Terapia genowa Autor: dr Artur Cieślewicz Zakład Farmakologii Klinicznej artcies@ump.edu.pl
Definicja Terapia genowa: Procedura medyczna, podczas której dzika wersja genu jest wprowadzana do komórek pacjenta w celu wyleczenia choroby wywołanej przez zmutowany gen, kodującego niefunkcjonalny produkt Rodzaje terapii genowej 1. Terapia in vivo a. Działanie bezpośrednio w organizmie pacjenta b. Niezbędne metody precyzyjnego transportu terapeutycznych genów do określonych komórek 2. Terapia ex vivo a. Pobieramy populację komórek z organizmu pacjenta b. Transformacja w warunkach laboratoryjnych c. Zmodyfikowane komórki powracają do organizmu pacjenta Wektory Niewielkie cząsteczki DNA, umożliwiające wprowadzenie obcego DNA do komórki Plazmidy, genomy wirusowe, sztuczne chromosomy Wektory adenowirusowe Oparte na ludzkim adenowirusie Terapeutyczny gen wstawiany na miejsce genów wirusowych (zwykle E1-E3) Tak przygotowany DNA pakowany do kapsydu Rodzaje wektorów adenowirusowych Zalety Wady 1 generacja: delecje genów E1 i E3 (ograniczona replikacja) 2 generacja: delecja genu E4 (zredukowana odpowiedź immunologiczna) 3 generacja: usunięte geny wirusowe; silnie zredukowana odpowiedź immunologiczna Wysoka efektywność transdukcji Pojemność do 8 kbp Infekuje komórki dzielące się i zróżnicowane Wektor wyboru w terapii genowej niektórych nowotworów Ekspresja ograniczona w czasie Wczesne generacje: mogło dojść do ekspresji wirusowych białek Skuteczność in vivo utrudniona przez odpowiedź immunologiczną Pierwszy rekombinowany adenowirus dopuszczony do terapeutycznego stosowania: Onyx-15 (Oncorine): Niemożność unieczynnienia białka p53 => namnażanie tylko w komórkach nowotworowych Oncorine + 5FU + cisplatyna => lepsza odpowiedź na leczenie, mniejsze prawdopodobieństwo progresji w porównaniu do samej chemioterapii
Wektory retrowirusowe Bazują na genomie retrowirusa (RNA jako materiał genetyczny) Terapeutyczny gen wstawiany na miejsce genów gag, pol, env Zalety Wady Wysoka efektywność transdukcji Pojemność do 8 kbp Integracja z genomem gospodarza => stała ekspresja genu Brak ekspresji białek wirusowych Infekowanie tylko komórek dzielących się Losowa integracja z genomem Skuteczność in vivo utrudniona przez odpowiedź immunologiczną Wektory niewirusowe Liposomy Fosfolipidowe pęcherzyki transportujące DNA Sztuczne ludzkie chromosomy (HAC) Tworzone na bazie chromosomów Zawierają: centromer, miejsca inicjacji replikacji, telomery Wiążą się z histonami; replikują, segregują poprawnie podczas kariokinezy Brak ograniczeń co do długości genu jaki można umieścić w chromosomie Kontrola ekspresji: elementy regulatorowe Przykłady terapii genowej Zespół SCID Pierwszy sukces terapii genowej (1990r.) Przyczyna genetyczna: mutacja w genie ADA, prowadząca do niedoboru deaminazy adenozyny terapia ex vivo: pobrane limfocyty modyfikowano dzikim genem ADA Modyfikacja (2002r.): transfer genu ADA do komórek hematopoetycznych + kondycjonowanie niemieloablacyjne Mukowiscydoza Przyczyna: mutacje w genie CFTR (Cystic Fibrosis Conductance Transmembrane Regulator) brak funkcjonalnych kanałów jonowych w przypadku homozygot recesywnych Badania na kulturach tkankowych, wyprowadzonych z komórek płuc i trzustki pacjentów chorych na mukowiscydozę: znaczące obniżenie zawartości Cl - po wprowadzeniu dzikiego allela CFTR Badanie kliniczne: terapia in vivo o 140 pacjentów przyjmowało inhalację (1/miesiąc) placebo lub wektora liposomowego z genem CFTR
