BIOLOGIA KOMÓRKI. Mikroskopia fluorescencyjna -2 Przyżyciowe barwienia organelli wewnątrzkomórkowych

Podobne dokumenty
BIOLOGIA KOMÓRKI. Mikroskopia fluorescencyjna -2 Przyżyciowe barwienia organelli wewnątrzkomórkowych

BIOLOGIA KOMÓRKI. Podstawy mikroskopii fluorescencyjnej -1 Barwienia przyżyciowe organelli komórkowych

BIOLOGIA KOMÓRKI DLA BIOCHEMIKÓW. Podstawy mikroskopii fluorescencyjnej -1 Barwienia przyŝyciowe organelli komórkowych

BIOLOGIA KOMÓRKI KOMÓRKI EUKARIOTYCZNE W MIKROSKOPIE ŚWIETLNYM JASNEGO POLA I KONTRASTOWO- FAZOWYM; BARWIENIA CYTOCHEMICZNE KOMÓREK

BIOLOGIA KOMÓRKI. Techniki generowania heterokariontów

Metody immunocytochemiczne. Barwienie fluorescencyjne komórek prawidłowych i nowotworowych PRAKTIKUM Z BIOLOGII KOMÓRKI (BT 206, BT 231)

BIOLOGIA KOMÓRKI. Analiza żywotności komórek w warunkach in vitro

Metody immunocytochemiczne. Barwienie fluorescencyjne komórek prawidłowych i nowotworowych PRAKTIKUM Z BIOLOGII KOMÓRKI (BT 106)

BIOLOGIA KOMÓRKI. Testy witalności komórek

Opis efektów kształcenia dla modułu zajęć

BIOLOGIA KOMÓRKI ANALIZA AKTYWNOŚCI ENDOCYTARNEJ KOMÓREK

BIOLOGIA KOMÓRKI BANKOWANIE KOMÓREK

BIOLOGIA KOMÓRKI. Ocena końcowa z kursu będzie liczona jako: 20% oceny z ćwiczeń 80% oceny z egzaminu

PODSTAWY BIOLOGII KOMÓRKI. Bankowanie komórek i ocena ich żywotności

PODSTAWY BIOLOGII KOMÓRKI. Bankowanie komórek i ocena ich żywotności

Wykorzystanie metod immunocytochemicznych w diagnostyce medycznej PRAKTIKUM Z BIOLOGII KOMÓRKI (BT 206, BT 231)

Mikroskopia fluorescencyjna

Tematy- Biologia zakres rozszerzony, klasa 2TA,2TŻ-1, 2TŻ-2

Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej Katedra Technologii Leków i Biochemii. Biologia komórki nowotworowej: Ćwiczenie B

Badanie dynamiki białek jądrowych w żywych komórkach metodą mikroskopii konfokalnej

Technika hodowli komórek leukemicznych

Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej Katedra Technologii Leków i Biochemii. Biologia komórki nowotworowej: Ćwiczenie E

Temat ćwiczenia: Techniki stosowane w badaniach toksyczności in vitro

Kierunek i poziom studiów: Biologia, poziom pierwszy

Wykorzystanie metod immunocytochemicznych w diagnostyce medycznej PRAKTIKUM Z BIOLOGII KOMÓRKI (BT 206, BT 231)

Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej Katedra Technologii Leków i Biochemii. Metody przeżyciowego barwienia i obserwacji komórek

POLITECHNIKA ŁÓDZKA INSTRUKCJA Z LABORATORIUM W ZAKŁADZIE BIOFIZYKI. Ćwiczenie 3 ANALIZA TRANSPORTU SUBSTANCJI NISKOCZĄSTECZKOWYCH PRZEZ

Wprowadzenie do cytometrii przepływowej: metody znakowania komórek

Separacja komórek w gradiencie gęstości PRAKTIKUM Z BIOLOGII KOMÓRKI (BT 231)

Z47 BADANIA WŁAŚCIWOŚCI ELEKTROFIZJOLOGICZNYCH BŁON KOMÓRKOWYCH

Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej Katedra Technologii Leków i Biochemii. Metody przeżyciowego barwienia i obserwacji komórek

