PL B1. GDAŃSKI UNIWERSYTET MEDYCZNY, Gdańsk, PL BUP 13/14

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (51) Int.Cl. A61K 39/08 ( ) A61K 38/38 ( ) C07K 19/00 ( ) C07K 14/33 ( ) C12N 15/31 ( ) (54) Doustna kompozycja immunogenna przeciwko zakażeniom Clostridium difficile, zastosowanie przetrwalników Bacillus subtilis jako nośników dla antygenów oraz wyodrębnione rekombinowane geny kodujące białka płaszcza i antygen FliD (73) Uprawniony z patentu: GDAŃSKI UNIWERSYTET MEDYCZNY, Gdańsk, PL (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 13/14 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 10/16 (72) Twórca(y) wynalazku: KRZYSZTOF HINC, Gdańsk, PL WOJCIECH POTOCKI, Sopot, PL ALESSANDRO NEGRI, Salara, IT ADAM IWANICKI, Gdynia, PL MICHAŁ OBUCHOWSKI, Gdańsk, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Małgorzata Matyka

2 2 PL B1 Opis wynalazku Dziedzina wynalazku Przedmiotem wynalazku jest doustna kompozycja immunogenna przeciwko zakażeniom Clostridium difficile, zastosowanie przetrwalników Bacillus subtilis jako nośników dla antygenów, które są prezentowane na powierzchni przetrwalników do wytwarzania doustnej kompozycji immunogennej zawierającej fuzje białek płaszcza z antygenem FliD. Podstawy wynalazku Clostridium difficile to gatunek Gram dodatnich beztlenowych przetrwalnikujących laseczek wykazujących zdolność ruchu. Bakterie te występują powszechnie w środowisku, a także stanowią składnik flory fizjologicznej przewodu pokarmowego niektórych gatunków zwierząt nie dotyczy to jednak człowieka. Clostridum difficile stanowią współcześnie najgroźniejszy na świecie czynnik etiologiczny biegunki związanej z antybiotykoterapią (C. difficile-associated diarrhea, CDAD) oraz rzekomobłoniastego zapalenia okrężnicy (PMC pseudomembranous colitis). Epidemiczne zachorowania na biegunki wywołane przez te bakterie stwierdza się na oddziałach onkologicznych, oddziałach dla przewlekle chorych i oddziałach dla pacjentów po zabiegach operacyjnych, głównie po operacjach jamy brzusznej, C. difficile może być odpowiedzialny również za biegunki nabywane przez hospitalizowane dzieci (w tym niemowlęta i noworodki). Infekcje C. difficile zaobserwowano u pacjentów z cukrzycą, przewlekłą niewydolnością oddechową, udarem mózgu. Szczególnie podatni na to zakażenie są pacjenci pozostający na długoterminowym leczeniu immunosupresyjnym, z chorobą wrzodową (a zwłaszcza stosujący w leczeniu preparaty z grupy inhibitorów pompy protonowej), przyjmujący środki przeczyszczające (szczególnie w formie czopków), wreszcie osoby z pierwotnymi lub wtórnymi zespołami upośledzenia odporności i alkoholicy. Szereg specjalistów uważa także, że osoby w przedziale wieku lat są szczególnie narażone na zakażenie C. difficile, co najprawdopodobniej związane