RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 201887 (21) Numer zgłoszenia: 349320 (22) Data zgłoszenia: 22.12.1999 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 22.12.1999, PCT/GB99/04377 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: 29.06.2000, WO00/37646 PCT Gazette nr 26/00 (13) B1 (51) Int.Cl. C12N 15/31 (2006.01) C07K 16/12 (2006.01) A61K 39/09 (2006.01) A61K 48/00 (2006.01) Opis patentowy przedrukowano ze względu na zauważone błędy (54) Peptyd, polinukleotyd kodujący ten peptyd, szczepionka, zastosowanie peptydu i polinukleotydu kodującego ten peptyd oraz przeciwciało (30) Pierwszeństwo: 22.12.1998,GB,9828359.1 22.12.1998,GB,9828353.4 22.12.1998,GB,9828352.6 22.12.1998,GB,9828355.9 22.12.1998,GB,9828354.2 22.12.1998,GB,9828349.2 22.12.1998,GB,9828345.0 22.12.1998,GB,9828350.3 22.12.1998,GB,9828357.5 (43) Zgłoszenie ogłoszono: 15.07.2002 BUP 15/02 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 29.05.2009 WUP 05/09 22.12.1998,GB,9828356.7 04.01.1999,GB,9900084.6 04.01.1999,GB,9900082.0 04.01.1999,GB,9900085.3 04.01.1999,GB,9900086.1 04.01.1999,GB,9900083.8 28.01.1999,GB,9901916.8 28.01.1999,GB,9901922.6 (73) Uprawniony z patentu: MICROSCIENCE LIMITED,Winnersh Triangle,GB (72) Twórca(y) wynalazku: Martin John Glenton Hughes, Winnersh Triangle, GB Joseph David Santangelo, Winnersh Triangle, GB Jonathan Douglas Lane, Winnersh Triangle, GB Paul Everest, Helensburgh, GB Robert Feldman, Winnersh Triangle, GB Joanne Christine Moore, Winnersh Triangle, GB Rebecca Kerry Wilson, London, GB Richard James Dobson, Winnersh Triangle, GB Gordon Dougan, London, GB (74) Pełnomocnik: Zofia Sulima, Sulima Grabowska Sierzputowska, Biuro Patentów i Znaków Towarowych Sp.j. (57) Wynalazek dotyczy peptydu obejmującego sekwencję aminokwasową zidentyfikowaną w niniejszym opisie jako SEQ ID NO. 2, bądź jego homologu lub fragmentu, który to homolog lub fragment jest zdolny do wywoływania przeciwciał z powinowactwem do peptydu, do zastosowania leczniczego. Wynalazek dotyczy również polinukleotydu kodującego ten peptyd do zastosowania leczniczego, szczepionki zawierającej ten peptyd, zastosowania tego peptydu i polinukleotydu do poszukiwania potencjalnych leków lub wykrywania zjadliwości oraz do wytwarzania leku do zastosowania w leczeniu lub profilaktyce stanu związanego z infekcją bakteryjną Streptococcus grupy B. Ponadto wynalazek dotyczy przeciwciała wywołanemu przeciw temu peptydowi. PL 201887 B1
2 PL 201 887 B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku są peptyd, polinukleotyd kodujący ten peptyd, szczepionka, zastosowanie peptydu i polinukleotydu kodującego ten peptyd oraz przeciwciało. Streptococcus grupy B (GBS), znany również jako Streptococcus agalactiae, jest czynnikiem przyczynowym różnych stanów chorobowych. W szczególności GBS powoduje: Wczesne infekcje u noworodków Infekcja ta zazwyczaj zaczyna się w macicy i powoduje ciężkie posocznice i zapalenie płuc u niemowląt, które, jeśli nie leczone, jest śmiertelne, a nawet przy leczeniu wiąże się