WYDZIAŁ LEKARSKI II. Poziom i forma studiów. Osoba odpowiedzialna (imię, nazwisko, , nr tel. służbowego) Rodzaj zajęć i liczba godzin

Novabeads Food DNA Kit

Organelle komórkowe. mgr Zofia Ostrowska

Prezentuje: Magdalena Jasińska

OPIS PRZEDMIOTU ZAMÓWIENIA ARKUSZ KALKULACYJNY OKREŚLAJĄCY CENĘ OFERTY. zestaw 4

StayRNA bufor zabezpieczający RNA przed degradacją wersja 0215

Mikroskopia konfokalna: techniki obrazowania i komputerowa analiza danych.

S YL AB US MODUŁ U ( PRZEDMIOTU) I nforma cje ogólne. Podstawy cytofizjologii

Endogenous Transcription Occurs at the 1-Cell Stage in the Mouse Embryo

BIOLOGIA klasa 1 LO Wymagania edukacyjne w zakresie podstawowym od 2019 roku

Temat: Komórka jako podstawowa jednostka strukturalna i funkcjonalna organizmu utrwalenie wiadomości.

WYKORZYSTANIE TECHNIKI ZAPŁODNIENIA

Oznaczanie aktywności cytotoksycznej chemoterapeutyków wobec komórek nowotworowych

Plan wynikowy z wymaganiami edukacyjnymi przedmiotu biologia dla klasy I szkoły branżowej I stopnia Autorki: Beata Jakubik, Renata Szymańska

Doktorantka: Żaneta Lewandowska

Uczeń: omawia cechy organizmów wyjaśnia cele, przedmiot i metody badań naukowych w biologii omawia istotę kilku współczesnych odkryć.

Nanotechnologie w diagnostyce

KARTA KURSU. Kod Punktacja ECTS* 4

Diagnostyka wirusologiczna w praktyce klinicznej

Saccharomyces Transformer Kit zestaw do przygotowywania i transformacji komórek kompetentnych Saccharomyces cerevisiae. Metoda chemiczna.

I nforma cje ogólne. I stopnia X II stopnia. - zaliczenie

Określ, która krzywa ilustruje proces zachodzący w komórkach umieszczonych w roztworze hipertonicznym. Odpowiedź uzasadnij, podając jeden argument.

Analiza dystrybucji komórek nowotworowych w cyklu życiowym z wykorzystaniem cytometrii przepływowej

rozumie znaczenie metod badawczych w poznawaniu przyrody tłumaczy, czym jest obserwacja i doświadczenie wymienia etapy doświadczenia

KARTA KURSU. Biotechnology in Environmental Protection. Kod Punktacja ECTS* 1

CORAZ BLIŻEJ ISTOTY ŻYCIA WERSJA A. imię i nazwisko :. klasa :.. ilość punktów :.

Techniki oznaczania aktywności cytotoksycznej związków chemioterapeutycznych in vitro

I nforma cje ogólne. I stopnia X II stopnia. - zaliczenie

E.coli Transformer Kit

ĆWICZENIE 5 MECHANIZMY PROMUJĄCE WZROST ROŚLIN

Spółka z o.o. UCZESTNICY WARSZTATÓW: Lekarze rezydenci i specjaliści, technicy w pracowniach diagnostycznych i histopatologicznych

XXV. Grzyby cz I. Ćwiczenie 1. Wykonanie i obserwacja preparatów mikroskopowych. a. Candida albicans preparat z hodowli barwiony metoda Grama

RAPORT Z BADAŃ 01369/2015/D/AGST. Blirt S.A Gdańsk, ul. Trzy Lipy 3/1.38. Dział DNA-Gdańsk. Nr zlecenia

Transport przez błony

Szczegółowy harmonogram ćwiczeń Biologia medyczna w Zakładzie Biologii w roku akademickim 2017/2018 Analityka Medyczna I rok