jest z uogólnionym upośledzeniem funkcji organizmu i spadkiem odporności. Odrębną grupę stanowią chorzy hospitalizowani na oddziałach chirurgicznych. Szczególnie narażeni są na zakażenia C. difficile pacjenci poddani zabiegom endoskopowym, na przykład kolonoskopiom czy gastroskopiom oraz pacjenci otrzymujący żywienie pozajelitowe przez klasyczne cewniki gastroskopowe. Ogromne znaczenie przy powstawaniu choroby ma też zdolność C. difficile do wytwarzania przetrwalników. Na przetrwalniki nie działają antybiotyki, wykazują one także oporność na szereg środków dezynfekcyjnych. Mogą być one odpowiedzialne za nawroty choroby, których częstość w niektórych ośrodkach oceniana jest nawet na 20%. Szczepy szpitalne C. difficile i dużą łatwością wytwarzają przetrwalniki, które mogą utrzymywać się w środowisku szpitalnym przez długi czas. Zatem obok rzeczywistych nawrotów mogą być obserwowane przypadki zakażeń egzogennych, szczepami ze środowiska szpitalnego (odmienne feno- i genotypy). Następujące możliwe mechanizmy szerzenia się C. difficile w szpitalach to: przez kontakt z pacjentem skolonizowanym, przez środowisko szpitalne (zanieczyszczone przedmioty i stosowany sprzęt) i przez personel medyczny. Częste są przypadki wyhodowania C. difficile z wymazów pobranych z podłogi, z powierzchni krzeseł, łóżek, dzwonków, parapetów, ścierek, koszy na śmieci, łazienek, ubikacji itd. Szczepy C. difficile wyhodowano również z wymazów pobranych ze sprzętu szpitalnego; aparatów do dializ, termometrów doodbytniczych, basenów itp. Leczenie rzekomobłoniastego zapalenia okrężnicy obejmuje przerwanie stosowania antybiotyku, który przyczynił się do rozwinięcia objawów choroby, pozajelitowe uzupełnianie płynów i elektrolitów oraz szybkie wprowadzenie ukierunkowanej antybiotykoterapii. Z tego względu, że laseczki C. difficile oporne są na znaczną część stosowanych antybiotyków stosuje się wankomycynę przez 7 14 dni, a następnie metronidazol przez kolejne 14 dni. Jako leczenie uzupełniające stosuje się doustnie duże dawki probiotyków i cholestyraminę mającą na celu inaktywowanie i związanie toksyn C. difficite. Niekiedy niezbędne jest całkowite wyłączenie podawania pokarmu i leków drogą doustną oraz zastosowanie żywienia i leczenia drogą dożylną obwodową lub centralną. W Polsce jak i na świecie, w związku z coraz większą dostępnością i częstszym stosowaniem antybiotyków szerokowidmowych, obserwuje się narastającą częstość występowania rzekomobłoniastego zapalenia jelita grubego. Ze względu na oporność C. difficile na antybiotyki oraz coraz częstsze pojawianie się szczepów opornych również na metronidazol i wankomycynę istnieje nagląca potrzeba stworzenia swoistego leku przeciwko zakażeniom tej bakterii. Doustna szczepionka antybakteryjna wydaje się idealnym