z 10-20% umieralnością. Późne infekcje u noworodków Infekcja ta występuje w okresie krótko po narodzeniu, przed osiągnięciem wieku około 3 miesięcy. Powoduje ona posocznicę, która w 90% jako powikłanie daje zapalenie opon mózgowych. Występują również inne ogniskowe infekcje, obejmujące zapalenie szpiku, posocznicowe zapalenie stawów, ropnie i wewnętrzne zapalenie oka. Infekcje u dorosłych Pojawiają się one coraz powszechniej i najczęściej występują u kobiet, które właśnie urodziły dziecko, starszych i z osłabionym układem odpornościowym. Objawiają się posocznicą i infekcjami ogniskowymi obejmującymi zapalenie szpiku, posocznicowe zapalenie stawów, ropnie i wewnętrzne zapalenie oka. Infekcje układu moczowego GBS jest przyczyną infekcji układu moczowego i w okresie ciąży powoduje około 10% wszystkich infekcji. Infekcje weterynaryjne GBS powoduje przewlekłe zapalenie sutka u krów. To z kolei prowadzi do zmniejszonego wytwarzania mleka i dlatego też jest istotne z ekonomicznego punktu widzenia. Infekcje GBS można leczyć antybiotykami. Jednakże, preferowana jest immunizacja. Dlatego też, pożądane jest opracowanie antygenu, który mógłby być stosowany w skutecznej terapeutycznie szczepionce. Niniejszy wynalazek jest oparty na identyfikacji genu GBS, a także pokrewnych organizmów, których produkt może występować na zewnętrznej powierzchni organizmu i dlatego można go wykorzystywać jako cel immunoterapii. Wynalazek dotyczy peptydu obejmującego sekwencję aminokwasową zidentyfikowaną jako SEQ ID NO. 2, bądź jego homologu lub fragmentu, który to homolog lub fragment jest zdolny do wywoływania przeciwciał z powinowactwem do peptydu, do zastosowania leczniczego. W szczególności wynalazek dotyczy peptydu obejmującego sekwencję aminokwasową zidentyfikowaną jako SEQ ID NO. 2. Wynalazek dotyczy również polinukleotydu kodującego peptyd zdefiniowany powyżej do zastosowania leczniczego. Wynalazek dotyczy także szczepionki, która charakteryzuje się tym, że zawiera peptyd zdefiniowany powyżej. Wynalazek dotyczy ponadto zastosowania peptydu i polinukleotydu zdefiniowanych powyżej do poszukiwania potencjalnych leków lub wykrywania zjadliwości. Wynalazek dotyczy również zastosowania peptydu i polinukleotydu zdefiniowanych powyżej do wytwarzania leku do zastosowania w leczeniu lub profilaktyce stanu związanego z infekcją bakteryjną Streptococcus grupy B. W szczególności infekcję stanowi infekcja ogniskowa lub infekcja układu moczowego. Wynalazek dotyczy ponadto przeciwciała wywołanego przeciw peptydowi zdefiniowanemu powyżej. Peptyd według wynalazku, obejmujący sekwencję aminokwasową zidentyfikowaną jako SEQ ID NO. 2, bądź jego homolog lub fragment, są użyteczne do zastosowania leczniczego, np. po wyizolowaniu. Określenie funkcyjne fragmenty stosuje się w niniejszym opisie do zdefiniowania części genu lub peptydu, która zachowuje aktywność całego genu lub peptydu. Przykładowo funkcyjny fragment peptydu można stosować jako determinantę antygenową, użyteczną w szczepionce lub do wytwarzania przeciwciał.
