Analiza dystrybucji komórek nowotworowych w cyklu życiowym z wykorzystaniem cytometrii przepływowej

Transkrypt

1 Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej Katedra Technologii Leków i Biochemii Biologia komórki nowotworowej: Ćwiczenie A Analiza dystrybucji komórek nowotworowych w cyklu życiowym z wykorzystaniem cytometrii przepływowej WSTĘP Każda komórka rozmnaża się według pewnego uporządkowanego schematu: na początku podwaja swoją zawartość, po czym dzieli się na dwie nowe komórki. Proces ten, nosi nazwę cyklu komórkowego. Składa się on z dwóch faz (rys. 1): interfazy (okres pomiędzy podziałami) oraz mitozy (podziału komórki). Podczas interfazy komórka wzrasta w sposób ciągły, natomiast w fazie M wzrost jest zatrzymany i dochodzi najpierw do podziału jądra komórkowego, a w konsekwencji całej komórki. Rysunek 1. Fazy cyklu komórkowego; źródło: [2] W interfazie można wyróżnić: fazę poprzedzającą syntezę DNA fazę G1. Jest to okres pomiędzy fazą M, a początkiem fazy syntezy. W tym czasie intensywnie wzrasta masa i objętość komórki, fazę syntezy DNA fazę S, w trakcie której komórka prowadzi replikację jądrowego DNA (zawartość DNA wzrasta z 2n do 4n), fazę przedpodziałową fazę G2, która stanowi okres pomiędzy końcem fazy S, a początkiem fazy M. Następuje kondensacja chromosomów. Syntetyzowane są elementy do budowy i działania aparatu mitotycznego. 1

2 Komórka może również przestać się dzielić i wejść w fazę G0 (fazę spoczynkową). Komórki w fazie G0 nie pozostają bezczynne, nie dzielą się, ale mają zachowane pozostałe funkcje metaboliczne. Wejście komórek do fazy G0 może być spowodowane m.in.: zakończeniem procesu różnicującego komórki, brakiem składników odżywczych czy też uszkodzeniami materiału genetycznego. Stan spoczynku komórki może trwać od kilku dni do kilku miesięcy. Fazy G1 oraz G2 (ang. gap) stanowią przerwy w cyklu komórkowym, w trakcie których komórka sprawdza czy warunki, zarówno wewnętrzne jak i zewnętrzne, są odpowiednie do wejścia w kolejną fazę (fazę S lub M). Obie fazy (G1 i G2) zapewniają komórce dodatkowy czas na wzrost i powielenie cytoplazmatycznych organelli. Na fazę M składają się kariokineza (podział jądra komórkowego) i cytokineza (podział cytoplazmy). Kariokinezę można podzielić na: profazę następuje kondensacja chromatyny, chromosomy zaczynają być widoczne, na zewnątrz jądra tworzy się wrzeciono mitotyczne, metafazę chromosomy ustawiają się w płaszczyźnie równikowej wrzeciona, a parzyste mikrotubule przyczepiają się do przeciwległych biegunów wrzeciona, anafazę parzyste chromatydy rozdzielają się i tworzą się chromosomy potomne, które wędrują do przeciwległych biegunów komórki; następuje podział organelli, telofazę chromosomy potomne docierają do biegunów wrzeciona; odtwarzana jest otoczka jądrowa; tworzą się dwa nowe jądra. Podczas cytokinezy komórka dzielona jest na dwie części poprzez pierścień kurczliwy, zbudowany z filamentów aktyny i miozyny. Podstawowe zadania cyklu komórkowego to: dokładne podwojenie zawartości DNA w chromosomach, precyzyjne rozmieszczenie kopii DNA w genetycznie identycznych komórkach potomnych. Cytometria przepływowa Cytometria przepływowa (ang. flow cytometry) jest techniką analityczną, pozwalającą na pomiar sygnałów fluorescencji czy też światła rozproszonego przez odpowiednio naświetlone komórki. Technika ta pozwala na ocenę ilościową jak i jakościową komórek oraz ich komponentów m.in.: jąder komórkowych, mitochondriów czy kwasów nukleinowych. Badana, znakowana zawiesina komórek zasysana jest do zbiornika otoczonego przez zwężający się kanał (rys. 2). Następnie, na skutek ogniskowania hydrodynamicznego, przez komorę ogniskową ze stałą prędkością przepływa strumień pojedynczych komórek. 2