3 PL B1 3 sposobem na zabezpieczenie organizmu przed patogenem, immunizacja z zastosowaniem specyficznych antygenów bakteryjnych może pozwolić na efektywną odpowiedź immunologiczną i eliminację bakterii, a obok efektu terapeutycznego może mieć również znaczenie ochronne. Pozwoliło to na stworzenie doustnej kompozycji immunogennej o działaniu terapeutycznym i profilaktycznym, zapobiegającym kolonizacji jelit przez patogen. Obecnie niedostępna jest żadna komercyjna szczepionka przeciwko zakażeniom C. difficile. Istota wynalazku Wcześniejsze badania wykazały, ze można zastosować przetrwalniki Bacillus subtilis jako swego rodzaju nośniki dla antygenów. W tym celu fragment genu kodującego białko powierzchniowe FliD białko wieńczące koniec wici bakteryjnej (stanowiące antygen) zostało prezentowane na powierzchni przetrwalników jako białka fuzyjne z zewnętrznymi strukturami budującymi przetrwalnik. Doustne podanie szczepionki umożliwi immunizację, bezpośrednio w miejscu narażonym na działanie C. difficile (jelita) i ma kluczowe znaczenie dla jej efektywnego działania. Wybrany antygen (FliD) jest białkiem powierzchniowym więc jego zastosowanie w doustnej szczepionce daje dodatkowe korzyści. Dzięki niemu formy wegetatywne C. difficile są rozpoznawane już na etapie kolonizacji czyli przylegania do błony śluzowej jelita, co pozwoli na wczesną reakcję układu immunologicznego na obecność patogenu. Zastosowanie przetrwalników jako nośników szczepionek stanowi nowe podejście do immunizacji ludzi i może znaleźć istotne zastosowanie zwłaszcza w przypadku immunizacji prowadzącej do ochrony przed infekcjami w obrębie przewodu pokarmowego. Dlatego doustna szczepionka antybakteryjna wydaje się być idealnym sposobem na zabezpieczenie organizmu przed zakażeniami C. difficile. W tym przypadku doustne dostarczenie szczepionki niesie za sobą wiele zalet, w stosunku do tradycyjnej metody podawania szczepionek; (i) możliwość uzyskania odporności śluzówkowej oraz systemowej, (ii) wzrost czasu pół-trwania podanego antygenu, (iii) eliminacja igieł, a co za tym idzie czynników infekcyjnych przenoszonych przez krew, (iv) wygodny sposób użycia niewymagający obecności specjalnie przeszkolonego personelu medycznego w celu aplikacji szczepionki. Niewątpliwą zaletą przetrwalników B. subtilis jako nośnika szczepionki jest ich działanie jako adiuwantu co uwidacznia się jako wzmaganie odpowiedzi immunologicznej typu komórkowego (Th1). Za podjęciem prób wykorzystania przetrwalników B. subtilis jako nośników antygenów przemawia również wiele korzyści: i) łatwość ich otrzymania: istnieje wiele szczepów laboratoryjnych czy też naturalnych izolatów z rożnych środowisk, włączając w to układ pokarmowy człowieka; ii) łatwość produkcji B. subtilis jest bakterią o niewielkich wymaganiach troficznych, co wiąże się z stosunkowo niskim kosztem wytwarzania przetrwalników w ilościach przemysłowych; iii) wszechobecność przetrwalników w środowisku naturalnym, w tym i pożywieniu człowieka, wskazuje na ich niewielką immunogenność, co zapobiegnie powstawaniu procesów alergicznych podczas podawania przetrwalników prezentujących antygeny; iv) wysoka oporność przetrwalników na różnorodne warunki środowiska pozwoli na ich łatwe przechowywanie, bez potrzeby mrożenia czy przechowywania w chłodni. Trwałość przetrwalników mierzona nawet w milionach lat zapewni długotrwałą przydatność wytworzonej szczepionki do podania; v) możliwość mieszania przetrwalników prezentujących różne antygeny umożliwi wytwarzanie wielu kombinacji ilościowych oraz jakościowych szczepionek. Co więcej umożliwi to natychmiastowe przygotowanie żądanej kombinacji epitopów antygenowych poprzez mieszanie w odpowiednich proporcjach rekombinowanych przetrwalników w warunkach standardowego ambulatorium; vi) podawanie szczepionki składającej się z przetrwalników może przynieść dodatkowe pozytywne efekty zdrowotne, gdyż przetrwalniki B. subtilis są stosowane jako probiotyki, a ich modyfikacja w kierunku prezentowania antygenów nie zmniejsza ich dobroczynnego działania na układ pokarmowy immunizowanych zwierząt czy też człowieka. Dodatkowe zalety doustnej kompozycji według wynalazku: możliwość szczepienia dużych populacji a tym samym wyeliminowania lub znaczącego ograniczenia występowania zakażeń C. difficile, łatwość podania szczepionki w formie zawiesiny przyjmowanej doustnie, możliwość przechowywania szczepionki/leku w warunkach normalnych bez konieczności utrzymywania szczególnych warunków, ograniczenie stosowania terapii antybiotykowej, obniżenie kosztów terapii.

