w powyższym buforze kolumny. Po podaniu gradientu, kolum nę przem ywano buforem zawierającym 1M NaCl. Zbierano frakcje po 5 ml i ilości po 0,075 ml frakcji badano na zawartość nitrylazy. Przy stężeniu 0,22 M soli wymyto pojedynczy pik wykazujący aktywność enzymu. W aktyw nych frakcjach odzyskano około 75% wyjściowej aktyw ności nitrylazy. Frakcje zawierające pik nitrylazy z kolumny D EA E dializowano wobec 0,02 M KPO4 (ph 7,5) i ilości po 50 μl (6 μg białka) z każdej frakcji analizowano w 11,25% denaturow anym żelu Laemmli'ego. Bogate w białko pasmo odpowiadające aktywnemu pikowi z kolum ny D EA E jest polipeptydem o ciężarze cząsteczkowym W aktywnych frakcjach z kolum ny nie wykazano innych polipeptydów. Z tych danych wynika, że nitrylaza specyficzna dla brom oksynilu jest polipeptydem o ciężarze cząsteczkowym i praw odpodobnie produktem jednego genu.

12 Klon pbrx2 traw iono wyczerpująco enzymem EcoRI i wyizolowano fragm ent o długości około 19 kilopar zasad. D okonano insercji tego fragm entu do wektora pacyc184 trawionego uprzednio EcoRI (3,9 kilopar zasad), otrzymując plazm id pbrx5, który transform ow ano do E. coli w sposób opisany uprzednio. Znanymi technikam i wyizolowano plazm id i trawiono go enzymem B g lll, otrzym ując fragm ent o długości około 6,7 kilopar zasad, który pozostaw ał jako insert w wektorze pacyc184. W yizolowany plazmid pbrx7 trawiono następnie enzymami SA m al i B g1ll, uzyskując fragm ent o długości około 3,9 kilopar zasad. D okonano insercji tego fragm entu do trawionego Sm al-b am H I plazmidu pacyc177 (3,7 kilopar zasad) (Chang i Cohen, J. Bacteriolog. 1978, 134, ). Uzyskano plazm id z cechą oporności na penicylinę. Plazmidem tym transform ow ano E. coli w sposób opisany powyżej i selekcjonowano transform anty na zawierającej penicylinę pożywce selekcyjnej. Otrzym ano plazm id pbrx8, zawierający gen nitrylazy we fragm encie o długości 3,9 kilopar zasad. Plazmid pbrx8 traw iono częściowo enzymem PstI i dokonano insercji uzyskanych fragm entów do p U C 18 trawionego uprzednio PstI (Yanisch-Perron i wsp., Gene, 1985, 33, ). Uzyskane plazmidy klonowano w E. coli i prowadzono skrining na aktywność nitrylazy. Jeden klon posiadał plazm id pbrx9 o wielkości 5,3 kilopar zasad. Plazm id ten wyizolowano i następnie traw iono enzymami PstI i H incii, otrzym ując fragm ent o długości 1210 par zasad, posiadający w kierunku PstI do H incii w stosunkow o równych odstępach miejsca restrykcyjne dla Cla I, SaII, ScaI i SphI. Fragm ent PstI-H incii sekwencjonowano m etodą Sanger'a i wsp. (proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, 74, ). Otrzym ana sekwencja (z odpowiadającym i jej aminokwasami) przedstaw iona jest wzorem: ATG GAC ACC ACT TTC AAA GGA GCC GCT GTT CAG GCC GAA CCG GTA TGG ARG GAT GCC GCT Met Asp THr Thr Phe Lys Ala Ala Ala Val Gin Ala Glu Pro