3 Komórki te są oświetlane w komorze pomiarowej wiązką promieniowania laserowego, które rozprasza się na przepływających komórkach i jednocześnie wzbudza przyłączone do komórek fluorochromy. Natężenie rozproszonego promieniowania, powstałego na skutek interakcji z pojedynczą komórką, rejestrowane jest przez fotodetektory, po czym przemieniane na impulsy elektryczne, wzmacniane i przesyłane do komputera. Rysunek 2. Schemat budowy cytometru przepływowego; źródło: [5] Rejestrowanie światła rozproszonego oraz światło pochodzące od wzbudzonego barwnika stanowią podstawowy pomiar, którego wyniki analizy dostarczają informacji o kształcie, wielkości oraz o wewnętrznych ziarnistościach badanej komórki. Rodzaj uzyskanych danych zależy od typu użytych detektorów. Detektory FS (ang. Forward Scattering) rejestrują rozproszenie zgodnie z kierunkiem wiązki laserowej (pod kątem nie przekraczającym 10 ). Detektory te dostarczają informację nt. rozmiaru cząstki rozpraszającej (natężenie jest proporcjonalne do rozmiaru cząstki rozpraszającej). Detektory SS (ang. Side Scattering) rejestrują rozproszenie pod kątem 90. Dane pochodzące z tego detektora dostarczają informacji o kształcie komórki oraz jej współczynnika załamania i odbicia światła. Na podstawie danych, pochodzących z detektorów FS i SS, można określić poszczególne cechy analizowanych komórek bądź też rozróżniać ich subpopulacje. Uzyskane wyniki można zobrazować na kilka sposobów w postaci wykresów: jednowymiarowych (histogramów), dwuwymiarowych (kropkowych gęstości) bądź też trójwymiarowych (perspektywicznych). Najpopularniejszymi z nich są dwa pierwsze (rys. 3.). 3

4 Rysunek 3. Przykładowe sposoby przedstawiania danych uzyskanych z wykorzystaniem cytometrii przepływowej: A - wykres jednowymiarowy (oś X intensywność parametru FL2-A; oś Y ilość komórek); B wykres dwuwymiarowy (komórki w prawym dolnym rogu wykresu - pozytywne dla parametru z osi X, komórki w górnym prawym rogu - dla obu parametrów; w lewym górnym rogu - pozytywne dla parametru z osi Y, w lewym dolnym rogu - podwójnie negatywne); badania własne Zespołu Chemii i Biochemii Związków Przeciwnowotworowych Cytometria przepływowa pozwala na ilościowe określenie populacji i subpopulacji komórek, ich cech morfologicznych a także stanów czynnościowych komórki. Dzięki wykorzystaniu przeciwciał monoklonalnych połączonych z barwnikami fluorescencyjnymi można np. ocenić immunofenotyp związany z obecnością antygenów na powierzchni błony komórkowej. Jedną z metod badawczych wykorzystujących technikę cytometrii przepływowej jest analiza zawartości DNA w komórkach wybarwionych jodkiem propidyny (PI). Barwnik ten, wiąże się stechiometrycznie do DNA. Na tej podstawie można określić jego zawartość w poszczególnej komórce, a tym samym oznaczyć wielkość populacji komórek w danej fazie cyklu życiowego (ilość PI związanego z komórką jest proporcjonalna do ilości DNA). PI wiąże się również z RNA, co mogłoby zafałszować badania, dlatego też w komercyjnych roztworach barwiących znajduje się RNaza A, dzięki której jodek propidyny w takich warunkach łączy się wyłącznie z DNA. Rysunek 4. A - Zmiany ilości materiału genetycznego w dzielącej się mitotycznie komórce diploidalnej; B - Histogram obrazujący zmiany w dystrybucji komórek linii H460 w cyklu życiowym po 24 godz. Oś X intensywność fluorescencji jodku propidyny określającego zawartość DNA. Oś Y ilość komórek; badania własne Zespołu Chemii i Biochemii Związków Przeciwnowotworowych 4

