WYKORZYSTANIE TECHNIKI ZAPŁODNIENIA

Transkrypt

1 WYKORZYSTANIE TECHNIKI ZAPŁODNIENIA IN VITRO DO OCENY JAKOŚCI NASIENIA ŻUBRA P.Pawlak, M.Świątek, K.Braun, M.Giertych, N.Reńska, M.Zajączkowska, M.Zgoła Koło Naukowe Zootechników Sekcja Biotechnologii Rozrodu Zwierząt Opiekun: dr hab. Dorota Cieślak Uczelniane sympozjum Kół Naukowych, Akademia Rolnicza w Poznaniu,

2 Charakterystyka populacji żubra (Bison bonasus) w Puszczy Białowieskiej 1. Liczebność rok zwierząt, rok 1919 ginie ostatni żubr w puszczy, rok , zwierząt 2. Wysoki poziom inbredu wpływa niekorzystnie na rozród i zdrowotność zwierząt (obecna populacja zwierząt wywodzi się od 12 założycieli) 3. Inicjatywa utworzenia banku nasienia żubra pochodzącego od samców objętych programem corocznych odstrzałów selekcyjnych (nasienie pobrane post mortem z najądrzy, mrożone) PAN Olsztyn, SSGW Warszawa

3 Liczebność Żubra na Świecie i w Polsce (2003) W tym: W stadach wolnych 664 Świat 3053 Polska 828 (27%) W rezerwatach hodowlanych 121 W zoo i ogrodach pokazowych - 43

4 Cel badań Ocena jakości nasienia żubra pozyskanego z najądrzy post mortem poprzez określenie: udziału plemników żywych, prawidłowych morfologicznie oraz posiadających funkcjonalną błonę komórkową zdolności zapładniającej plemników żubra w warunkach heterologicznego zapłodnienia in vitro

5 Materiał i metody 10 słomek mrożonego nasienia żubra pobranego post mortem z najądrzy różnych samców rozmrożenie nasienia barwienie mieszaniną eozyny z nigrozyną (EN) przepłukanie i użycie do inseminacji oocytów krowy dojrzałych in vitro test hipoosmotyczny pęcznienia plemników (HOS) ocena zygot w stadium przedjądrzy ocena rozwoju zarodków hybrydowych

6 A A B Barwienie mieszaniną eozyny i nigrozyny (EN) Ocena żywotności plemników (A - żywy, B - martwy) oraz procentu plemników zmienionych morfologicznie Nigrozyna wybarwia tło preparatu natomiast eozyna wnika przez uszkodzoną błonę komórkową do wnętrza główki plemnika barwiąc ją na czerwono. Plemniki oceniano w mikroskopie świetlnym

7 Barwienie EN wyniki 1. Z nasienia pozyskanego z każdej słomki wykonywano 2-3 rozmazy 2. Obliczeniami objęto plemników na każdym preparacie, do których odnoszono liczbę komórek żywych i zmienionych morfologicznie 3. Procent komórek żywych wahał się od 21.0% do 32.7%, ze średnią równą 28.8% 4. Udział plemników zmienionych morfologicznie wyniósł średnio 16%. Najczęściej obserwowaną wadą morfologiczną była obecność kropli cytoplazmatycznej. W kilku przypadkach zanotowano plemniki z podwójną wstawką.

8 A B Przykłady plemników o nieprawidłowej budowie morfologicznej A plemnik z podwójna wstawką, B plemnik z kroplą cytoplazmatyczną

9 Hipoosmotyczny test pęcznienia plemników Inkubacja plemników w roztworze o niższym niż wewnątrz komórki ciśnieniu osmotycznym (100mOsm) powoduje migrację wody do plemnika i wyrównanie stężeń (pęcznienie witki połączone z jej skręceniem) Pozytywny wynik testu świadczy o ciągłości i funkcjonalności błony komórkowej. Plemniki oceniano w mikroskopie świetlnym

10 Test HOS wyniki µl nasienia pozyskanego z każdej słomki poddano inkubacji w roztworze hipoosmotycznym (50 minut) po czym wykonywano 2 preparaty 2. Obliczeniami objęto plemników na każdym preparacie, do których odnoszono liczbę plemników o funkcjonalnej błonie (ze zwiniętymi witkami) 3. Średni procent plemników ze zwiniętymi witkami wyniósł 26.6%