G C C A T C A T C C T T A C C

Organelle komórkowe. mgr Zofia Ostrowska

Wprowadzenie do cytometrii przepływowej: metody znakowania komórek

Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej Katedra Technologii Leków i Biochemii. Izolacja mitochondriów z komórek eukariotycznych

I BIOLOGIA JAKO NAUKA

Informacje ogólne. Wydział PUM. Specjalność - jednolite magisterskie * I stopnia X II stopnia. Poziom studiów

Roczny plan dydaktyczny przedmiotu biologia dla klasy I szkoły ponadpodstawowej, uwzględniający kształcone umiejętności i treści podstawy programowej

1. Demonstracja preparatów bakteryjnych barwionych metodą negatywną ukazujących kształty komórek bakteryjnych.

Podziały komórkowe cz. I

Podział komórkowy u bakterii

Opis przedmiotu zamówienia / Formularz specyfikacji cenowej

Genomic Maxi AX zestaw do izolacji genomowego DNA wersja 0616

Komórka - budowa i funkcje

Zestaw do wykrywania Chlamydia trachomatis w moczu lub w kulturach komórkowych

Informacje ogólne. Wydział PUM. Specjalność - jednolite magisterskie * I stopnia X II stopnia. Poziom studiów

SPRAWDZIAN klasa II ORGANELLA KOMÓRKOWE, MITOZA, MEJOZA

EKSTRAHOWANIE KWASÓW NUKLEINOWYCH JAK ZMIERZYĆ ILOŚĆ KWASÓW NUKLEINOWYCH PO IZOLACJI? JAK ZMIERZYĆ ILOŚĆ KWASÓW NUKLEINOWYCH PO IZOLACJI?

Komórki macierzyste zastosowania w biotechnologii i medycynie BT Metody identyfikacji i fenotypowania populacji komórek macierzystych

Izolowanie DNA i RNA z komórek hodowlanych. Ocena jakości uzyskanego materiału

ĆWICZENIA Z MECHANIZMÓW DZIAŁANIA WYBRANYCH GRUP LEKÓW

Projekt Uchylamy rąbka tajemnicy mikroświata

JAK ZMIERZYĆ ILOŚĆ KWASÓW NUKLEINOWYCH PO IZOLACJI? JAK ZMIERZYĆ ILOŚĆ KWASÓW NUKLEINOWYCH PO IZOLACJI?

E.coli Transformer Zestaw do przygotowywania i transformacji komórek kompetentnych Escherichia coli

RAPORT Z BADAŃ 164/Z/ /D/JOGA. Dostarczony materiał: próbki tworzyw sztucznych. Ilość próbek: 1. Rodzaj próbek: tworzywo

Zestaw do wykrywania Babesia spp. i Theileria spp. w kleszczach, krwi i hodowlach komórkowych

woda do 1000 ml ph=6,9-7,1. Po sterylizacji dodać nystatynę (końcowe stężenie ok. 50 μg/ml). Agar z wyciągiem glebowym i ekstraktem drożdżowym (YS)

KARTA PRZEDMIOTU CYTOFIZJOLOGIA/SYLABUS

Informacje ogólne. Wydział PUM. Specjalność - jednolite magisterskie X * I stopnia II stopnia. Poziom studiów

Recenzja pracy. BIOLOGIA poziom podstawowy. pieczątka/nazwa szkoły. klasa 1 LO PK nr 1 semestr I /2011/2012

Kit for rapid detection Legionella pneumophilla

Zestaw do wykrywania Anaplasma phagocytophilum w kleszczach, krwi i hodowlach komórkowych

PathogenFree DNA Isolation Kit Zestaw do izolacji DNA Instrukcja użytkownika

Plan działania opracowała Anna Gajos

Uczelnia Łazarskiego. Wydział Medyczny Kierunek Lekarski. Nazwa przedmiotu CYTOFIZJOLOGIA. Status przedmiotu. Obligatoryjny

Transkrypt:

BIOLOGIA KOMÓRKI Mikroskopia fluorescencyjna -2 Przyżyciowe barwienia organelli

Wstęp Komórki eukariotyczne, w odróżnieniu od komórek prokariotycznych (bakterie, archeony) posiadają wysoce skomplikowaną strukturę wewnętrzną. Eukarionty mają bowiem jądro komórkowe ograniczone otoczką jądrową, zawierające DNA z histonami upakowane w chromosomy, skomplikowany system organelli błonowych: siateczkę śródplazmatyczną gładką (SER) i szorstką (RER), aparat Golgiego, endosomy oraz lizosomy, które razem tworzą szlak wydzielniczy komórki, oraz mitochondria, plastydy (komórka roślinna) i peroksysomy. Dzięki obecności systemu błon biologicznych, który warunkuje istnienie odrębnych przedziałów (tzw. kompartmentację) komórka eukariotyczna posiada zdolność przeprowadzenia bardzo dużej liczby odmiennych (często przeciwstawnych) procesów biochemicznych, w tym samym czasie i w bliskim siebie sąsiedztwie. Zastosowanie klasycznego mikroskopu świetlnego ze względu na jego małą zdolność rozdzielczą (0,2μm) ogranicza możliwość dokładnej obserwacji struktur, dlatego też w tego typu badaniach bardzo często wykorzystuje się mikroskopię elektronową, której zdolność rozdzielcza na poziomie 0,2 nm niesie ze sobą znacznie większe możliwości poznania ultrastruktury organelli komórkowych. Alternatywą dla tej złożonej techniki pozostają reakcje immunocytochemiczne, bazujące na swoistej reakcji antygen-przeciwciało, których cechą charakterystyczną jest wysoka czułość umożliwiająca detekcję sygnału poniżej zdolności rozdzielczej klasycznego mikroskopu świetlnego. Wykorzystanie różnorakich fluorochromów sprzężonych z przeciwciałami umożliwia zastosowanie w tego typu badaniach mikroskopii fluorescencyjnej, jednakże takie analizy możliwe są zazwyczaj po utrwaleniu badanych komórek i ich dość złożonej obróbce. W ostatnich latach uzyskano szereg fluorochromów, które z jednej strony wiążą się specyficznie do błon określonych organelli komórkowych, co pozwala na określenie ich ewentualnego położenia w komórce, z drugiej zaś nadają się do barwień przyżyciowych. Wśród nich wyróżnić można barwniki wiążące się do błon aparatu Golgiego (Bodipy- Ceramide), mitochondriów (Miyo-Tracker, Rodamina 123), gładkiej siateczki śródplazmatycznej (ER-Tracker) oraz lizosomów (Lyso-Tracker). Barwnik DiOC 6 (3,3 -heksylokarbocyjanian jodowy) jest używany do barwienia wewnętrznych błon w komórce np. do wizualizacji siateczki śródplazmatycznej. Natomiast barwnik DiIC 18 (1,1 -dioctadecyl-3,3,3 3 -tetrametylindokarbocyjanian perchloru) wiąże się z błoną komórkową, co umożliwia po krótkiej inkubacji komórek z tym barwnikiem (np. pięciominutowej) wizualizację wyłącznie błon komórkowych, a po wydłużonej inkubacji komórek z barwnikiem (kilkugodzinnej) również przedziałów endosomów. Rodamina 123 jako silnie kationowy barwnik posiada zdolność przyłączania się do ujemnie naładowanych przedziałów komórki takich jak wewnętrzna błona mitochondriów, dzięki czemu pozwala na lokalizację tych organelli w komórce, oraz śledzenie zmian w ich właściwościach, w tym potencjale transmembranowym. Do wizualizacji DNA w komórkach stosuje się barwniki zdolne do penetracji błon komórkowych i wiążące się bezpośrednio z DNA: Hoechst 33342 - bisbenzymid, a także DAPI (4,6-diamidinodihydrochloran-2-fenylindonu). Natomiast jodek propydyny barwi kwasy nukleinowe, a barwienie jedynie struktur bogatych w DNA lub RNA można uzyskać stosując trawienie RNazą lub DNazą. 2