5 Na podstawie zawartości jądrowego DNA można określić w której fazie cyklu życiowego znajdują się komórki (rys. 4): <2n - tzw. frakcja sub-g1, charakterystyczna dla komórek apoptotycznych, 2n - komórki w fazie G1, 4n - komórki w fazie G2, mitozie lub post-mitotycznej tetraploidalnej fazie G1, >4n - komórki poliploidalne CZĘŚĆ PRAKTYCZNA Celem ćwiczenia jest zbadanie zmian w dystrybucji komórek w cyklu życiowym, poddanych ekspozycji na chemoterapeutyk, w oparciu o analizę zawartości DNA w komórkach wybarwionych jodkiem propidyny. Materiały: Sprzęt: 80% (v/v) etanol (roztwór w wodzie), komórki dowolnej linii nowotworowej rosnącej w postaci zawiesiny lub monowarstwy, PBS, PI/RNase Staining Kit (BD Pharmingen), płytki Petriego, pożywka hodowlana z dodatkiem 10% FBS i antybiotyków, trypsyna, woda redestylowana, wyjściowy roztwór badanego związku. cytometr przepływowy, inkubator CO 2, licznik komórek Coulter, mikroskop świetlny, pipety automatyczne, probówki typu falcon, rękawiczki jednorazowe, vortex, wirówka, zamrażarka. WYKONANIE ĆWICZENIA 1. Komórki będące w logarytmicznej fazie wzrostu zaszczepić na 100 mm płytkach Petriego w odpowiedniej ilości (określa Prowadzący), a następnie inkubować w atmosferze 5% CO 2 w temperaturze 37 C przez 24 godziny, celem przyklejenia się komórek do podłoża (dla komórek rosnących w postaci monowarstwy). 5

6 2. Po 24 godzinnej preinkubacji dodać badany związek, a następnie inkubować określoną długość czasu (stężenie i czas ekspozycji danego związku określa Prowadzący ćwiczenie). 3. Po zakończonej inkubacji komórek z badanym związkiem zlać pożywkę znad komórek do probówki typu falcon. Komórki przepłukać 2 ml zimnego roztworu PBS, a następnie dodać 2 ml niesterylnej trypsyny, celem odklejenia komórek od podłoża. 4. Do badań pobrać po 2 mln komórek (obliczyć ilość komórek w hodowli za pomocą licznika Coulter Counter). 5. Komórki zwirować (1000 rpm, 5 min, 4 C), a następnie zlać supernatant, przepłukać pelet 5 ml zimnego roztworu PBS i znowu wirować w tych samych warunkach. Czynność powtórzyć dwukrotnie. 6. Po ostatnim wirowaniu odessać supernatant znad komórek przy użyciu pompki wodnej. Następnie rozpipetować pelet i dodać 3 ml zimnego 80% etanolu w celu utrwalenia. Tak przygotowane próbki umieścić w -20 C na minimum 30 minut (a najlepiej na 24 godziny). 7. Po utrwaleniu zawiesinę komórek zwirować (2000 rpm, 5 min, 4 C), po czym dwukrotnie przepłukać 5 ml zimnego PBS i ponownie zwirować (1500 rpm, 5 min, 4 C). Po ostatnim wirowaniu odessać supernatant znad komórek przy użyciu pompki wodnej. 8. Wybarwić komórki 500 µl roztworu z zestawu PI/RNase Staining Kit (BD Pharmingen) i inkubować przez 15 minut w ciemności. 9. Pomiar intensywności fluorescencji emitowanej przez związany z DNA jodek propidyny prowadzić z wykorzystaniem cytometru przepływowego (według instrukcji prowadzącego). Długość fali wzbudzenia dla jodku propidyny wynosi 488 nm, emisji 617 nm. Każdorazowo analizie poddawać komórek. PRZYGOTOWANIE SPRAWOZDANIA 1. Podać cel i opisać w sposób zwięzły przebieg ćwiczenia wraz z wyjaśnieniem zasad postępowania. 2. Na podstawie otrzymanych histogramów opisać wpływ badanego chemoterapeutyku na zmiany w rozkładzie komórek w poszczególnych fazach cyklu życiowego. 3. Przedstawić graficznie procentowy udział komórek w poszczególnych fazach cyklu życiowego. 6

7 LITERATURA 1. Alberts B., Bray D., Hopkin K., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P.: Podstawy biologii komórki, Wydawnictwo PWN, Warszawa Skotny A., Pucińska J.: Współczesna cytometria przepływowa, Acta Bio-Optica et Informatica Medica, Inżynieria Biomedyczna, 2013, Vol. 19, nr Shapiro H.: Practical flow cytometry, Wydawnictwo Wiley-Liss (4th ed.), New York Kantorski J.: Podstawy cytometrii przepływowej, Central-European Journal of Immunology, Vol. 21,