Wykorzystanie metod immunocytochemicznych w diagnostyce medycznej PRAKTIKUM Z BIOLOGII KOMÓRKI (BT 206, BT 231)

Transkrypt

1 Wykorzystanie metod immunocytochemicznych w diagnostyce medycznej PRAKTIKUM Z BIOLOGII KOMÓRKI ()

2 Wykorzystanie metod immunocytochemicznych w diagnostyce medycznej Immunocytochemia zajmuje się wykrywaniem i lokalizacją w komórkach (czy też w szerszym rozumieniu w tkankach) substancji o charakterze antygenowym, za pomocą znakowanych przeciwciał. U podstaw metod immunnocytochemicznych leży zjawisko wiązania antygenu przez swoiste i charakterystyczne przeciwciała. Takie wiązanie cechuje wysoka specyficzność, ponieważ cząsteczka przeciwciała rozpoznaje i wiąże antygen (zazwyczaj białko lub jego fragment) o ściśle określonej konfiguracji przestrzennej. Najczęściej stosowanym typem metod immunocytochemicznych są metody pośrednie, które polegają ona na stosowaniu nieznakowanego pierwszorzędowego przeciwciała wykrywającego interesujący badacza antygen, a w następnej kolejności przeciwciała drugorzędowego, które jest znakowane odpowiednim znacznikiem umożliwiającym wizualizację poszukiwanego kompleksu antygenprzeciwciało. Najczęściej stosowanymi znacznikami w tych metodach są fluorochromy lub enzymy. Znacznikami przeciwciał używanych do wykrywania antygenów w preparatach do mikroskopii elektronowej są białka zawierające metal ciężki (ferrytyna) lub metale ciężkie (zazwyczaj złoto koloidalne). Schemat metody immunocytofluorescencji pośredniej Obecnie metody immunocytochemii pośredniej stosuje się na szeroką skalę nie tylko w badaniach podstawowych biologii komórki, biochemii, biologii molekularnej (do wykrywania składników komórek, badania ich funkcji, poznawania procesów zachodzących komórkach w stanach fizjologicznych i patologicznych organizmu), ale także w medycynie i diagnostyce medycznej. Z ich pomocą można m.in. prowadzić diagnostykę obecności wielu wirusów (np. HIV, WZW), diagnostykę chorób tarczycy, ciąży i płodności, uszkodzeń mięśnia sercowego, niedokrwistości, wielu wrodzonych chorób genetycznych i chorób metabolicznych. Metody immunocytochemiczne używane są również w toksykologii i transplantologii. Dla wielu w w/w jednostek chorobowych scharakteryzowano i opisano szereg markerów (do których należą białka pełniące w komórkach różnorodne funkcje, zarówno białka strukturalne jak i funkcjonalne, np. enzymy, hormony, białka receptorowe), których detekcja w badanym materiale stanowi podstawę diagnozy medycznej. Metody immunocytochemiczne są również bardzo często wykorzystywane w diagnostyce nowotworów - określanie typu oraz stopnia zróżnicowania nowotworu cech bardzo ważnych z punktu widzenia prognostyki i wyboru metod leczenia. Jednymi z ważniejszych markerów oceny procesu nowotworzenia oraz rozsiewania komórek nowotworowych w organizmie (przerzuty nowotworowe) są białka budujące filamenty pośrednie. Filamenty pośrednie (FP) to elementy cytoszkieletu stabilizujące komórki i tkanki zwierzęce, a także determinujące lokalizację poszczególnych struktur wewnątrzkomórkowych. FP są zbudowane z wielu (specyficznych tkankowo) skręconych razem białek włóknistych i charakteryzują się dużą wytrzymałością zarówno na stres mechaniczny (zgniatanie, rozciąganie) jak i na działanie substancji chemicznych. Białka FP składają się z globularnej głowy na N-końcu łańcucha polipeptydowego, globularnego ogona 2

