Wykład 10 Wytwarzanie i zastosowanie leków opartych na kwasach nukleinowych. Struktura ogólna nukleotydu. Wiązania fosfodiestrowe w DNA lub RNA

Transkrypt

1 Przedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNLGIA CHEMICZNA Kwasy nukleinowe 1. Polikondensaty zbudowane z nukleotydów 2. Dwa rodzaje: i RNA 3. Trzy formy RNA: mrna, trna i rrna 4. i mrna są nośnikami informacji genetycznej 5. Cząsteczki labilne; ulegają denaturacji przy ogrzewaniu; RNA podatne na hydrolizę alkaliczną Struktura ogólna nukleotydu Wiązania fosfodiestrowe w lub RNA Zasady purynowe i pirymidynowe występujące w i/lub RNA

2 Przedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNLGIA CHEMICZNA Struktury przestrzenne kwasów nukleinowych Struktury przestrzenne RNA: z lewej mrna; z prawej - a) trna; b) rybozym hammerhead; c) Intron z mrna Model Watsona-Cricka struktury

3 Przedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNLGIA CHEMICZNA Kierunek przepływu informacji genetycznej

4 Przedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNLGIA CHEMICZNA Możliwości zastosowania kwasów nukleinowych jako leków 1.Wprowadzenie stosunkowo krótkiego fragmentu kwasu nukleinowego w celu zablokowania ekspresji konkretnego genu. strategia antysensu Zadaniem wprowadzonego preparatu (RNA lub ) jest hybrydyzacja do specyficznego odcinka mrna będącego celem molekularnym, zablokowanie jego ekspresji i/lub indukcja procesu unieczynnienia. Preparaty otrzymywane na drodze syntezy chemicznej (N) lub biologicznej i są na ogół zmodyfikowane. 2.Wprowadzenie kwasu nukleinowego jako kompletnego genu w celu wywołania jego ekspresji. terapia genowa (somatyczna, mitochondrialna) -szczepionki Substancja czynna w formie plazmidu zawierającego kompletną sekwencję genu kodującego biologicznie czynne białko. Preparaty otrzymywane na drodze biosyntezy.

5 Przedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNLGIA CHEMICZNA Porównanie rodzajów strategii antysensowych

6 Przedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNLGIA CHEMICZNA Strategie antysensowe preparaty N otrzymywane na drodze syntezy Miejsca chemicznej modyfikacji oligorybonukleotydów

7 Przedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNLGIA CHEMICZNA Strategie antysensowe preparaty N otrzymywane na drodze syntezy DMTr Z DMTr Z DMTr Z H Z P R' N R'' R''' P Z Sekwencja reakcji: 1. Przyłączanie 3 -fosforoamidynowych pochodnych nukleozydów z grupą 5 H ochronioną grupą DMTr do wolnej grupy 5 H nośnika lub poprzedniego nukleotydu. 2. Pozostające wolne grupy 5 H blokuje się poprzez acetylację. 3. Po zsyntezowaniu łańcucha N - sulfuryzacja Produkt końcowy: mieszanina N o długości n (produkt dominujący), n-1, n-2, itd.. Z zasada azotowa DMTr 4,4 -dimetoksytrytyl DMTr [S] Z P S - Schemat syntezy N na nośniku stałym Z

8 Przedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNLGIA CHEMICZNA Pożądane cechy N: - długość nukleotydów - sekwencja komplementarna do specyficznej sekwencji celu molekularnego - unikanie sekwencji: tworzących niepożądane struktury II-rzędowe, tworzących G-kwartety, motywów CpG - odporność na działanie nukleaz - zdolność do indukowania działania RNazy H - brak efektów ubocznych Zalety Wady I generacja porność na działanie nukleaz Generowanie chiralności Aktywacja RNazy H Wiązanie z białkami/toksyczność II generacja Mniejsza toksyczność Brak aktywacji RNazy H Brak problemów stereochemicznych Gapmery N chimeryczne (środek PS, na końcach Me lub ME) III generacja PNA Niewielka toksyczność Brak indukcji RNazy H LNA Duża odporność na działanie nukleaz Wysokie powinowactwo do mrna Problemy z rozpuszczalnością

9 Przedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNLGIA CHEMICZNA Strategie antysensowe peptydowe kwasy nukleinowe

