Wykorzystanie metod immunocytochemicznych w diagnostyce medycznej PRAKTIKUM Z BIOLOGII KOMÓRKI (BT 206, BT 231)

Transkrypt

1 Wykorzystanie metod immunocytochemicznych w diagnostyce medycznej PRAKTIKUM Z BIOLOGII KOMÓRKI (BT 206, BT 231)

2 Wykorzystanie metod immunocytochemicznych w diagnostyce medycznej Immunocytochemia zajmuje się wykrywaniem i lokalizacją w komórkach (czy też w szerszym rozumieniu w tkankach) substancji o charakterze antygenowym, za pomocą znakowanych przeciwciał. U podstaw metod immunnocytochemicznych leży zjawisko wiązania antygenu przez swoiste i charakterystyczne przeciwciała. Takie wiązanie cechuje wysoka specyficzność, ponieważ cząsteczka przeciwciała rozpoznaje i wiąże antygen (zazwyczaj białko lub jego fragment) o ściśle określonej konfiguracji przestrzennej. Najczęściej stosowanym typem metod immunocytochemicznych są metody pośrednie, które polegają ona na stosowaniu nieznakowanego pierwszorzędowego przeciwciała wykrywającego interesujący badacza antygen, a w następnej kolejności przeciwciała drugorzędowego, które jest znakowane odpowiednim znacznikiem umożliwiającym wizualizację poszukiwanego kompleksu antygenprzeciwciało. Najczęściej stosowanymi znacznikami w tych metodach są fluorochromy lub enzymy. Znacznikami przeciwciał używanych do wykrywania antygenów w preparatach do mikroskopii elektronowej są białka zawierające metal ciężki (ferrytyna) lub metale ciężkie (zazwyczaj złoto koloidalne). Schemat metody immunocytofluorescencji pośredniej Obecnie metody immunocytochemii pośredniej stosuje się na szeroką skalę nie tylko w badaniach podstawowych biologii komórki, biochemii, biologii molekularnej (do wykrywania składników komórek, badania ich funkcji, poznawania procesów zachodzących komórkach w stanach fizjologicznych i patologicznych organizmu), ale także w medycynie i diagnostyce medycznej. Z ich pomocą można m.in. prowadzić diagnostykę obecności wielu wirusów (np. HIV, WZW), diagnostykę chorób tarczycy, ciąży i płodności, uszkodzeń mięśnia sercowego, niedokrwistości, wielu wrodzonych chorób genetycznych i chorób metabolicznych. Metody immunocytochemiczne używane są również w toksykologii i transplantologii. Dla wielu w w/w jednostek chorobowych scharakteryzowano i opisano szereg markerów (do których należą białka pełniące w komórkach różnorodne funkcje, zarówno białka strukturalne jak i funkcjonalne, np. enzymy, hormony, białka receptorowe), których detekcja w badanym materiale stanowi podstawę diagnozy medycznej. Metody immunocytochemiczne są również bardzo często wykorzystywane w diagnostyce nowotworów - określanie typu oraz stopnia zróżnicowania nowotworu cech bardzo ważnych z punktu widzenia prognostyki i wyboru metod leczenia. Jednymi z ważniejszych markerów oceny procesu nowotworzenia oraz rozsiewania komórek nowotworowych w organizmie (przerzuty nowotworowe) są białka budujące filamenty pośrednie. Filamenty pośrednie (FP) to elementy cytoszkieletu stabilizujące komórki i tkanki zwierzęce, a także determinujące lokalizację poszczególnych struktur wewnątrzkomórkowych. FP są zbudowane z wielu (specyficznych tkankowo) skręconych razem białek włóknistych i charakteryzują się dużą wytrzymałością zarówno na stres mechaniczny (zgniatanie, rozciąganie) jak i na działanie substancji chemicznych. Białka FP składają się z globularnej głowy na N-końcu łańcucha polipeptydowego, globularnego ogona 2 BT 206, BT 231