3 na C-końcu i domeny środkowej, która posiada charakter helisy α, umożliwiający dwóm filamentom owinąć się wokół siebie w strukturę superhelisy. Monomery białek FP łączą się ze sobą w dimery dzięki strukturze domeny środkowej, a dwa dimery zestawiają się tworząc dachówkowato ułożony tetrametr. Tetramery łączą się wiązaniami niekowalencyjnymi (koniec do końca i bok do boku) i tworzą ostatecznie helikalne, linopodobne FP. Obecnie, na podstawie homologii sekwencji aminokwasowej domen centralnych oraz struktury drugorzędowej białek, wyróżnia się sześć klas (typów) białek FP: Typ I - kwaśne keratyny - w nabłonkach, Typ II - obojętne/zasadowe keratyny - w nabłonkach, Typ III wimentyny i białka wimentynopodobne: wimentyny - w komórkach mezenchymalnych, desminy - w komórkach mięśniowych, GFP (glejowe białka włókienkowe) - w komórkach glejowych, Typ IV - białka neurowłókienkowe - w neuronach, Typ V laminy (grupa niespecyficzna) białka otoczki jądrowej we wszystkich komórkach jądrzastych, Typ VI - nestyna - w komórkach endodermalnych. W zasadzie każdy typ filamentów pośrednich cytoplazmatycznych jest charakterystyczny dla danej tkanki. Tę właściwość filamentów pośrednich wykorzystuje się przy lokalizacji przerzutów nowotworów. Oznaczając markery specyficzne tkankowo, m. in. białka filamentów pośrednich można wykryć obecność komórek nowotworowych w wycinkach tkankowych, a także oszacować pochodzenie danego nowotworu. Cel doświadczenia: Celem ćwiczenia jest wykorzystanie metod immunocytofluorescencji do identyfikacji komórek nowotworowych w kokulturach z komórkami prawidłowymi (w hodowlach in vitro).. Przebieg doświadczenia: (Praca w trzech zespołach) 1. Oglądnąć w mikroskopie odwróconym komórki wysiane na szkiełkach umieszczonych w szalkach hodowlanych trzy różne rodzaje hodowli komórkowych (zestawy nr 1-3). 2. Wybrać (każdy zespół) do barwienia 4 szkiełka z takimi samymi komórkami (jeden zestaw). 3. Zlać pożywkę z szalek znad szkiełek z komórkami i przepłukać dokładnie szkiełka roztworem PBS z jonami Ca 2+ i Mg 2+, o temp. 37 C. 4. Zlać PBS i zalać komórki 3,7% roztworem formaldehydu w PBS o temp.37 C i utrwalać komórki przez 15 min w cieplarce. 5. Zlać utrwalacz znad komórek i przepłukać szkiełka 2 razy roztworem PBS. 6. Zlać PBS i zalać komórki 0.1% roztworem Tritonu X-100 i pozostawić na 7 min w temperaturze pokojowej. 3