Cel ćwiczenia: Ćwiczenie ma na celu: zapoznanie się budową i zasadą działania mikroskopu fluorescencyjnego oraz wykorzystaniem fluorescencji w badaniach biologii komórki; praktyczne zapoznanie się z metodami wizualizacji organelli w żywych komórkach (w komórkach zwierzęcych z hodowli in vitro) z wykorzystaniem barwników fluorescencyjnych Materiały: Hodowle in vitro ludzkich fibroblastów skóry (HSF) lub ludzkich fibroblastów płuc (HLF); komórki zostały wysiane na szkiełka umieszczone w szalkach Petriego i rosną w standardowych warunkach hodowli (odpowiednia pożywka, temp. 37 o C, 5% CO 2 ); Pożywka do hodowli ludzkich fibroblastów: Modified Eagle Medium (MEM) z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz antybiotyków (100 i.u./ml peniciliny, 10 μg/ml neomycyny, 10 μg/ml streptomycyny); Zbuforowany roztwór soli fizjologicznej (PBS) z jonami wapnia i magnezu Zbuforowany roztwór soli fizjologicznej (PBS) z jonami wapnia i magnezu z dodatkiem glukozy i 5% FBS Barwniki przyżyciowe (roztwory wyjściowe w PBS): DiIC 18 (0,9 mm) DiOC6 (0,25 mg/ml) Rodamina 123 (0,1 mg/ml) Lyso -Tracer 99 (1 μm) Hoechst 33342 (0,1 mg/ml) Wykonanie ćwiczenia: 1. Grupa ćwiczeniowa dzieli się na czteroosobowe osobowe zespoły. 2. Każdy zespół wybiera do doświadczeń jeden typ komórek: HSF lub HLF, w których wybarwi jądra komórkowe, błonę komórkową, siateczkę endoplazmatyczną, mitochodria oraz lizosomy (wg protokołów podanych poniżej); każda osoba z zespołu pracuje oddzielnie i w wybranych komórkach wybarwia tylko jedną z wymienionych organelli cytoplazmatycznych lub błonę komórkową oraz jądra komórkowe, wykorzystując barwnik Hoechst 33342 oraz barwnik przyżyciowy odpowiedni do wizualizacji wybranej organelli. 3. Po zakończeniu barwienia należy oglądnąć przygotowany preparat w mikroskopie kontrastowo-fazowym oraz we fluorescencji. 4. W trakcie zajęć każda osoba indywidualnie przygotowuje sprawozdanie z wykonywanego ćwiczenia (wg wskazówek prowadzącego). 5. Należy oglądnąć preparaty przygotowane przez wszystkich kolegów z zespołu i porównać wygląd i lokalizacje w komórce różnych organelli.

Barwienie przyżyciowe siateczki śródplazmatycznej barwnikiem DiOC 6 oraz jąder komórkowych barwnikiem Hoechst 33342 1. Przygotować 1 ml roztworu barwników DiOC 6 (w stężeniu 2,5 μg/ml) oraz Hoechst 33342 (w stężeniu 1 μg/ml) w ciepłej pożywce hodowlanej (odpowiednio rozcieńczyć przygotowane roztwory wyjściowe podanych barwników). 2. Wybrać do doświadczenia jedną szalkę z komórkami wysianymi na szkiełku, oglądnąć komórki w mikroskopie odwróconym. 3. Usunąć pożywkę hodowlaną z szalki, po czym natychmiast zalać komórki 1ml pożywki (o temp. 37 o C) zawierającej mieszaninę barwników DiOC 6 i Hoechst 33342. 4. Szalkę z komórkami umieścić na10 min w inkubatorze (37 o C, 5% CO 2 ) 5. Po zakończonej inkubacji zlać pożywkę z szalki a szkiełko z komórkami przepłukać delikatnie 3razy PBS (o temp. 37 o C). 6. Wyczyścić komorę do oglądania żywych komórek i szkiełko nakrywkowe. 7. Szkiełko z komórkami umieścić w komorze (komórkami do góry), nakropić na nie 20μl PBS (o temp. 37 o C) i przykryć czystym szkiełkiem nakrywkowym. 8. Przygotowany preparat oglądać w mikroskopie kontrastowo-fazowym, a następnie przełączyć mikroskop do pracy w epi-fluorescencji (zmienić obiektywy, włączyć odpowiedni zestaw filtrów). 9. Oglądnąć preparat przy wzbudzeniu UV oraz światłem niebieskim. Porównać obrazy komórek w kontraście-faz i w epi-fluorescencji. 10. Obserwacje oraz wszelkie uwagi do przygotowanych preparatów (czyli dyskusja wyników ) opisać w sprawozdaniu. 11. Oglądnąć preparaty przygotowane przez kolegów z zespołu i porównać je między sobą. 4