PL 201 887 B1 3 Fragment genu można stosować do kodowania aktywnego peptydu. Alternatywnie fragment genu może być użyteczny w terapii genowej, specyficznie wpływając na gen typu dzikiego in vivo dla wywarcia wpływu terapeutycznego. Z powodu lokalizacji zewnątrzkomórkowej lub na powierzchni komórki, peptyd według wynalazku może być odpowiednim kandydatem do wytwarzania terapeutycznie skutecznej szczepionki przeciw GBS. Określenie terapeutycznie skuteczna w zamierzeniu obejmuje profilaktyczne działanie szczepionek. Przykładowo szczepionka może zawierać peptyd według wynalazku bądź środek do jego ekspresji do leczenia infekcji. Szczepionkę można podawać kobietom przed ciążą lub podczas ciąży w celu zabezpieczenia matki i noworodka przed infekcją GBS. Peptyd według wynalazku lub odpowiedni gen można stosować do poszukiwania potencjalnych leków przeciwdrobnoustrojowych lub wykrywania zjadliwości. Peptyd według wynalazku i polinukleotyd kodujący ten polipeptyd stosuje się do wytwarzania leku do zastosowania w leczeniu lub profilaktyce stanu związanego z infekcją bakteryjną Streptococcus grupy B, szczególnie infekcją ogniskową lub infekcją układu moczowego. Chociaż opisano białko do zastosowania w leczeniu pacjentów uważa się, że zakresem wynalazku objęte są również zastosowania innych wyżej opisanych produktów w weterynarii. W szczególności peptydy lub szczepionki można stosować w leczeniu przewlekłego zapalenia sutka, zwłaszcza u krów. Wynalazek opisano w odniesieniu do szczepu M732 paciorkowców grupy B. Jednakże wszystkie szczepy GBS oraz wiele innych szczepów bakteryjnych prawdopodobnie zawierają pokrewne peptydy lub białka, wykazujące homologię sekwencyjną do peptydu M732. Organizmy prawdopodobnie zawierające peptydy obejmują, ale nie ograniczają się do S. pneumoniae, S. pyogenes, S. suis, S. milleri, Streptococcus grupy C i grupy G oraz Enterococcus. Szczepionki przeciw każdemu z tych wymienionych mikroorganizmów można opracować w taki sam sposób jak opisano dla GBS. Korzystnie peptydy, które mogą być użyteczne do wytwarzania szczepionek, wykazują więcej niż 40% podobieństwa sekwencji do peptydu zidentyfikowanego w niniejszym opisie. Korzystniej peptydy wykazują więcej niż 60% podobieństwa sekwencji. Najkorzystniej, peptydy wykazują więcej niż 80% podobieństwa sekwencji, np. 95% podobieństwa. Po scharakteryzowaniu genu możliwe jest zastosowanie jego sekwencji do ustalenia homologii w innych mikroorganizmach. W ten sposób można określić, czy inne mikroorganizmy posiadają podobne produkty na zewnętrznej powierzchni. Homologie sekwencji można ustalać przez przeszukiwanie istniejących baz danych, np. EMBL lub Genbank. Peptydy według wynalazku lub białka można oczyszczać i izolować metodami znanymi w tej dziedzinie. W szczególności po zidentyfikowaniu sekwencji genu, możliwe będzie zastosowanie technik rekombinacji do ekspresji genu w odpowiednim gospodarzu. Można zidentyfikować aktywne fragmenty i homologi, i mogą one być użyteczne w terapii. Przykładowo peptydy lub ich aktywne fragmenty można stosować jako determinanty antygenowe w szczepionce do wywoływania odpowiedzi immunologicznej. Można je również stosować do wytwarzania przeciwciał, do biernej immunizacji lub w zastosowaniach diagnostycznych. Odpowiednie przeciwciała obejmują przeciwciała monoklonalne lub ich fragmenty, w tym jednołańcuchowe fragmenty fv. Metody wytwarzania przeciwciał będą oczywiste dla fachowców. Przygotowywanie szczepionek opartych na atenuowanych mikroorganizmach jest znane