4 4 PL B1 Przedmiotem wynalazku jest doustna kompozycja immunogenna przeciwko zakażeniom Clostridium difficile, gdzie zawiera fragment genu powierzchniowego białka FliD o sekwencji przedstawionej na Fig. 1, połączony z białkami płaszcza CotB, CotC, CotG, CotZ, z łącznikiem lub bez niego. Doustna kompozycja, gdzie białko FliD jest białkiem fuzyjnym. Doustna kompozycja, gdzie łącznikiem jest peptyd o sekwencji przedstawionej na Fig. 2. Doustna kompozycja, gdzie białko fuzyjne składa się z fragmentu białka FliD, które wieńczy koniec wici bakteryjnej. Doustna kompozycja, która ponadto zawiera nośnik w postaci przetrwalnika bakteryjnego Bacillus subtilis. Doustna kompozycja, gdzie postacią farmaceutyczną jest szczepionka do podawania drogą pokarmową pacjentowi. Doustna kompozycja, która dodatkowo zawiera adiuwant. Doustna kompozycja, gdzie adiuwant stanowią przetrwalniki Bacillus subtilis. Zastosowanie przetrwalników Bacillus subtilis jako nośników dla antygenów, które są prezentowane na powierzchni przetrwalników, do wytwarzania doustnej kompozycji immunogennej określonej powyżej, do leczenia zakażeń Clostridium difficile. Zastosowanie, gdzie antygenem jest fragment białka FliD o sekwencji przedstawionej na Fig. 1. Wyodrębnione rekombinowane geny kodujące białko płaszcza i antygen FliD o sekwencji nukleotydowej i aminokwasowej przedstawionej na Fig. 3, Fig. 4, Fig. 5, Fig. 6, Fig. 7. Wyodrębnione rekombinowane geny, gdzie geny te są wyodrębnione z Clostridium difficile 630 oraz Bacillus subtilis 168. Wyodrębnione rekombinowane, które służą do wytwarzania doustnej kompozycji immunogennej określonej powyżej. Opis rysunków: Fig. 1 przedstawia sekwencję białka FliD; Fig. 2 przedstawia sekwencję peptydu, który łączy fragment białka FliD z białkami płaszcza CotB, CotC, CotG, CotZ; Fig. 3 Fig. 7 przedstawiają rekombinowane geny kodujące białka płaszcza i antygen FliD (CotB-FliD; CotC-FliD; CotG-FliD; CotZ-FliD; CotB-linker-FliD); Fig. 8 przedstawia mapy wektorów integracyjnych: pan01 (A), pan02 (B), pan03 (C), pan04 (D), pan05 (F). Ekspresję rekombinowanych genów zapewniają fizjologiczne promotory genów kolejno cotb, cotc, cotg, cotz oraz CotB; Fig. 9 przedstawia Western Blotting z użyciem ekstraktów białkowych uzyskanych z płaszcza przetrwalników. Naniesione próbki: (szczep typu dzikiego) 2- BAN01 (amye:: cotb-flid), 3- RH101 (cotc:: spc) 4- BAN06 ( cotc amye:: cotc-flid); Fig. 10 przedstawia Western Blotting z użyciem ekstraktów białkowych uzyskanych z płaszcza przetrwalników. Naniesione próbki: (szczep typu dzikiego), 2- BAN02 (amye:: cotc-flid), 3- BAN03 (amye:: cotg-flid) 4- BAN01 (amye:: cotb-flid), 5- BAN04 (amye:: cotz-flid), 6- BAN05 (amye:: cotb-linker-flid); Fig. 11 przedstawia analizę dot-blotting. Odpowiednie rozcieńczenia białek płaszcza wyizolowanych z przetrwalników zostały bezpośrednio nanoszone na membranę. Rekombinowane białka wykrywano za pomocą przeciwciał I rzędowych anty-flid i II rzędowych anty-mysz-ap. Wizualizacje sygnału dokonano za pomocą metody kolorymetrycznej. (A) 1- oczyszczone FliD, 2-168, 3- BAN03 (CotG-FliD), 4- BAN01 (CotB-FliD) 5- BAN04(CotZ-FliD, 6- BAN05 (CotB-linker-FliD), 7- BAN02 (CotC- -FliD); Fig. 12 przedstawia immunofluorescencję: oczyszczone przetrwalniki Bacillus subtilis, Panel A światło widzialne, B immunofluorescencja (rekombinowane białka wykrywano przy użyciu przeciwciał l-rzędowych anty-flid, i II rzędowych anty-mysz-cy3. Wynalazek ilustruje następujący przykład wykonania, nie stanowiący jego ograniczenia. P r z y k ł a d Przygotowanie fuzji fragmentu białka FliD z zewnętrznymi strukturami budującymi przetrwalnik. W przygotowaniu białek fuzyjnych posłużono się wektorami pkh16, pkh29, pkh30, pkh108. Wektory te posiadają powielone metodą PCR geny kodujące białka CotB, CotC, CotG i CotZ wraz z rejonami promotorowymi. Dodatkowo podczas reakcji PCR zostały wprowadzone miejsca restrykcyjne, które ułatwiają zarówno proces klonowania do wektorów jak i tworzenia białek fuzyjnych. Do tworzenia białek fuzyjnych został wybrany fragment genu flid C. difficile.