Barwienie przyżyciowe błony komórkowej barwnikiem DiIC 18 oraz jąder komórkowych barwnikiem Hoechst 33342 1. Przygotować 1 ml roztworu barwnika DiIC 18 o stężeniu 9μM, przez rozcieńczenie roztworu wyjściowego (0,9 mm) pożywką hodowlaną (o temp. 37 o C). 2. Zlać płyn hodowlany z otrzymanej szalki z komórkami, dodać 1 ml świeżej, ciepłej pożywki hodowlanej zawierającej barwnik DiIC 18 o stężeniu 9μM Szalki umieścić na 20 min w inkubatorze (37 o C, 5 % CO 2 ). 3. Po zadanym czasie inkubacji do szalki z komórkami, do pożywki zawierającej barwnik, dodać barwnik Hoechst 33342 w takiej objętości, aby jego stężenie w płynie hodowlanym wyniosło 1 μg/ml, dokładnie wymieszać pożywkę i szalkę ponownie umieścić na 10 min w inkubatorze. 4. Po zakończonej inkubacji szkiełka z komórkami 3x delikatnie przepłukać ciepłym PBS. 5. Wyczyścić przygotowaną na szkiełku podstawowym komorę do oglądania żywych komórek oraz szkiełko nakrywkowe. 6. Umieścić w komorze szkiełko z komórkami (komórkami do góry) i nakropić na nie 20 μl PBS i przykryć szkiełkiem nakrywkowym (uważać, aby w płynie nad komórkami nie wytworzyły się bańki powietrza) 7. Preparaty oglądać w mikroskopie kontrastowo-fazowym, a następnie przełączyć mikroskop do pracy w epi-fluorescencji (zmienić obiektywy, włączyć odpowiedni zestaw filtrów). Oglądnąć preparat przy wzbudzeniu światłem niebieskim oraz UV. Porównać obrazy komórek w kontraście-faz i w epi-fluorescencji. 8. Obserwacje oraz wszelkie uwagi do przygotowanych preparatów (czyli dyskusja wyników ) opisać w sprawozdaniu. 9. Oglądnąć preparaty przygotowane przez kolegów z zespołu i porównać je między sobą. 5

Barwienie przyżyciowe mitochondriów Rodaminą 123 oraz jąder komórkowych barwnikiem Hoechst 33342 1. Przygotować 1 ml roztworu Rodaminy 123 o stężeniu 1μg/ml pożywce hodowlanej (o temp. 37 o C). 2. Wybrać do doświadczenia jedną szalkę z komórkami wysianymi na szkiełku, oglądnąć komórki w mikroskopie odwróconym. 3. Usunąć pożywkę hodowlaną z szalki, po czym natychmiast zalać komórki 1ml przygotowanego roztworu Rodaminy 123 (o temp. 37 o C). 4. Szalkę z komórkami umieścić na 50 min w inkubatorze (37 o C, 5% CO 2 ). 5. Po zadanym czasie inkubacji, do w szalki z komórkami (do pożywki zawierającej Rodaminę 123) dodać barwnika Hoechst 33342 w takiej ilości, aby jego stężenie w medium wyniosło 1 μg/ml, po czym pożywkę dokładnie wymieszać i szalkę ponownie umieścić w inkubatorze na 10 min. 6. Po zakończonej inkubacji zlać pożywkę z szalki a szkiełko z komórkami przepłukać delikatnie 3razy PBS (o temp. 37 o C). 7. Wyczyścić komorę do oglądania żywych komórek i szkiełko nakrywkowe. 8. Szkiełko z komórkami umieścić w komorze (komórkami do góry), nakropić na nie 20μl PBS (o temp. 37 o C) i przykryć czystym szkiełkiem nakrywkowym. 9. Przygotowany preparat oglądać w mikroskopie kontrastowo-fazowym, a następnie przełączyć mikroskop do pracy w epi-fluorescencji (zmienić obiektywy, włączyć odpowiedni zestaw filtrów). 10. Oglądnąć preparat przy wzbudzeniu światłem niebieskim, zielonym oraz UV. Porównać obrazy komórek w kontraście-faz i w epi-fluorescencji. 11. Obserwacje oraz wszelkie uwagi do przygotowanych preparatów (czyli tzw. dyskusja wyników ) opisać w sprawozdaniu. 6