fachowcom. Kompozycje szczepionek można formułować z odpowiednimi nośnikami lub adiuwantami, np. ałunem, jeśli jest to konieczne lub pożądane i, stosować w leczeniu dla zapewnienia skutecznej immunizacji przeciw paciorkowcom grupy B lub innym pokrewnym mikroorganizmom. Wytwarzanie preparatów szczepionek będzie oczywiste dla fachowca. Ogólniej i, jak dobrze wiadomo fachowcom, do stosowania leczniczego można wybrać odpowiednią ilość składnika czynnego stosowanego zgodnie z wynalazkiem, tak jak i odpowiednie nośniki i zaróbki oraz drogi podawania. Czynniki te będzie się wybierać lub określać zgodnie ze znanymi kryteriami, takimi jak charakter/ciężkość stanu, który ma być leczony, rodzaj lub zdrowie osobnika itd. Produkty opisane powyżej zidentyfikowano w następujący sposób. Częściową bibliotekę genową chromosomalnego DNA GBS (szczep M732) przygotowano z użyciem wektorów plazmidowych pfw-phoa1, pfw-phoa2 i pfw-phoa3 (Podbielski, A. i inni, 1996, Gene 177: 137-147). Plazmidy te posiadają konstytutywny marker oporności na antybiotyk, adenylotransferazę spektynomycynową, który nadaje wysoki poziom oporności na spektynomycynę i dlatego selekcja jest łatwa. Ponadto wektory te zawierają skrócony (pozbawiony sekwencji liderowej)
4 PL 201 887 B1 gen phoa alkalicznej fosfatazy Escherichia coli. Trzy wektory różnią się tylko pod względem ramki odczytu, w której znajduje się pozbawiony sekwencji liderowej gen phoa, w porównaniu z leżącym wcześniej w tej samej ramce miejscem restrykcyjnym BamHI. Ponieważ ten skrócony gen phoa E. coli nie ma odpowiedniej sekwencji liderowej do wydzielania na zewnątrz tego enzymu przez błonę bakteryjną, podczas namnażania tych trzech plazmidów w mutancie phoa E. coli (np. szczep DH5α) nie występuje zewnątrzkomórkowa aktywność alkalicznej fosfatazy. Chromogenny substrat alkalicznej fosfatazy, XP (5-bromo-4-chloro-3-indolilofosforan) nie wnika do nietkniętych komórek bakteryjnych i dlatego można wykrywać tylko aktywność wydzielanej lub związanej z powierzchnią alkalicznej fosfatazy. Gdy obecna jest aktywność wydzielanej lub związanej z powierzchnią alkalicznej fosfatazy, chromogenny substrat XP jest rozszczepiany z utworzeniem niebieskiego barwnika i odpowiednie kolonie bakteryjne można zidentyfikować na podstawie ich niebieskiej barwy. Plazmidowy DNA całkowicie strawiono BamHI i zdefosforylowano z użyciem alkalicznej fosfatazy z krewetek. Genomowy DNA GBS częściowo strawiono Sau3AI, poddano frakcjonowaniu pod względem wielkości w gradiencie sacharozy i fragmenty o wielkości <1 kb zligowano z wytworzonymi wektorami pfw-phoa. Jako gospodarza do klonowania wybrano szczep DH5α E. coli, ponieważ jest on pozbawiony funkcyjnego genu phoa. Zrekombinowane plazmidy wyselekcjonowano na agarze Luria zawierającym 100 μg/ml spektynomycyny i 40 μg/ml chromogennego substratu XP. Transformanty E. coli zawierające plazmidy zawierające wstawkę DNA GBS, która komplementuje odpowiedzialną za wydzielanie sekwencję sygnałową pozbawionego sekwencji liderowej genu phoa zidentyfikowano na podstawie błękitnej barwy kolonii. W ten sposób przeszukano około 30000 różnych zrekombinowanych plazmidów zawierających wstawkę DNA GBS i do dalszych badań wybrano 83 zrekombinowane plazmidy, które komplementują pozbawiony sekwencji liderowej phoa. W doświadczeniach tych wyselekcjonowano kilka klonów, z których każdy zawierał plazmid zawierający gen (lub jego część), który komplementuje pozbawiony sekwencji liderowej phoa. Po zidentyfikowaniu genu w każdym klonie możliwe jest następnie