3 na C-końcu i domeny środkowej, która posiada charakter helisy α, umożliwiający dwóm filamentom owinąć się wokół siebie w strukturę superhelisy. Monomery białek FP łączą się ze sobą w dimery dzięki strukturze domeny środkowej, a dwa dimery zestawiają się tworząc dachówkowato ułożony tetrametr. Tetramery łączą się wiązaniami niekowalencyjnymi (koniec do końca i bok do boku) i tworzą ostatecznie helikalne, linopodobne FP. Obecnie, na podstawie homologii sekwencji aminokwasowej domen centralnych oraz struktury drugorzędowej białek, wyróżnia się sześć klas (typów) białek FP: Typ I - kwaśne keratyny - w nabłonkach, Typ II - obojętne/zasadowe keratyny - w nabłonkach, Typ III wimentyny i białka wimentynopodobne: wimentyny - w komórkach mezenchymalnych, desminy - w komórkach mięśniowych, GFP (glejowe białka włókienkowe) - w komórkach glejowych, Typ IV - białka neurowłókienkowe - w neuronach, Typ V laminy (grupa niespecyficzna) białka otoczki jądrowej we wszystkich komórkach jądrzastych, Typ VI - nestyna - w komórkach endodermalnych. W zasadzie każdy typ filamentów pośrednich cytoplazmatycznych jest charakterystyczny dla danej tkanki. Tę właściwość filamentów pośrednich wykorzystuje się przy lokalizacji przerzutów nowotworów. Oznaczając markery specyficzne tkankowo, m. in. białka filamentów pośrednich można wykryć obecność komórek nowotworowych w wycinkach tkankowych, a także oszacować pochodzenie danego nowotworu. Cel ćwiczenia: Wykorzystanie metod immunocytochemii pośredniej do identyfikacji komórek nowotworowych w kokulturach z komórkami prawidłowymi w hodowli in vitro (imitacja skrawków tkankowych z przerzutami komórek nowotworowych). Przebieg ćwiczenia: I. Identyfikacja filamentów pośrednich: cytokeratynowych i wimentynowych, w otrzymanych komórkach metodą pośredniej immunofluorescencji. II. Identyfikacja filamentów cytokeratynowych w otrzymanych komórkach pośrednią metodą immunoenzymatyczną. III. Porównanie przydatności obu metod do wykrywania takiego samego antygenu (cytokeratyny) IV. Oglądanie preparatów immunohistochemicznych z diagnostyki nowotworów w tkankach miękkich (wykrywanie antygenów nowotworowych) 3 BT 206, BT 231

4 Wykonanie ćwiczenia: Praca w dwuosobowych zespołach 1. Oglądnąć (w mikroskopie odwróconym) komórki wysiane na szkiełkach umieszczonych w szalkach hodowlanych. Mogą to być: mysie fibroblasty 3T3 (imitacja prawidłowej tkanki łącznej) mysie fibroblasty 3T3 w kokulturze z mysimi komórkami rakowymi np. trzustki, płuc lub jelita (imitacja prawidłowej tkanki łącznej z przerzutami nowotworowymi) 2. Każdy zespół wybiera do barwienia 4 szalki ze szkiełkami z takimi samymi komórkami (szkiełka tylko komórkami prawidłowymi lub kokulturą komórek prawidłowych i nowotworowych). 3. Dwa szkiełka należy wykorzystać do identyfikacji filamentów pośrednich: cytokeratynowych i wimentynowych metodą pośredniej immunofluorescencji jedno szkiełko należy przeznaczyć do wykrywania poszukiwanego białka metodą immunocytofluorescencji pośredniej (inkubacja utwalonych komórek kolejno z pierwszo- i drugorzędowym przeciwciałem), drugie szkiełko wykorzystać do przeprowadzenia kontroli negatywnej (inkubacja utrwalonych komórek tylko z drugorzędowym, znakowanym fluorescencyjnie przeciwciałem 4. Dwa szkiełka należy wykorzystać do identyfikacja filamentów cytokeratynowych w otrzymanych komórkach pośrednią metodą immunoenzymatyczną jedno szkiełko należy przeznaczyć do wykrywania cytokeratyny metodą immunoenzymatyczną (inkubacja utwalonych komórek kolejno z pierwszo- i drugorzędowym przeciwciałem oraz substratem), drugie szkiełko wykorzystać do przeprowadzenia kontroli negatywnej (bez inkubacji komórek z przeciwciałem przeciw cytokeratynie) I. Identyfikacja filamentów pośrednich: cytokeratynowych i wimentynowych, w otrzymanych komórkach metodą pośredniej immunofluorescencji. 1. Wybrać (każdy zespół) do barwienia 2 szkiełka z takimi samymi komórkami. 2. Zlać pożywkę z szalki znad szkiełek z komórkami i przepłukać dokładnie szkiełka roztworem PBS z jonami Ca 2+,Mg 2+ o temp. 37 C. 3. Zlać PBS i zalać komórki 3,7% roztworem formaldehydu w PBS o temp.37 C i utrwalać komórki przez 15 min w cieplarce. 4. Zlać utrwalacz znad komórek i przepłukać szkiełka 2 razy roztworem PBS. 5. Zlać PBS i zalać komórki 0.1% roztworem Tritonu X-100 i pozostawić na 7 min w temperaturze pokojowej. 6. Zlać Triton X-100 znad komórek i przepłukać szkiełka 3 razy PBS. Jedno szkiełko przeznaczyć do wykrywania poszukiwanego białka metodą immunocytofluorescencji pośredniej ( inkubacja komórek kolejno z pierwszo- i drugorzędowym przeciwciałem), drugie szkiełko z utrwalonymi komórkami pozostawićw PBS (inkubacja tylko z drugorzędowym przeciwciałem- kontrola) 4 BT 206, BT 231