o Znacząco wyższa nasilona pierwszosekundowa objętość wydechowa (FEV 1) u pacjentów poddanych terapii genowej Lepszy wektor dla mukowsicydozy: F-HN SIV o lentiwirus + białka kapsydu F i HN wirusa Sendai Wrodzona ślepota Lebera Stopniowa utrata wzroku (fotoreceptory przestają reagować na światło) powodowana mutacją w genie RPE65 (enzym pełniący kluczową rolę w cyklu przemian retinolu) Terapia genowa: psy, które odziedziczyły zmutowane allele RPE65 o Wstrzyknięcie wektora z dzikim genem RPE65 bezpośrednio do siatkówki psów ślepych od urodzenia o Po terapii psy zaczęły be trudności poruszać się po otoczeniu (omijanie przeszkód) o odzyskanie wzroku potwierdzone rezonansem magnetycznym mózgu Regeneracja kości i przyzębia BMP Odbudowa kości wokół implantów badanie na szczurach: Do dużych ubytków kostnych w szczęce dostarczono wektory adenowirusowe z BMP7 przy użyciu macierzy kolagenowej BMP7 bierze udział w regulacji wzrostu i różnicowania komórek kości, rozwojy zębów, procesach naprawczych przyzębia Zwierzęta, które poddano terapii genowej produkowały 50% więcej kości wokół implantów od zwierząt poddanych standardowemu leczeniu Sialoproteina (BSP) BSP pobudza różnicowanie komórek podczas naprawy i regeneracji kości Dostarczenie in vivo genu BSP do ubytku kostnego pobudza regenerację kości zębodołu Czynniki pobudzające angiogenezę VEGF: Vascular Endothelial Growth Factor bfgf: basic Fibroblast Growth Factor EMD: Enamel Matrix Derived protein RUNX2: Runt-related transcription factor 2 Pobudzenie różnicowania komórek zrębowych szpiku kostnego w komórki kości adenowirus + RUNX2: komórki zrębowe uformowały więcej kości w porównaniu do kontroli; również lepsza mineralizacja PDGF: Platelet Derived Growth Factor (płytkopochodny czynnik wzrostu) Zastosowanie genu PDGF w większym stopniu pobudza proliferację komórek ozębnej i cementoblastów niż ciągłe podawanie czynnika PDGF TGF-β (Transforming growth factor β; transformujący czynnik wzrostu beta) Pozytywny efekt na regenerację kości wokół implantu Transfer genów do gruczołów ślinowych Kserostomia Uszkodzenie gruczołów ślinowych (radioterapia, zespół Sjögrena, niektóre leki) AQ1 akwaporyna 1; kanał dla cząsteczek wody => pozytywna odpowiedź pacjentów
Wykorzystanie funkcji zewnątrzwydzielniczej Kandydoza: infekcja oportunistyczna u pacjentów z AIDS adenowirus z genem histatyny 3 => 90% efekt przeciwgrzybiczny Próby wykorzystania czynności wewnątrzwydzielniczej Wektor adenowirusowy + ludzki hormon wzrostu (hgh) Szczepionki DNA Podanie do gruczołów ślinowych plazmidu zawierającego gen kodujący białko fimbrii Porphyromonas gingivalis Plazmid pcia-p z genem PAC Streptococcus mutans Bóle twarzy Bóle zlokalizowane w twardych i miękkich tkankach twarzy, głowy i szyi; różne przyczyny Cel terapii genowej: ciągła produkcja i wydzielanie antynocyceptywnych białek w pobliżu rogów grzbietowych (dorsal horn) rdzenia kręgowego Wektor AAV z genem IL-10 wirus opryszczki z genem preproenkefaliny Nowotwory Rak jamy ustnej, zatok przynosowych, krtani, gardła, rak skóry twarzy i szyi Terapia korygująca: wyciszenie ekspresji onkogenów, transfer genów supresorowych (np. Gendicine) Cytoredukcja: zniszczenie komórek nowotworowych: wirusy