4 7. Zlać Triton X-100 znad komórek i przepłukać szkiełka 3 razy PBS. Dwa szkiełka przeznaczyć do wykrywania poszukiwanych białek metodą immunofluorescencji pośredniej (inkubacja komórek kolejno z pierwszo- i drugorzędowym przeciwciałempozostałe dwa szkiełka z utrwalonymi komórkami pozostawić w PBS (inkubacja tylko z drugorzędowym przeciwciałem- kontrola) 8. Zlać PBS i zalać komórki roztworem 3% BSA (albuminy surowicy wołowej) w PBS i inkubować w temperaturze pokojowej około 15 min. 9. Przygotować komory wilgotnościowe do barwienia komórek: Małe szalki szklane umieścić w dużych szalkach wyłożonych wilgotną watą (komory wilgotnościowe), aby krople przeciwciała nie wysychały. 10. Inkubacja komórek z pierwszorzędowym przeciwciałem: Na suchą małą szalkę położyć pasek parafilmu o wielkości około 2cm x 2cm, na środek każdego kawałka parafilmu nakropić 20µl pierwszego przeciwciała (przeciwciało otrzymane od asystenta jedno z poniższych): monoklonalne mysie przeciwciało przeciwko: wimentynie IgM cytokeratynie IgG; (Każdy zespół wykonuje barwienie cytokeratyny i wimentyny). 11. Wyjąć szkiełko z utrwalonymi komórkami szalki z roztworu BSA w PBS, osuszyć brzegi szkiełka bibułą i położyć je na parafilmie, tak aby komórki dotykały kropli przeciwciała. Inkubować komórki z pierwszym przeciwciałem 45 min w temperaturze pokojowej. 12. Po inkubacji komórek z przeciwciałem pierwszorzędowym szkiełko umieścić w szalce wypełnionej roztworem PBS i przepłukać starannie 3 razy. 13. Inkubacja komórek z przeciwciałem drugorzędowym znakowanym fluorescencyjnie i z barwnikami fluorescencyjnymi do wybarwienia jąder komórkowych: Na szalkę położyć dwa paski parafilmu o wielkości około 2cm x 2cm i na środek każdego nakropić 20µl mieszaniny barwników (mieszanina barwników otrzymana od asystenta), która zawiera odpowiednio rozcieńczone: kozie przeciwciało anty-mysie IgG znakowane Alexa-488 przeciwciało anty-mysie IgM znakowane Alexa-546 roztwór barwnika Hoechst 33258, o stężeniu 500ng/ml 14. Wybarwione szkiełka z komórkami położyć kolejno na paskach parafilmu tak, aby komórki dotykały kropli mieszaniny barwników i barwić komórki 35 min, w ciemności, w temperaturze pokojowej, w szalkach wyłożonych wilgotną watą. 15. Po zakończonym barwieniu zdjąć każde ze szkiełek z parafilmu i przenieść do szalek z H 2 O destylowaną i wypłukać szkiełka starannie 5 razy. 16. Wyczyścić szkiełko podstawowe i nakropić na nie 2 razy po 10µl H 2 O destylowanej. Na krople wody nałożyć kolejno szkiełka z wybarwionymi komórkami (preparat własciwy i kontrola), osuszyć brzegi szkiełek bibułą i okleić je lakierem do paznokci. 17. Tak przygotowane preparaty oglądnąć w mikroskopie fluorescencyjnym. Dla struktur barwionych: Hoechst światło wzbudzające: 4

5 UV (max 352nm), a emisja - światło niebieskie Aleksa-Fluor 488:światło wzbudzenia: niebieskie (max 488 nm), a emisja światło zielone Aleksa-Fluor 546: światło wzbudzenia: zielone (max 546 nm), a emisja światło czerwone 18. Na podstawie obserwacji fluorescencji komórek w wykonanych preparatach należy odpowiedzieć na pytania: Jakie są różnice w wyglądzie wybarwionych elementów cytoszkieletu? Czy otrzymane do barwienia komórki stanowiły heterogenną populację komórek tego samego typu czy kokulturę różnych typów komórek? Jakie jest pochodzenie tkankowe poszczególnych typów komórek? 19. Na podstawie analizowanych obrazów fluorescencyjnych (obecności lub braku filamentów cytokeratynowych i/lub wimentynowych w komórkach) ocenić ekspresję określonego typu filamentów i procent komórek nowotworowych w kokulturze (uwaga: należy skorzystać z barwienia jąder komórkowych). 20. Porównać fluorescencyjne obrazy tak samo barwionych komórek w różnych zespołach. Temat referatu: Zagadnienia: Wykorzystanie metod immunocytochemicznych w diagnostyce medycznej Typy tkanek ssaków i współdziałanie komórek w tkankach. Przyczyny i mechanizmy powstawania i rozprzestrzeniania nowotworów (przerzuty). Specyficzność tkankowa filamentów pośrednich w komórkach. Metody immunocytochemiczne w diagnostyce nowotworów. Zalecana literatura: B. Alberts i inni. Podstawy Biologii Komórki, PWN 2005; rozdz. 21. B. Alberts et al. Molecular biology of the cell; 5th edition Red. M. Zabel Immunocytochemia, PWN Red. I. Kątnik-Prastowska Immunochemia w biologii medycznej, PWN