WYDZIAŁ BIOCHEMII, BIOFIZYKI I BIOTECHNOLOGII PRACOWNIA GENETYKI MOLEKULARNEJ I WIRUSOLOGII

Transkrypt

1 UNIWERSYTET JAGIELLOŃSKI W KRAKOWIE WYDZIAŁ BIOCHEMII, BIOFIZYKI I BIOTECHNOLOGII PRACOWNIA GENETYKI MOLEKULARNEJ I WIRUSOLOGII KIEROWNIK PROF. DR HAB. HANNA ROKITA 12 marca 2012 r. Recenzja pracy doktorskiej p. mgr Rafała Kamińskiego pt The analysis of the interactions between HIV-1 protein Rev, viral RRE RNA and a host celi factor Pura" Tematyka przedstawionej do recenzji pracy doktorskiej dotyczy analizy oddziaływań białka Rev wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) z cząsteczkami wirusowego RNA, zawierającymi sekwencje odpowiedzialne za wiązanie białka Rev, oraz z białkiem komórkowym Pura. Pomimo prawie 30-tu lat badań, wirus niedoboru odporności HIV-1 stanowi spore wyzwanie dla badaczy i lekarzy. Niewątpliwym postępom w leczeniu zakażeń wirusem HIV-1 towarzyszy nieustanne poszukiwanie nowych sposobów zwalczania skutków infekcji tym stale mutującym lentiwirusem powodującym powstawanie oporności na kolejne leki przeciwwirusowe. Praca doktorska p. mgr Kamińskiego jest kontynuacją wcześniejszych badań prowadzonych w zespole ko-promotora rozprawy, prof. K. Khalili z Uniwersytetu Temple w Filadelfii w USA. W badaniach tych udowodniono, że białko komórkowe Pum wiąże się z ważnym białkiem regulatorowym wirusa, Tat (ang. transactivator of transcription), zmieniając jego funkcję w zakażonej wirusem komórce. Wyniki opisane przez Autora w przedstawionej do recenzji rozprawie doktorskiej dotyczą innego białka wirusa HIV-1, Rev (ang. regulator of expre-ssion of virion proteins), ważnego regulatora cyklu życiowego wirusa. Białko Rev wiąże się specyficznie do sekwencji RRE (ang. Rev responsive element) znajdującej się w drugim intronie w genie env i umożliwia transport cząsteczek mrna zawierających introny do cytoplazmy. W ten sposób możliwa jest translacja wirusowych białek i enkapsydacja pełnych (zawierających introny) transkryptów. Zdolność białka Pura do rozpoznawania i wiązania powtórzonych sekwencji typu GGN w UL GRONOSTAJOWA KRAKÓW TEL. +48 (12) HANNA.ROKITA@ULEDU.P1

2 2 RRE, skłoniła Autora do próby wyjaśnienia roli tego białka w transporcie wirusowego mrna zawierającego introny. Chociaż jak sam Autor podkreśla, jego praca nie pokazuje wpływu badanego białka komórkowego na przebieg zakażenia wirusem HIV-1 czy zmiany ekspresji białek wirusowych w zakażonych komórkach, jest to niewątpliwie ważna praca, gdyż jej wyniki mogą stać się podstawą opracowania skutecznych inhibitorów cyklu życiowego wirusa HIV-1 w komórkach poprzez celowanie do komórkowych kofaktorów białek wirusowych, jakim jest np. białko Pum. Wyniki zawarte w rozprawie zostały już opublikowane w postaci dwóch prac oryginalnych w J Cell Biochem i Cancer Biol Ther o łącznym IF ok. 6,0 w 2008 r. i co ważne w obu p. Rafał Kamiński jest pierwszym autorem. Przedstawiona do recenzji praca doktorska, napisana w języku angielskim z racji miejsca wykonania doświadczeń, jest niezbyt obszerna (liczy łącznie 71 stron), ale zawiera wszystkie wymagane części i jest zwięzła. W 15-stronicowym starannie opracowanym wstępie opisano samego wirusa HIV-1, jego cykl życiowy, ważne wirusowe białka oraz eksport cząsteczek wirusowego RNA z jądra do cytoplazmy. Autor opisuje także funkcje białka komórkowego Pum oraz komórkowy eksport jądrowocytoplazmatyczny. Moja uwaga krytyczna do tego rozdziału dotyczy danych zebranych w Tabeli 1 (str ), w której chyba tylko z powodu zbytniej skromności (bo wyniki zostały już opublikowane) Autor nie umieścił badanego przez siebie białka Pum jako czynnika komórkowego, dla którego wykazano oddziaływanie z białkiem wirusowym Rev. W rozdziale tym cytowana jest praca Levy 2007 (str. 11), której brak w spisie piśmiennictwa a także nie zamieszczono pełnego cytowania danych bibliograficznych (Stoltzfus, str. 14, wiersz 7 od dołu). Rozdział Materiały i Metody" jest napisany dość skrótowo na 8 stronach więc niekiedy można odnieść wrażenie, że Autor stosował powszechnie znane techniki. Tymczasem poza hodowlą komórkową, immunoblottingiem czy izolacją białek oraz RNA, są to dość skomplikowane metody, jak np. klonowanie szeregu konstruktów genetycznych dla uzyskania ekspresji pełnych i zmutowanych białek, transformacja bakterii plazmidowym DNA, mutageneza ukierunkowana, transfekcja ludzkich komórek plazmidowymi wektorami, wyciszanie ekspresji genów z wykorzystaniem sirna, izolacja białek fuzyjnych z ekspresji w bakteriach, reakcja odwrotnej transkrypcji, reakcja łańcuchowa polimerazy DNA, metoda hybrydyzacji typu Northern, immunoprecypitacja RNA (RIP) i koimmunoprecypitacja białek oraz analiza białek oddziałujących z badanym RNA metodą EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay). W rozdziale tym jest sporo błędów