Val Trp Met Asp Ala Ala GCA ACA GCC GAT AAG ACC GTG ACG CTA GTA GCT AAA GCC GCA GCG GCT GGC GCG CAG CTC Ala Thr Ala Asp Lys Thr Val Thr Leu Val Ala Lys Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gin Leu GTC GCA TTT CCC GAA TTG TGG ATT CCG GGC TAC CCA GGA TTC ATG CTC ACG CAC AAC CAA Val Ala Phe Pro Glu Leu Trp Ile Pro Gly Tyr Pro Gly Phe Het Leu Thr His Asn Gin ACC GAA ACC CTA CCA TTC ATC ATT AAA TAC CGC AAG CAG GCA ATC GCC GCC GAT GGA CCA Thr Glu Thr Leu Pro Phe Ile Ile Lys Tyr Arg Lys Gin Ala Ile Ala Ala Asp Gly Pro GAA ATC GAA AAA ATT CGC TGC GCG GCT CAG GAG CAT AAC ATT GCG CTC TCC TTT GGG TAC Glu Ile Glu Lys Ile Arg Cys Ala Ala Gin Glu His Asn Ile Ala Leu Ser Phe Gly Tyr AGC GAA CGG GCT GGC CGT ACG CTC TAC ATG TCA CAA ATG CTT ATC GAT GCC GAT GGC ATC Ser Glu Arg Ala Gly Arg Thr Leu Tyr Met Ser Gin Met Leu Ile Asp Ala Asp Gly Ile ACC AAA ATT CGT CGT CGA AAG CTC AAA CCA ACC CGC TTT GAA CGA GAA CTC TTT GGC GAA Thr Lys Ile Arg Arg Arg Lys Leu Lys Pro Thr Arg Phe Glu Arg Glu Leu Phe Gly Glu GGT GAC GGA TCG GAC TTA CAG GTC GCC CAA ACT AGC GTT GGT CGG GTG GGT GCC CTC AAC Gly Asp Gly Ser Asp Leu Gin Val Ala Gin Thr Ser Val Gly Arg Val Gly Ala Leu Asn TGC GCG GAG AAT TTG CAG TCG CTA AAC AAG TTT GCG CTT GCT GCC GAG GGT GAA CAG ATA Cys Ala Glu Asn Leu Gin Ser Leu Asn Lys Phe Ala Leu Ala Ala Glu Gly Glu Gin Ile

13 CAT ATC TCC GCC TGG CCA TTC ACG CTT GGA AGC CCT GTG CTC GTC GGA GAC TCC ATC GGC His Ile Ser Ala Trp Pro Phe Thr Leu Gly Ser Pro Val Leu Val Gly Asp Ser Ile Gly GCC ATC AAC CAG GTC TAC GCG GCC GAG ACG GGG ACC TTC GTT CTC ATG TCG ACG CAG GTG Ala Ile Asn Gin Val Tyr Ala Ala Glu Thr Gly Thr Phe Val Leu Met Ser Thr Gin Val GTT GGA CCG ACC GGC ATC GCC GCC TTC GAG ATC GAA GAC AGG TAC ACC CCG AAT CAG TAT Val Gly Pro Thr Gly Ile Ala Ala Phe Glu Ile Glu Asp Arg Tyr Asn Pro Asn Gin Tyr CTT GGT GGT GGG TAC GCG CGG ATC TAC GGG CCT GAC ATG CAG TTG AAG AGC AAG TCG TTG Leu Gly Gly Gly Tyr Ala Arg Ile Tyr Gly Pro Asp Met Gin Leu Lys Ser Lys Ser Leu TCA CCG ACC GAA GAG GGC ATC GTC TAC GCC GAG ATC GAC CTG TCG ATG CTT GAG GCA GCA Ser Pro Thr Glu Glu Gly Ile Val Tyr Ala Glu Ile Asp Leu Ser Met Leu Glu Ala Ala AAG TAC TCG CTC GAT CCC ACG GGC CAC TAT TCG CGC CCT GAT GTG TTC AGC GTG TCG ATT Lys Tyr Ser Leu Asp Pro Thr Gly His Tyr Ser Arg Pro Asp Val Phe Ser Val Ser Ile AAC CGG CAA CGG CAG CCT GCG GTG TCA GAA GTT ATC GAC TCA AAC GGT GAC GAG GAC CCG Asn Arg Gin Arg Gin Pro Ala Val Ser Glu Val Ile Asp Ser Asn Gly Asp Glu Asp Pro AGA GCA GCA TGC GAG CCC GAC GAG GGG GAT CGT GAG GTC GTA ATC TCT ACG GCA ATA GGG Arg Ala Ala Cys Glu Pro Asp Glu Gly Asp Arg Glu Val Val Ile Ser Thr Ala Ile Gly GTT CTA CCC CGT TAT TGC GGA CAT TCC Val Leu Pro Arg Tyr Cys Gly His Ser Fragm ent Pstl-H incii, zasadniczo wolny od niekodujących regionów flankujących 5' i 3' m ożna poddać ligacji z linkerem EcoRI i trawić enzymem