10 Przedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNLGIA CHEMICZNA Strategie antysensowe rybozymy i deoksyrybozymy Modele struktur II-rzędowych rybozymu hammerhead i deoksyrybozymu Model struktury przestrzennej rybozymu hammerhead

11 Przedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNLGIA CHEMICZNA Antysensowe oligonukleotydy zaaprobowane do badań klinicznych Produkt Firma Target (mrna) Choroba Typ Status Vitravene (Fomivirsen) ISIS PS Akcept Pharmaceuticals CMV IE2 CMV retinopatia. Affinitac (ISIS 3521) ISIS PKC- Nowotwór PS Faza III Genasense Genta Bcl2 Nowotwór PS Faza III Alicaforsen (ISIS 2302) ISIS ICAM-1 ISIS ISIS antywirusowy Łuszczyca, Choroba Crohna, Wrzodziejące zapalenie jelit Żóltaczka zakaźna typu C ISIS 2503 ISIS H-ras Nowotwór MG98 Methylgene metylotransferaza Nowotwory lite EpiGenesis Receptor EPI-2010 Pharmaceuticals adenozyny A1 Astma Reduktaza Lorus rybonukleotydow GTI 2040 Therapeutics a (R2) Nowotwór Reumatoidalne zapalenie stawów, ISIS ISIS TNF Łuszczyca Avi4126 AVI BioPharma c-myc Nowotwory, Gem231 Hybridon PKA RI Nowotwory lite Gem92 Hybridon HIV gag AIDS Reduktaza Lorus rybonukleotydow GTI 2051 Therapeutics a (R1) Nowotwory PS PS PS PS PS PS Faza II/III Faza II Faza II Faza II Faza II Faza II II gener. Faza II III gener. Faza I/II II Faza gener. I/II II gener. Faza I PS Faza I

12 Wykład 9 Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych Przedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNLGIA CHEMICZNA Terapia genowa Rodzaje terapii genowej: somatyczna, mitochondrialna Techniki somatycznej terapii genowej Substytucja wprowadzenie genu, którego brak w organizmie chorym, a występuje w zdrowym Addycja wprowadzany gen nie występuje także w organizmie zdrowym

13 Wykład 9 Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych Przedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNLGIA CHEMICZNA Stany patologiczne/chorobowe, które mogą być leczone terapią genową Defekty genetyczne Choroby nabyte Niedobory metaboliczne Deficyt enzymów cyklu mocznikowego Fenyloketonuria Choroba Gauchera Hemoglobinopatie Anemia sierpowata Thalasemia Zaburzenia krzepliwości krwi Hemofilia A i B Choroby płuc Zwłóknienie torbielowate (mukowiscydoza) Deficyt alfa-1 antytrypsyny Choroby układu sercowo-naczyniowego Rodzinna hipercholesterolemia Choroby infekcyjne AIDS Wirusowe zapalenia wątroby typu B i C Choroby neurologiczne Choroba Parkinsona Choroba Alzheimera i inne neurodegradacyjne Choroby układu sercowo-naczyniowego Arterioskleroza Choroby naczyń obwodowych Choroba wieńcowa Nowotwory różne typy

14 Wykład 9 Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych Przedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNLGIA CHEMICZNA Terapia genowa nowotworów 1. dwrócenie fenotypu nowotworowego poprzez kontrolę ekspresji onkogenów lub wstawienie genów supesorowych Zahamowanie ekspresji uszkodzonych genów tworzących szlak mutacyjny lub zastąpienie zmutowanego genu jego prawidłowo działającym odpowiednikiem. Stosowanie technologii sirna 2. Poprawę odpowiedzi przeciwnowotworowej gospodarza przez uczynienie komórek nowotworowych bardziej immunogennymi TIL- T-cell infiltrating lymphocytes (limfocyty naciekające nowotwór). Wprowadzanie genów kodujących antygeny nowotworu (czerniak, gen HLA-B7). Geny kodujące cytokiny 3. Zniszczenie komórek nowotworowych za pomocą wprowadzenia genów kodujących białka aktywujące proleki przeciwnowotworowe 4. chrona zdrowych tkanek narażonych na działanie czynników cytotoksycznych, chemoterapii lub radioterapii Komórki szpiku geny kodujące białka MDR 5. Wpływ na proces angiogenezy guza Geny kodujące czynniki antyangiogenne, w tym przeciwciała anty VEGF, FGF