otrzymanie sekwencji genu o pełnej długości, w opisany poniżej sposób. Wykorzystując zidentyfikowany i zsekwencjonowany fragment genu, zaprojektowano startery oligonukleotydowe do sekwencjonowania genomowego DNA. Startery te zaprojektowano jako sekwencje w kierunku na zewnątrz od otrzymanej sekwencji. Po odczytaniu, otrzymaną sekwencję testowano dla sprawdzenia, czy osiągnięto końce 5' i 3' genu. Stwierdzano to przez sprawdzanie wobec sekwencji homologicznych, dla końca 5' obecności kodonu start, AUG (lub dopuszczalnego równoważnika) poprzedzanego przez sekwencję konsensu Shine-Dalgarno, a dla końca 3' obecności kodonu terminacji translacji (kodonu Stop). Po zidentyfikowaniu genu o pełnej długości, zaprojektowano startery do amplifikacji produktu o pełnej długości. Stosowane startery obejmowały miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne (Ncol na końcu 5' i EcoO109I na końcu 3') dla umożliwienia późniejszego sklonowania produktu w stosowanym układzie ekspresyjnym Lactococcus. Z zastosowaniem tych starterów przeprowadzono PCR i produkty sklonowano w wektorze klonującym pcr 2.1 (In Vitrogen). Po potwierdzeniu obecności sklonowanego fragmentu, DNA wycinano z użyciem enzymów restrykcyjnych Ncol i EcoO109I. Wektor, do którego wstawiano ten fragment, był zmodyfikowaną wersją pnz8048 (Kuipers, O.P. i inni (1998) J.Biotech. 64: 15-21). Wektor ten, zawierający miejsce początku replikacji w Lactococcus, marker oporności na chloramfenikol, promotor indukowalny nizyną i miejsce wielokrotnego klonowania, zmieniono przez zastąpienie miejsca wielokrotnego klonowania znacznikami 10X His, flankowanymi na końcu 5' miejscem Ncol, przedzielającym środek miejsca wielokrotnego klonowana (obejmującego miejsce EcoO109I) oraz kodonem Stop (terminacji) na końcu 3' znaczników His. Gen będący przedmiotem zainteresowania wstawiano w taki sposób, aby znacznik 10X His znajdował się w pozycji 3' w stosunku do regionu kodującego. Po transformacji L. lactis (szczep NZ9000 - Kuipers, O. P. i inni (1998) supra) zrekombinowanym plazmidem, nastawiano płynną hodowlę o objętości 400 ml i translację białka indukowano przez dodanie do hodowli nizyny. Po inkubacji w ciągu 2 godzin, komórki zbierano i lizowano przez rozbijanie perełkami. Otrzymany lizat klarowano przez odwirowanie, a następnie przepuszczano przez kolumnę powinowactwa do metalu (Talon, Clonetech). Kolumnę przemywano ponownie przed elucją związanego białka imidazolem.
PL 201 887 B1 5 W celu zidentyfikowania frakcji zawierających wyznakowane His zrekombinowane białko, podwielokrotną próbkę z każdej frakcji analizowano metodą SDS-PAGE, poddawano blottingowi Western i testowano z użyciem przeciwciał przeciw His. Otrzymane zrekombinowane białko stosowano następnie do immunizacji królików rasy nowozelandzkiej białej, pobrawszy przed immunizacją surowice przedodpornościowe. Po podaniu dawki przypominającej króliki uśmiercono i zbierano surowice. Surowice te stosowano w blottingach Western, testach ELISA i zwierzęcych modelach ochrony. Przeprowadzono badania immunosorpcyjne z użyciem surowic otrzymanych w badaniach na zwierzętach. Streptococcus grupy B hodowano w 20 ml bulionu Todd Hewitta (THB) w ciągu 8 godzin, zbierano i ponownie zawieszano w 5 ml PBS. Próbki o objętości 50 μl stosowano do opłaszczania studzienek 96 studzienkowej płytki (Nunc Immuno-Sorb). Pozostawiano je w temperaturze 4 C na noc dla umożliwienia adsorbcji bakterii na płytce. Płytki dwukrotnie przemywano PBS, a następnie blokowano 3% BSA w PBS w ciągu 1 