EcoRI, otrzym ując go w stanie gotowym do w prowadzenia do roślinnej kasety ekspresyjnej przez insercję w miejscu EcoRI w pcg N 451. Plazmid pcgn451 zawiera kasetę oktopinow ą zawierającą około 1,566 par zasad niekodującego regionu 5' połączonych poprzez linker EcoRI z końcem 3' genu i około 1,349 par zasad niekodującego DNA 3'. Zdefiniowane przez Barkera i wsp. (Plant M olecular Biology, 1983,2.335) liczby koordynacyjne pti wynoszą dla regionu 3' i do dla regionu 5'. Fragm ent 5' otrzym ano w sposób następujący: Mały podklonowy fragm ent zawierający koniec 5' regionu kodującego w postaci fragm entu Bam HI-EcoRI, klonowanio w pbr32, otrzym ując plazmid pcgn407. Fragm ent Bam HI-EcoRI posiada w regionie kodującym miejsce dla X m nl, podczas gdy pbr322 ma dwa takie miejsca. Plazmid pcgn407 traw iono X m nl, następnie nukleazą Bal31 i do uzyskanych fragm entów dołączano linkery EcoRI. Po trawieniu enzymami EcoRI i Bam HI fragmenty frakcjonow ano co do wielkości, frakcje te klonowano i sekwencjonowano. W jednym przypadku usunięto cały region kodujący i 10 par zasad niepodlegających translacji sekwencji 5' pozostawiając niepodlegający transkrypcji region 5', miejsce przyłączenia m RNA i 16 par zasad intaktnego, nie podlegającego translacji regionu 5' (w kierunku miejsca dla Bam HI). Ten mały fragm ent uzyskano przez frakcjonowanie w 7% żelu akryloamidowym i wymycie fragm entów o długości około 130 par zasad. Ten frakcjonowany pod względem wielkości D N A poddano ligacji z M13mp9; otrzym anych kilkanaście klonów sekwencjonowano i sekwencje porów nano ze znaną sekwencją genu syntetazy oktopiny. Element M l3 oznaczono jako pi4 i plazm idy te traw iono enzymami Bam HI i E cor I, otrzym ując mały fragm ent, który poddano ligacji z fragm entem X hoi-bam H I zawierającym w górę, sekwencje 5' z ptia6 (Garfinkel i Nester, J. Bacteriol., 1980,144, 732) oraz z fragmentem EcoRI-XhoI, zawierającym sekwencje 3'. W ytworzony fragm ent X hol klonowano do miejsca X hol w pochodnej puc8, oznaczonej jako pcgn426. Plazm id ten różni się od puc8 tym, że posiada pojedyncze miejsce EcoRI zablokowane polim erazą D N A I i stracone miejsca dla PstI i H indiii przez zanieczyszczenie endonukleazą restrykcyjną HincII w wyniku insercji linkera X hoi w miejscu dla HincII w plazmidzie puc8. Utworzony plazm id pcgn451 posiada pojedyncze miejsce dla EcoRI do insercji sekwencji kodującej białko między regionem niekodującym 5' (który zawiera par zasad nie podlegającej transkrypcji sekwencji 5' łącznie z prawym ramieniem T-DNA. Miejscem łączenia z mrna i 16 par zasad nie podlegającej translacji sekwencji 5') a regionem 3' (zawierającym 267 par zasad regionu kodującego, kodon stopu, 196 par zasad nie podlegającej translacji sekwencji DNA, miejsce poliadenylacji poli A i p a r zasad nie podlegającej transkrypcji sekwencji 3').