Barwienie przyżyciowe lizosomów barwnikiem Lyso-Tracer Red 99 oraz jąder komórkowych barwnikiem Hoechst 33342 1. Przygotować 1 ml roztworu barwnika Lyso-Tracer 99 o stężeniu 100 nm, przez rozcieńczenie roztworu wyjściowego (1 μm) pożywką hodowlaną (o temp. 37 o C). 2. Wybrać do doświadczenia jedną szalkę z komórkami wysianymi na szkiełku, oglądnąć komórki w mikroskopie odwróconym. 3. Usunąć pożywkę hodowlaną z szalki, po czym natychmiast zalać komórki 1ml przygotowanego roztworu barwnika Lyso-Tracer 99 (o temp. 37 o C). 4. Szalkę z komórkami umieścić na 20 min w inkubatorze (37 o C, 5% CO 2 ). 5. Po zadanym czasie inkubacji, do w szalki z komórkami (do pożywki zawierającej Lyso-Tracer 99) dodać barwnika Hoechst 33342 w takiej ilości, aby jego stężenie w medium wyniosło 1 μg/ml, po czym pożywkę dokładnie wymieszać i szalkę ponownie umieścić w inkubatorze na 10 min. 6. Po zakończonej inkubacji zlać pożywkę z szalki a szkiełko z komórkami przepłukać delikatnie 3razy PBS (o temp. 37 o C). 7. Wyczyścić komorę do oglądania żywych komórek i szkiełko nakrywkowe. 8. Szkiełko z komórkami umieścić w komorze (komórkami do góry), nakropić na nie 20μl PBS (o temp. 37 o C) i przykryć czystym szkiełkiem nakrywkowym. 9. Przygotowany preparat oglądać w mikroskopie kontrastowo-fazowym, a następnie przełączyć mikroskop do pracy w epi-fluorescencji (zmienić obiektywy, włączyć odpowiedni zestaw filtrów). 10. Oglądnąć preparat przy wzbudzeniu światłem zielonym oraz UV. Porównać obrazy komórek w kontraście-faz i w epi-fluorescencji. 11. Obserwacje oraz wszelkie uwagi do przygotowanych preparatów (czyli tzw. dyskusja wyników ) opisać w sprawozdaniu. 7

Referat: Mikroskopia fluorescencyjna w badaniach struktury i funkcji komórek Zakres materiału, jaki należy przygotować do ćwiczeń: Budowa i zasada działania mikroskopu fluorescencyjnego Barwniki fluorescencyjne stosowane w biologii komórki Zastosowanie fluorescencji w biologii komórki i diagnostyce klinicznej Budowa i funkcje podstawowych organelli Metody wizualizacji w komórce poszczególnych organelli Zalecana literatura: B. Alberts i in.: Podstawy biologii komórki, PWN 2005, część druga, rozdział 15 Red. J. Kawiak, M. Zabel: Seminaria z cytofizjologii, Wrocław 2002, rozdział 8 M. Pluta: Mikroskopia optyczna. Mikroskopia fluorescencyjna, rozdział 9 str. 473-517 8