5 7. Zlać PBS i zalać komórki roztworem 3% BSA (albuminy surowicy wołowej) w PBS i inkubować w temperaturze pokojowej około 15 min. 8. Przygotować komory wilgotnościowe do barwienia komórek: Małe szalki szklane umieścić w dużych szalkach wyłożonych wilgotną watą (komory wilgotnościowe), aby krople przeciwciała nie wysychały. 9. Inkubacja komórek z pierwszorzędowym przeciwciałem: Na suchą małą szalkę położyć 1 pasek parafilmu o wielkości około 2cm x 2cm, na środek każdego kawałka parafilmu nakropić 20μl pierwszego przeciwciała (przeciwciało otrzymane od asystenta jedno z poniższych) monoklonalne mysie przeciwciało przeciwko: wimentynie IgM cytokeratynie IgG (Każdy zespół wykonuje barwienie cytokeratyny i wimentyny) 10. Wyjąć szkiełko z utrwalonymi komórkami szalki z roztworu BSA w PBS, osuszyć brzegi szkiełka bibułą i położyć je na parafilmie, tak aby komórki dotykały kropli przeciwciała. Inkubować komórki z pierwszym przeciwciałem 45 min w temperaturze pokojowej. 11. Po inkubacji komórek z przeciwciałem pierwszorzędowym szkiełko umieścić w szalce wypełnionej roztworem PBS i przepłukać starannie 3 razy. 12. Inkubacja komórek z przeciwciałem drugorzędowym znakowanym fluorescencyjnie i z barwnikami fluorescencyjnymi do wybarwienia jąder komórkowych: Na szalkę położyć dwa paski parafilmu o wielkości około 2cm x 2cm i na środek każdego nakropić 20μl mieszaniny barwników (mieszanina barwników otrzymana od asystenta), która zawiera odpowiednio rozcieńczone: a) kozie przeciwciało anty-mysie IgG znakowane Alexa-488 b) przeciwciało anty-mysie IgM znakowane Alexa-546 c) roztwór barwnika Hoechst 33258, o stężeniu 500ng/ml 13. Oba barwione szkiełka z komórkami położyć kolejno na paskach parafilmu tak, aby komórki dotykały kropli mieszaniny barwników i barwić komórki 35 min, w ciemności, w temperaturze pokojowej, w szalkach wyłożonych wilgotną watą. 14. Po zakończonym barwieniu zdjąć każde ze szkiełek z parafilmu i przenieść do szalek z H 2 O destylowaną i wypłukać szkiełka starannie 5 razy. 15. Wyczyścić szkiełko podstawowe i nakropić na nie 2 razy po 10μl H 2 O destylowanej. Na krople wody nałożyć kolejno szkiełka z wybarwionymi komórkami (komórkami do wody), osuszyć brzegi szkiełek bibułą i okleić je lakierem do paznokci. 16. Tak przygotowane preparaty oglądnąć w mikroskopie fluorescencyjnym. Dla struktur barwionych: a) Hoechst 3325 światło wzbudzające: UV (max 352nm), a emisja - światło niebieskie b) Aleksa-Fluor 488: światło wzbudzenia: niebieskie (max 488 nm), a emisja światło zielone c)alexa-fluor 546: światło wzbudzenia: zielone (max 546 nm), a emisja światło czerwone 5 BT 206, BT 231