godziny w temperaturze 37 C. Płytki ponownie przemywano. Wykonano kolejne 10-krotne rozcieńczenia surowic w PBS i 50 μl tych rozcieńczeń dodawano do studzienek płytki, w dwóch powtórzeniach. Płytki przykrywano i inkubowano w ciągu 1 godziny w temperaturze 37 C. Płytki przemywano, a następnie do każdej studzienki dodawano 50 μl drugiego, skierowanego przeciw immunoglobulinom królika, przeciwciała skoniugowanego z alkaliczną fosfatazą, o stężeniu 1:5000. Po inkubacji w temperaturze 37 C w ciągu godziny, płytki ponownie przemywano. Do każdej studzienki dodawano 50 μl substratu (PNPP) i prowadzono reakcję w ciągu 30 minut przed odczytaniem absorbancji przy długości fali 405 nm. Przeprowadzono również badania ochrony zwierząt dla sprawdzenia skuteczności ochrony immunizowanych królików. GBS M732 namnażano w THB do osiągnięcia środkowej fazy wzrostu logarytmicznego - w ciągu około 5 godzin. Komórki zliczano w komorze do liczenia komórek i bakterie rozcieńczano do otrzymania stężenia 2 x 10 7 bakterii na ml surowicy przedodpornościowej lub testowanej. Surowicę tę (50 μl) wstrzykiwano drogą dootrzewnową myszy w wieku 0-1 dnia. Obserwowano przeżywalność myszy w ciągu 48 godzin. Wynalazek został zilustrowany poniższym przykładem. P r z y k ł a d Wyselekcjonowano klon zawierający plazmid oznaczony pho3-1. Plazmid ten zawierał gen (lub jego część), który komplementuje pozbawiony sekwencji liderowej phoa. Sekwencję nukleotydów genu i przewidywaną sekwencję aminokwasów genu przedstawiono jako SEQ ID NO. 1 i 2. Przeprowadzono porównania sekwencji aminokwasów pho3-1. Homologi produktu genu pho3-1 GBS można zidentyfikować w Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Bacillus subtilis (yutd) i Enterococcus faecalis. Homologi S. pyogenes, S. pneumoniae i E. faecalis zidentyfikowano na podstawie danych o sekwencji genomu i nie były dostępne żadne komentarze co do tożsamości genów lub produktów genów. W B. subtilis funkcja genu yutd jest nieznana. Należy jednakże zauważyć, że gen yutd jest położony w chromosomie B. subtilis w regionie zawierającym geny syntezy ściany komórkowej. Fakt, że ta sekwencja DNA komplementuje pozbawiony sekwencji liderowej gen phoa sugeruje, że produkt tego genu jest położony zewnątrzkomórkowo.
6 PL 201 887 B1
PL 201 887 B1 7
8 PL 201 887 B1
PL 201 887 B1 9 Zastrzeżenia patentowe 1. Peptyd obejmujący sekwencję aminokwasową zidentyfikowaną jako SEQ ID NO. 2, bądź jego homolog lub fragment, który to homolog lub fragment jest zdolny do wywoływania przeciwciał z powinowactwem do peptydu, do zastosowania leczniczego. 2. Peptyd według zastrz. 1, obejmujący sekwencję aminokwasową zidentyfikowaną jako SEQ ID NO. 2. 3. Polinukleotyd kodujący peptyd zdefiniowany w zastrz. 1 albo 2 do zastosowania leczniczego. 4. Szczepionka, znamienna tym, że zawiera peptyd zdefiniowany w zastrz. 1 albo 2. 5. Zastosowanie peptydu i polinukleotydu zdefiniowanych w zastrz. 1 albo 2, albo 3 do poszukiwania potencjalnych leków lub wykrywania zjadliwości. 6. Zastosowanie peptydu i polinukleotydu zdefiniowanych w zastrz. 1 albo 2, albo 3 do wytwarzania leku do zastosowania w leczeniu lub profilaktyce stanu związanego z infekcją bakteryjną Streptococcus grupy B. 7. Zastosowanie według zastrz. 6, gdzie infekcję stanowi infekcja ogniskowa. 8. Zastosowanie według zastrz. 6, gdzie infekcję stanowi infekcja układu moczowego. 9. Przeciwciało wywołane przeciw peptydowi zdefiniowanemu w zastrz. 1 albo 2.
10 PL 201 887 B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 2,00 zł.