5 PL B1 5 Wybrany antygen posiadają następującą sekwencję aminokwasową: FliD N-TKSAVVYGKNLEADVTDDQGRVTHISKEQNSFKIDNIDYNVNSKGSAKLVSVTDTEEATKNMK- AF VDDYNALMDKVYGLVTTKKSK- C Wybrany fragment genu flid powielono metodą PCR przy użyciu primerów: fd-f 5'- GCT GGA TCC ACT AAA TCT GCA GTA GTA TAT G-3' i fd-r 5'- GAG GGA GCT CTT ATT TTG ATT TTT TAG TAG TAA C 3'. Podczas reakcji PCR zostały wprowadzone miejsca restrykcyjne (BamHI i Sacl, w sekwencji primerów) które ułatwiły fuzje wszystkich wybranych genów kodujących białka płaszcza cotb, cotc, cotg i cotz z fragmentem genu flid w prawidłowej ramie odczytu (Fig. 3 Fig. 6). Uzyskane plazmidy niosące geny fuzyjne nazwano kolejno pan01, pan02, pan03, pan04 (Fig. 8). Dodatkowo skonstruowano fuzję białka CotB z antygenem FliD połączonych peptydowym łącznikiem o sekwencji -GGGEAAAKGGG-. Aby tego dokonać jeden ze starterów służących do amplifikacji genu cotb zawierał sekwencje DNA kodującą w/w łącznik. Zmodyfikowany gen cotb (zawierający na końcu 3 sekwencję kodującą łącznik) wraz z rejonem promotorowym został klonowany do plazmidu pdl. Następnie amplifikowano fragment genu flid i klonowano w ramie odczytu z genem cotb-linker uzyskując fuzję translacyjną CotB-GGGEAAAKGGG- FliD (Fig. 7). Otrzymany plazmid nazwano pan05 (Fig. 8). Następnie uzyskane geny fuzyjne zostały zsekwencjonowane, aby wykluczyć możliwość zajścia niepożądanych mutacji. Kolejnym krokiem była transformacja komórek B. subtilis szczepu 168 (trpc2) zweryfikowanymi plazmidami i w konsekwencji po zajściu podwójnego crossing-over rekombinowane geny zostały wbudowane do locus amye. Uzyskane szczepy nazwano kolejno: BAN01 (amye:: cotb-flid), BAN02 (amye:: cotc-flid), BAN03 (amye:: cotg-flid), BAN04 (amye:: cotz-flid), BAN05 (amye:: cotb-linker-flid). Dodatkowo wykonano transformację chromosomem bakteryjnym wyizolowanym ze szczepu BAN02 komórek B. subtilis szczepu RH101 ( cotc), gdzie po zajściu podwójnego crossing-over fuzyjny gen (cotc-flid) został wbudowany w locus amye. Uzyskany szczep nazwano BAN06 ( cotc amye:: cotc-flid). Oczyszczone przetrwalniki wytworzone przez w/w szczepy zostały przeanalizowane w kierunku obecności rekombinowanych białek w płaszczu przy użyciu mysich przeciwciał anty-flid, anty-cotc oraz anty-cotb otrzymanych w naszym laboratorium. W badaniach zastosowano metodę western- -blotting, polegającą na wykrywaniu poszukiwanego białka związanego z błoną za pomocą przeciwciał związanych z enzymem, który przeprowadza reakcję barwną pozwalającą na jego zlokalizowanie (Fig. 9, Fig. 10). Ilość rekombinowanych białek zlokalizowanych w płaszczu zewnętrznym przetrwalników oszacowano za pomocą techniki dot-blotting, w której białka są bezpośrednio nanoszone na membranę, a następnie wykrywane za pomocą przeciwciał. Badania wykazały, że w zależności od fuzji białkowej ilość rekombinowanych białek izolowanych z płaszcza przetrwalników waha się w granicach od 6,9 x 10 2 cząsteczek/przetrwalnik CotB-FliD do 4,1 x 10 3 cząsteczek/przetrwalnik CotG-FliD (Fig. 11, Tab. 1). T a b e l a 1. Ilość antygenów prezentowanych na powierzchni przetrwalników B. subtilis. Szczep Ilość rekombinowanych białek/przetrwalnik BAN01 (CotB-FliD) 6,9 x 10 2 BAN02 (CotC-FliD) 3,4 x 10 3 BAN03 (CotG-FliD) 4,1 x 10 3 BAN04 (CotZ-FliD) 2,1 x 10 3 BAN05 (CotB-linker-FliD) 1,1 x 10 3 Przydatność przetrwalników niosących fuzyjne białka do doustnej immunizacji jest połączona z położeniem białka fuzyjnego w obrębie struktur przetrwalnika. Przyjmuje się, że białka fuzyjne obecne na powierzchni przetrwalnika mają większy potencjał pobudzania układu odpornościowego. Obecność rekombinowanych białek na powierzchni przetrwalników została potwierdzona metodą immunofluorescencji. Wszystkie fuzje znajdują się na powierzchni rekombinowanych (Fig. 12).