11 Zapłodnienie heterologiczne (zarodki hybrydowe) bydło domowe żubr europejski żubroń 1. Wykorzystanie oocytów innego gatunku niż dawca nasienia 2. Gatunki odległe filogenetycznie barierę stanowią receptory ZP3 na osłonce przejrzystej oocytu (po usunięciu ZP dochodzi do penetracji i powstania przedjądrzy) 3. Gatunki bliskie filogenetycznie dochodzi do penetracji oocytów, formowania przedjądrzy i pełnego rozwoju zarodkowo-płodowego

12 Ocena zdolności zapładniaj adniającej plemników (udział zygot w stadium przedjądrzy 18 godzin po inseminacji) Zygoty nanoszono na szkiełko podstawowe i utrwalano w EtOH, a następnego dnia wybarwiano barwnikiem fluorescencyjnym Hoechst Preparaty oceniano w mikroskopie fluorescencyjnym

13 Ocena zygot w stadium przedjądrzy drzy - wyniki Ogółem wykonano preparaty z 54 zygot Sygnał fluorescencyjny zaobserwowano w 21 zygotach (38,9%) Przedjądrza zlokalizowano w 9 spośród 21 wybarwionych zygot (33%) 7 zygot - układ prawidłowy - 2 przedjądrza 2 zygoty - stwierdzono polispermię

14 A B B Ocena skuteczności zapłodnienia oocytów bydlęcych przez plemniki żubra A zygota z 2 ciałkami kierunkowymi B zygota prawidłowa (2 przedjądrza)

15 A B A zygota nieprawidłowa (polispermia,7 przedjądrzy) B zygota nieprawidłowa (3 przedjądrza)

16 Stadia przedimplantacyjnego rozwoju zarodków bydła w warunkach in vitro 2-7 dni po inseminacji (dpi) oocytów 50 m 50 m 2-bl (2 dpi) 6-8bl (3 dpi) 50 m morula (5 dpi) 50 m wyrośnięta blastocysta (7dpi)

17 Pozyskiwanie zarodków w hybrydowych wyniki Rozwój zarodkowy (proces bruzdkowania) podejmowało zaledwie 20% (90/450) inseminowanych oocytów (w przypadku buhaja 60-70%), większość zarodków degenerowała przed osiągnięciem stadium 8-16 blastomerów. Nieliczne (2 zarodki na 90) osiągnęły stadium wczesnej moruli wykazując liczne zaburzenia morfologii

18 100µm Zarodki hybrydowe, 2 dzień po inseminacji (pi) stadium 2-blastomerowe ( ciałka kierunkowe)

19 A 100µm B Zarodki hybrydowe, 3 dzień po inseminacji (pi) A) stadium 3-4-blastomerowe B) stadium 5-6-blastomerowe (widoczna wakuolizacja cytoplazmy)

20 100µm Zarodki hybrydowe, 5 dzień pi blastomerów, komórki luźno ułożone, brak kompakcji, blastomer wcześniej zahamowany w rozwoju

21 Podsumowanie 1. Najądrzowe nasienie żubrów analizowane w niniejszej pracy charakteryzowało się wyższą częstością występowania zmian morfologicznych (16%) w porównaniu z ejakulowanym nasieniem żubra (10.7%) 2. Również procenty plemników żywych (28.8%) oraz posiadających funkcjonalną błonę komórkową (26.6%) były niższe w porównaniu z nasieniem ejakulowanym (44.5%). 3. Niski procent zygot hybrydowych podejmujących rozwój zarodkowy (20%) z jednej strony może świadczyć o obniżonej jakości nasienia pochodzącego z najądrzy (nasienie ejakulowane 63%), a z drugiej o konieczności optymalizacji warunków konserwacji nasienia oraz inseminacji oocytów i hodowli zarodków in vitro

22 Podziękowania 1. Dr hab. Zygmunt Giżejewski Stacja badawcza PAN Popielno, Instytut Rozrodu Zwierząt i Badań Żywności PAN Olsztyn (pobieranie nasienia z najądrzy, ocena, mrożenie, współtwórca idei utworzenia banku nasienia żubra) 2. Dr hab. Wanda Olech-Piasecka SGGW Warszawa, główny koordynator hodowli żubrów w Polsce, współtwórca idei utworzenia banku nasienia żubra 3. Badania prowadzone w ramach tematu badań własnych WHiBZ nr 373/Z/34/W