15 Wykład 9 Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych Przedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNLGIA CHEMICZNA Problem wprowadzenia do tkanek (komórek) - jest dużą cząsteczką o charakterze polianionowym, bardzo słabo przechodzącą przez błony biologiczne; - nagie jest podatne na działanie nukleaz - tworzy struktury supehelikalne

16 Przedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNLGIA CHEMICZNA Wirusowe: Niewirusowe: - retrowirusy - lentiwirusy - adenowirusy - wirusy opryszczki - wirusy towarzyszące adenowirusom AAV - nagi - liposomy kationowe -związki polikationowe

17 Przedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNLGIA CHEMICZNA Nośniki niewirusowe Składają się z syntetycznych związków chemicznych lub wysoko oczyszczonych substancji pochodzenia naturalnego; nie ma tu ryzyka aktywacji onkogenów; mniejsza wydajność transferu związana z ujemnym ładunkiem plazmidowego i jego wielkością potrzebna kondensacja w cząsteczkach nośnika.

18 Przedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNLGIA CHEMICZNA Nośniki liposomowe Lipidy i liposomy cząsteczki amfifilowe tworzą biwarstwę lipidową zbudowaną z lipidów kationowych i neutralnych, zwróconych do siebie częściami hydrofobowymi; do wnętrza wprowadzany jest skondensowany ; nośnik wprowadzany do komórek na drodze endocytozy.

19 Przedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNLGIA CHEMICZNA Somatyczna terapia genowa nośniki polikationowe

20 Przedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNLGIA CHEMICZNA Wektory wirusowe Wykorzystanie naturalnej zdolności wirusów do wprowadzania lub RNA do komórek ssaczych; konstruowane za pomocą metod inżynierii genetycznej/biologii molekularnej; plazmidowy wektor i komórki pakujące; całość lub część genów jest usuwana geny odpowiadające za replikację i kodujące białka otoczki wirusa; na ich miejsce wprowadzany jest gen terapeutyczny zwany transgenem.

21 Przedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNLGIA CHEMICZNA

22 Wykład ETAPY 10 PRCESU Wytwarzanie PRDUKCYJNEG i zastosowanie EFEKTY leków opartych na kwasach nukleinowych Przedmiot: Fermentacja Podstawy Biotechnologii okresowa E. coli Politechnika TECHNLGIA Gdańska, Inżynieria CHEMICZNA Biomedyczna ETAPY PRCESU PRDUKCYJNEG EFEKTY Fermentacja ddzielenie okresowa komórek E. coli (separator) ddzielenie komórek (separator) Liza alkaliczna (NaH/SDS) Strącanie octanem potasu Liza alkaliczna (NaH/SDS) Strącanie octanem potasu czyszczanie klarowanie (filtracja/wirowanie) czyszczanie klarowanie (filtracja/wirowanie) Chromatografia anionowymienna Chromatografia anionowymienna Strącanie izopropanolem Strącanie izopropanolem Filtracja na żelu/ Chromatografia Filtracja na żelu/ faz Chromatografia faz odwróconych odwróconych Zmniejszenie objętości Usunięcie: Zmniejszenie objętości Fragmenty błon komórkowych, białka, Usunięcie: genomowe Fragmenty błon komórkowych, białka, genomowe sad sad RNA Białka RNA Endotoksyny Białka Endotoksyny Białka Białka Genomowe Genomowe RNA RNA Endotoksyny Endotoksyny open circle plazmid open circle plazmid gólny gólny schemat schemat procesu procesu produkcyjnego produkcyjnego otrzymywania otrzymywania terapeutycznego terapeutycznego plazmidowego plazmidowego Nadanie postaci leku

23 Przedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNLGIA CHEMICZNA Terapeutyczne plazmidowe ; typowe specyfikacje procedury zwalniającej Test Specyfikacja Wygląd Wielkość, miejsce cięcia restrykcyjnego przejrzysty, bezbarwny roztwór zgodność z mapą plazmidu (elektroforeza w żelu agarozowym, analiza restrykcyjna) Kolisty plazmid (forma CCC) >95% (elektroforeza w żelu agar., HPLC), E. coli Białko RNA Endotoksyna Sterylność Specyficzna aktywność <0,02 µg/µg plazmidowego (Southern blot) niewykrywalne (oznaczenie metodą BCA) niewykrywalne (elektroforeza w żelu agar.) <0,1 EU/µg plazmidowego (LAL) brak wzrostu po 14 dniach (USP) dpowiada standardowi referencyjnemu