6 6 PL B1 Zastrzeżenia patentowe 1. Doustna kompozycja immunogenna przeciwko zakażeniom Clostridium difficile, znamienna tym, że zawiera fragment genu powierzchniowego białka FliD o sekwencji przedstawionej na Fig. 1, połączony z białkami płaszcza CotB, CotC, CotG, CotZ, z łącznikiem lub bez niego. 2. Doustna kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że białko FliD jest białkiem fuzyjnym. 3. Doustna kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że łącznikiem jest peptyd o sekwencji przedstawionej na Fig Doustna kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że białko fuzyjne składa się z fragmentu białka FliD, które wieńczy koniec wici bakteryjnej. 5. Doustna kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że ponadto zawiera nośnik w postaci przetrwalnika bakteryjnego Bacillus subtilis. 6. Doustna kompozycja według zastrz. 1 5, znamienna tym, że postacią farmaceutyczną jest szczepionka do podawania drogą pokarmową pacjentowi. 7. Doustna kompozycja według zastrz. 1 6, znamienna tym, że dodatkowo zawiera adiuwant. 8. Doustna kompozycja według zastrz. 1 7, znamienna tym, że adiuwant stanowią przetrwalniki Bacillus subtilis. 9. Zastosowanie przetrwalników Bacillus subtilis jako nośników dla antygenów, które są prezentowane na powierzchni przetrwalników, do wytwarzania doustnej kompozycji immunogennej określonej w zastrzeżeniu 1, do leczenia zakażeń Clostridium difficile. 10. Zastosowanie według zastrz. 9, znamienne tym, że antygenem jest fragment białka FliD o sekwencji przedstawionej na Fig Wyodrębnione rekombinowane geny kodujące białko płaszcza i antygen FliD o sekwencji nukleotydowej i aminokwasowej przedstawionej na Fig. 3, Fig. 4, Fig. 5, Fig. 6, Fig Wyodrębnione rekombinowane geny według zastrz. 11, znamienne tym, że geny te są wyodrębnione z Clostridium difficile 630 oraz Bacillus subtilis Wyodrębnione rekombinowane geny według zastrz , znamienne tym, że służą do wytwarzania doustnej kompozycji immunogennej określonej w zastrzeżeniu 1. Rysunki

7 PL B1 7

8 8 PL B1 cd. Fig. 3

9 PL B1 9

10 10 PL B1

11 PL B1 11 cd. Fig. 5

12 12 PL B1

13 PL B1 13 cd. Fig. 6

14 14 PL B1

15 PL B1 15 cd. Fig. 7

16 16 PL B1

17 PL B1 17 cd. Fig. 8