3 3 literowych i językowych, ale przede wszystkim brak wyjaśnienia powodu wyboru linii komórkowej glejaka U87MG do badania interakcji bia łek wirusowych i RNA wirusowego z białkiem komórkowym Pura. Zastosowana linia komórek nowotworowych nie jest naturalnym miejscem rozwoju wirusa HIV-1, gdyż są nimi ludzkie limfocyty T pozytywne pod względem receptora CD4 i makrofagi. Wyniki badań stanowią najobszerniejszy rozdział pracy, zostały przedstawione na 20 stronach w postaci 13 złożonych rycin. W pierwszej części badań opisanych w rozprawie zanalizowano wpływ białka Pura na funkcję wirusowego białka Rev transfekując komórki U87-MG plazmidem reporterowym oraz plazmidami ekspresyjnymi dla białek Rev i Pura. Stosując dwa układy oparte na aktywności genów reporterowych (acetylotransferazy chloramfenikolu i lucyferazy) zależnej od sekwencji RRE wiążącej białko Rev udowodniono, że nadekspresja białka Pura zwiększa stymulujący efekt białka Rev na ekspresję genów reporterowych. Co ciekawe, nadekspresja samego białka Pura także podnosiła w cytoplazmie zawartość RNA, które zawierało introny. Zastosowanie inhibitora eksportyny 1, antybiotyku leptomycyny B, pozwoliło zahamować wpływ białka Rev na aktywność lucyferazy i w ten sposób wykazać specyficzność efektu Pura na aktywność białka Rev. Zastosowanie zjawiska interferencji RNA do wyciszenia endogennej ekspresji białka Pura na poziomie jego transkryptu pozwoliło pokazać spadek ekspresji genu lucyferazy w przypadku sekwencji regulatorowej RRE. Dla tego wyniku brakuje próby interpretacji zaobserwowanego znacznego niemal 10-krotnego obniżenia zawartości białka Pura w komórkach skutkującego tylko ok. 20% spadkiem aktywności reporterowego genu (Fig. 3). Wydaje się, że taki wynik wyklucza wyłączną rolę Pura w aktywacji białka Rev. Użycie serii mutantów delecyjnych obu białek Rev i Pura pozwoliło pokazać ważny wynik, że tylko białka o pełnej długości zawierające wszystkie funkcjonalne domeny zwiększały aktywności stosowanych genów reporterowych. Z kolei próba koekspresji obu badanych białek wykazała, że białko Pura zwiększa zawartość transportowanych przez Rev cząsteczek mrna z sekwencją RRE w cytoplazmie a więc niewątpliwie posiada bezpośredni wpływ na transport mrna z udziałem białka Rev. W drugiej części badań zgromadzono dane wskazujące na wzajemne wiązanie się białek Rev i Pura. Najpierw metodą mikroskopii fluorescencyjnej udowodniono wspólną lokalizację białek Rev i Pura w komórce. Uzyskane w wyniku ekspresji z odpowiednio skontruowanych plazmidów białka fuzyjne wykazujące zieloną (dla Pura) i czerwoną (dla Rev) fluorescencję wykryto w rejonie okołojądrowym choć samo białko Rev występuje też w jąderku a Pura także w cytoplazmie. Następnie w teście wiązania białek fuzyjnych z transferazą S glutationową (GST) GST-Rev i