6 17. Na podstawie obserwacji komórek w wykonanych preparatach należy odpowiedzieć na pytania: Czy otrzymane do barwienia komórki stanowiły populację heterogenną (hodowlę komórek prawidłowych i nowotworowych w kokulturze)? Jeśli tak, to jaki procent populacji stanowią komórki nowotworowe (uwaga: należy skorzystać z dodatkowego barwienia jąder komórkowych)? II. Identyfikacja filamentów cytokeratynowych w otrzymanych komórkach pośrednią metodą immunoenzymatyczną. 1. Wybrać (każdy zespół) do barwienia 2 szkiełka z takimi samymi komórkami. 2. Zlać pożywkę z szalki, w której znajduje się szkiełko i przepłukać dokładnie szkiełko roztworem PBS z jonami Ca 2+,Mg 2+ o temp. 37 C. 3. Zlać PBS i zalać komórki 3,7% roztworem formaldehydu w PBS o temp.37 C i utrwalać komórki przez 15 min w cieplarce. 4. Zlać utrwalacz znad komórek i przepłukać szkiełka 3 razy roztworem PBS. 5. Zlać PBS i zalać komórki 0.1% roztworem Tritonu X-100 i pozostawić na 7 min w temperaturze pokojowej. 6. Zlać Triton X-100 znad komórek i przepłukać szkiełka 2 razy PBS. Zalać komórki 1 ml roztworu 0,1% H 2 O 2 i inkubować komórki przez 5 minut. 7. Zlać wodę utlenioną i przepłukać trzykrotnie PBS 8. Zlać PBS i zalać komórki roztworem 1% BSA (albuminy surowicy wołowej) w PBS i inkubować w temperaturze pokojowej około 10 min. 9. Przygotować komory wilgotnościowe do barwienia komórek: Małe szalki szklane umieścić w dużych szalkach wyłożonych wilgotną watą (komory wilgotnościowe), aby krople przeciwciała nie wysychały. 10. Inkubacja komórek z pierwszorzędowym przeciwciałem: Na suchą małą szalkę położyć 1 pasek parafilmu o wielkości około 2cm x 2cm, na środek kawałka parafilmu nakropić 20μl pierwszego przeciwciała (przeciwciało otrzymane od asystenta monoklonalne mysie przeciwciało przeciwko cytokeratynie). Wyjąć szkiełko z utrwalonymi komórkami szalki z roztworu BSA w PBS, osuszyć brzegi szkiełka bibułą i położyć je na parafilmie, tak aby komórki dotykały kropli przeciwciała. Inkubować komórki z pierwszym przeciwciałem 35 min w temperaturze pokojowej. 11. Po inkubacji komórek z przeciwciałem pierwszorzędowym szkiełko umieścić w szalce wypełnionej roztworem PBS i przepłukać starannie 3 razy. 12. Inkubacja komórek z przeciwciałem drugorzędowym sprzężone z peroksydazą (przeciwciało przeciwko mysim IgG sprzężone z enzymem). 6 BT 206, BT 231

7 Na szalkę położyć pasek parafilmu o wielkości około 2cm x 2cm i na środek nakropić 15 μl roztworu przeciwciała: kozie przeciwciało anty-mysie IgG znakowane HRP (HRP-conjugated anti-mouse IgG antibody) Szkiełka z komórkami położyć na parafilmie tak, aby komórki dotykały kropli przeciwciała i barwić komórki 30 min, w ciemności, w temperaturze pokojowej, w szalkach wyłożonych wilgotną watą. 13. Po zakończonym barwieniu zdjąć każde ze szkiełek z parafilmu i przenieść do szalek z PBS i wypłukać szkiełka starannie 3 razy. 14. Przygotować substrat dla peroksydazy. Pomieszać 0,2 ml CN/DAB Solution (10X) z 1,8 ml buforu Stable Peroxide Substrate Solution (1X). DAB (3,3 diaminobenzydyna), zmieszana z 4CN (4-chloro-1-naftolem) dają w obecności HRP i H 2 O 2 czarny nierozpuszczalny produkt. Miejsca, gdzie związało się przeciwciało drugorzędowe staną się czarne. 15. Inkubować 7-10 minut, aż szkiełko zabarwi się na czarno. 16. Po zakończonym barwieniu wypłukać szkiełka starannie 3 razy PBS. 17. Zalać szkiełka roztworem hematoksyliny inkubować 1 minutę, a następnie przepłukać szkiełka 3 razy wodą z kranu. 18. Wyczyścić szkiełko podstawowe i nakropić na nie 2 razy po 10μl H 2 O. Na krople wody nałożyć kolejno szkiełka z wybarwionymi komórkami (komórkami do wody), osuszyć brzegi szkiełek bibułą i okleić je lakierem do paznokci. 19. Tak przygotowane preparaty oglądnąć w mikroskopie jasnego pola. Temat referatu: Zagadnienia: Wykorzystanie metod immunocytochemicznych w diagnostyce medycznej Typy tkanek ssaków i współdziałanie komórek w tkankach. Przyczyny i mechanizmy powstawania i rozprzestrzeniania nowotworów (przerzuty). Specyficzność tkankowa filamentów pośrednich w komórkach. Metody immunocytochemiczne w diagnostyce nowotworów. Zalecana literatura: B. Alberts i inni. Podstawy Biologii Komórki, PWN 2005; rozdz. 21. B. Alberts et al. Molecular biology of the cell; 5th edition Red. M. Zabel Immunocytochemia, PWN Red. I. Kątnik-Prastowska Immunochemia w biologii medycznej, PWN BT 206, BT 231