onkolityczne, wprowadzanie genów samobójczych Immunomodulacja: modyfikacja limfocytów, transfer do komórek nowotworowych genów kodujących antygeny, cytokiny Keratynocyty Komórki naskórka, występują w śluzówce jamy ustnej Modele zwierzęce: wykorzystanie modyfikowanych keratynocytów do wydzielania terapeutycznych substancji: hormon wzrostu, ApoE, czynnik IX Ortodontyczny ruch zębów Transfer genu RANKL do tkanki przyzębia => ortodontyczny ruch zęba przyśpieszony o 150% Transfer genu OPG => ruch zęba opóźniony o 50% Tworzenie nowych zębów in vivo: Identyfikacja genów odpowiedzialnych za indukowanie ząbkowania ex vivo: Hodowla naturalnych implantów: nieunerwione, nieukrwione, ale zbudowane z tej samej tkanki co naturalny ząb Parodontoza Wektor wirusowy z genem kodującym rozpuszczalny receptor TNF 60-80% ochrona tkanek przyzębia przed zniszczeniem w porównaniu do pacjentów nie poddanych terapii genowej
Terapia genowa i alkoholizm Dehydrogenaza aldehydowa: kluczowy enzym w metabolizowaniu etanolu Mutacje obniżające aktywność enzymu: mniejsze o 2/3 ryzyko zapadnięcia na alkoholizm Disulfiram: inhibitor dehydrogenazy aldehydowej; stosowany w leczeniu alkoholizmu Terapia genowa: Antysensowny ssdna komplementarny do mrna ADH o blokada translacji o test na uzależnionych od alkoholu szczurach => 50% mniejsze spożycie alkoholu przez > miesiąc po terapii Wyciszanie genów Interferencja RNA: naturalny proces polegający na degradacji lub zahamowaniu ekspresji docelowego transkryptu przez specyficzne krótkie cząsteczki RNA (sirna lub mirna) projektowanie sirna w celu wyciszenia ekspresji szkodliwych genów RNAi w leczeniu raka Wyciszenie ekspresji VEGF Zablokowanie angiogenezy w tkance nowotworowej Odcięcie dopływu krwi Zagłodzenie nowotworu Wyciszenie ekspresji PKN3 (kinaza białkowa N3) Atu027 Inhibicja PKN3 zmniejsza przerzuty do węzłów chłonnych w raku prostaty Zwierzęce modele raka płuc: zmniejszenie przerzutów w grupie zwierząt, której podano lek Zwierzęce modele raka piersi: zapobiega przerzutom do płuc Wyciszenie ekspresji tenascyny C (TN-C) nadekspresja przyczynia się do adhezji, migracji, inwazyjności i proliferacji glejaka nagie cząsteczki dsrna, 160 pz wstrzyknięto bezpośrednio do naciekającej tkanki nowotworowej podczas zabiegu chirurgicznego Znaczące wydłużenie mediany czasu przeżycia pacjentów poddanych terapii w poróonaniu do grupy kontrolnej (48,2 tygodnie vs 106,6 tygodni) Infekcje wirusowe Wirus Ebola sirna przeciwku L-polimerazie, oraz wirusowym białkom VP24 i VP35 Zastosowanie leku uchroniło zwierzęta przed śmiercią Wirus HIV niezwykle wysokie tempo mutacji; zwiększenie skuteczności terapii => łączenie wielu metod wyciszania wirusowych genów o Lentiwirusy niosące shrna przeciwko transkryptom genów tat (trans-aktywator transkrypcji) i rev (regulator ekspresji białek wirusowych o wabik TAR RNA o rybozym typu hammerhead przeciwko receptorowi CCR5 Badanie kliniczne I faza o Zmodyfikowane komórki przyjęły się u wszystkich pacjentów w ciągu 11 dni
o o Nie zaobserwowano związanych z leczeniem toksyczności Ekspresja shrna i rybozymu udokumentowana przez 24 miesiące obserwacji Choroby metaboliczne Obniżenie poziomu LDL: sirna przeciwko APOB, PCSK9 o Badanie eksperymentalne na gryzoniach => znaczące obniżenie LDL o Pierwsze badania na ludziach: sirna przeciwko APOB jest dobrze tolerowany