4 4 GST-Pura oraz ich mutantów delecyjnych z bia ł kami komórek transfekowanych plazmidami ekspresyjnymi dla bia ł ka Pura lub Rev pokazano, że Pum wiąże się z białkiem Rev o pełnej długości ale szczególnie ważny w białku Rev jest rejon obejmujący aminokwasy 18-50, w którym znajduje się sygnal lokalizacji jądrowej (NLS), domena wiążąca RNA (RBD) oraz domena odpowiedzialna za powstawanie multimerów Rev (MD). Z kolei dla białka Pum w podobnym teście wykazano istotną rolę aminokwasów w wiązaniu z białkiem Rev. Ponadto metodą ko-immunoprecypitacji pokazano obecność i lokalizację głównie w cytoplazmie kompleksów Pura/Rev w komórkach stransfekowanych plazmidem reporterowym zawierającym sekwencję RRE oraz plazmidami ekspresyjnymi dla rekombinowanych białek Pura (z metką T7) i Rev (z metką c-myc i His). W trzeciej (ostatniej) serii doświadczeń Autor zgromadził dowody na udział sekwencji RNA w oddziaływaniach obu badanych białek. Dzięki zastosowaniu testu opóźnienia wędrówki w żelu EMSA z RNA zawierającym region RRE jako sondą i rekombinowanymi białkami Rev i Pum (w fuzji z GST), pokazał, że Pura wiąże się nie tylko z istniejącym kompleksem Rev/RRE i zwiększa ich zawartość, ale także samo może wiązać się z sekwencjami RNA niezwiązanymi z Rev. Do tej części wyników można mieć zastrzeżenia wynikające z użycia białek fuzyjnych a nie czystych, gdyż trudno ocenić wpływ metki" w postaci GST na wiązanie z wyznakowanym RNA. Ponadto, jak wynika z Fig, 11 i 12, cz ęść próbek białek była inkubowana przy niedomiarze sondy (np. ścieżki 3-5 i 8-10 Fig. 11A). Wreszcie test immunoprecypitacji RNA pozwolił pokazać, że wiązanie Pum z Rev i RNA z sekwencją RRE ma miejsce w cytoplazmie komórek w hodowli in vitro. Podsumowując opisane w rozprawie wyniki należy podkreślić, że we wszystkich doświadczeniach zadbano o włączenie właściwych kontroli, co wymagało np. przygotowania serii plazmidów kontrolnych. Nie wskazano natomiast liczby powtórzeń poszczególnych doświadczeń. W tym rozdziale brak numeracji ścieżek w Fig. 1B i 1C, Fig. 2B, 6C, 10 a Fig. 13 pomy łkowo oznaczono jako 14. W Fig. 6C (str. 43) pomylono po łoż enie produktów hybrydyzacji z sondą CAT. Dyskusja pracy został a napisana w sposób bardzo ciekawy i poparta wieloma danymi z opublikowanego piśmiennictwa. Autor wiele miejsca poświęca roli białka Pum w komórce, jego zdolności do wiązania się do mrna i rybosomowego RNA, co wyraźnie sugeruje jego rolę w kierowaniu transkryptów do miejsc translacji. Bardziej dogłębna analiza wiązania się Pum do specyficznych sekwencji w RNA i białku wirusowym Rev skłoniła Autora do wysnucia hipotezy, że białko Pum pomaga helikazom RNA tak przekształcić ładunek" w postaci mrna, że możliwa jest jego translokacja przez pory jądrowe do cytoplazmy. Nie pozostawiono także bez komentarza

5 5 zdolności białka Pura do wiązania się do DNA oraz współdziałania tego białka z innym białkiem regulatorowym wirusa, Tat. Interesująco omówiono również ogólny zarys potranskrypcyjnej regulacji ekspresji genomu retrowirusów. Niewątpliwie ciekawa a niewyjaśniona dotychczas byłaby rola białka Pura w eksporcie transkryptów wirusowych posiadających introny niezależnie od białka Rev, w obecności inhibitora eksportu jądrowego, leptomycyny B. Niekoniecznie byłoby to przekierowanie mrna na inne szlaki eksportu jądrowego a być może efekt nadekspresji białka Pura. W streszczeniach angielsko- i polsko-języcznym, które są poprawnie zredagowane, znalazła się nieścisłość dotycząca transportu jądrowocytoplazmatycznego (strony odpowiednio 6 i 8), niesłusznie sugerująca, że eksport z jądra komórkowego dotyczy jedynie cząsteczek rrna. W streszczeniu polskojęzycznym trudno zgodzić się ze stwierdzeniem, że zwiększenie różnorodności cząsteczek mrna (przez alternatywny splicing) powoduje zwiększenie pojemności genetycznej genomu wirusa". Chodzi tu na pewno o zwiększenie pozornej" pojemności genomu, gdyż fizycznie genom nie powiększa się. Poza dyskusją Autor załączył rozdział Wnioski", w których w 4 punktach krótko podsumowuje uzyskane wyniki. Praca jest napisana poprawnie, dobrze zredagowana i ilustrowana, cho ć niektóre schematy są zbyt pomniejszone (Fig. 4A, 5A i 7). Legendy rycin są napisane bardzo szczegółowo z podaniem wszystkich istotnych informacji. Poza błędami literowymi i interpunkcyjnymi znaleziono pomyłki, które omówiono przy poszczególnych rozdziałach pracy. Niezależnie od wspomnianych powyżej drobnych uwag wnoszę do Rady Wydziału Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Uniwersytetu Jagiellońskiego o dopuszczenie p. mgr Rafała Kamińskiego do następnych etapów przewodu doktorskiego. o (A A Hanna Rokita