Metody chromatograficzne w chemii i biotechnologii, wykład 3 Łukasz Berlicki
Rozdział chromatograficzny Przepływ Faza ruchoma mieszanina Faza stacjonarna
Chromatografia cieczowa adsorbcyjna Faza stacjonarna: Ciało stałe -> chromatografia adsorbcyjna Faza ruchoma: Ciecz -> chromatografia cieczowa
Układy chromatograficzne Układ faz normalnych (normal phase): Faza stacjonarna jest bardziej polarna niż faza ruchoma Układ faz odwróconych (reverse phase): Faza stacjonarna jest mniej polarna niż faza ruchoma
Układ faz normalnych Faza stacjonarna: Sole nieorganiczne: krzemian magnezu, węglan magnezu, węglan wapnia Tlenki nieorganiczne: tlenek krzemu - żel krzemionkowy, krzemionka, tlenek glinu alumina, tlenek cyrkonu, tlenek tytanu, tlenek magnezu
Żel krzemionkowy Otrzymywanie Z wodnego roztworu krzemianu sodu Na 2 SiO 3 + HCl SiO 2 * H 2 O + NaCl Z alkoholanu krzemu Si(OEt) 4 + EtOH + NH 4 OH SiO 2 * H 2 O
Żel krzemionkowy Zalety Bardzo popularny Najtańszy Szerokie zastosowanie Wady Wrażliwy na wysokie ph (ph>8) Wrażliwy na wysokie stężenia alkoholu lub wodę
Żel krzemionkowy Struktura
Żel krzemionkowy Powierzchnia
Żel krzemionkowy porowatość 50 %; S = 150 m 2 /g porowatość 70%; S = 300 m 2 /g
Żel krzemionkowy Skala mesh liczba oczek w sicie na cal bieżący 230 mesh = 63 mm 70 mesh = 200 mm
Żel krzemionkowy Kolumny do chromatografii Flash Wielkość ziarna: 15, 30 50 mm Wielkość porów: 60 Å Powierzchnia: 500 m 2 /g Stabilność ph: 1.5 6.5 Ciśnienie do 22 bar
Żel krzemionkowy Kolumny do HPLC: Nazwa Producent wielkość ziarna Wielkość porów Powierzchnia (μm) (Å) (m 2 /g) ACE ACT 3, 5, 10 100 300 Chromolith Merck Cosmosil Nacalai Tesque 3, 5 120 300 Exsil Grace Davison 3, 5, 10 100 200 Genesis Thermo Scientific 4, 7, 15 120 170 Hypersil GOLD Silica Thermo Scientific 1.9, 3, 5 175 220 Inertsil GL Sciences 3, 5 100 450 Kromasil Eka Chemicals 1 3.5, 5, 7, 10 60, 100 540, 320 LiChrosorb Merck 5, 10 60, 100 490, 300 LiChrospher Merck 5 60, 100 700, 400 NUCLEODUR - Macherey-Nagel 3, 5, 10 110 340 NUCLEOSIL Macherey-Nagel 3, 5, 10 100, 120 350, 200
Żel krzemionkowy Wielkość ziarna - ciśnienie p = f u xηl πr 2 d p 2 f czynnik opisujący kształt ziaren h lepkość r promień kolumny
Kolumny monolityczne Jednorodne kawałki żelu krzemionkowego Makropory 2 mm Mezopory 13 nm Powierzchnia ok. 300 m 2 /g Porowatość 80%
Kolumny monolityczne
Kolumny monolityczne
Kolumny monolityczne Zalety: Zwiększona przepuszczalność dla rozpuszczalników Mniejsza wysokość półki teoretycznej Selektywność podobna do pakowanych kolumn Możliwe wyższe przepływy
Żel krzemionkowy
Żel krzemionkowy Substancja rozdzielana wymienia cząsteczki rozpuszczalnika na powierzchni krzemionki Siła elucji zależy od zdolności rozpuszczalnika do tworzenia wiązań wodorowych (z krzemionką)
Rozpuszczalniki odpowiednia lepkość, kompatybilność z detektorem, dostępność o czystości wymaganej w chromatografii, mała toksyczność, niski koszt, brak reaktywności z fazą stacjonarną i analitami.
Rozpuszczalniki Rozpuszczalniki można uporządkować zgodnie z ich siłą elucji, która wyrażona jest parametrem e 0 Siła elucji charakteryzuje energię oddziaływania rozpuszczalnika z faza stacjonarną e 0 = 0 przyjęto dla oddziaływania pentanu z adsorbentem Siła elucji jest proporcjonalna do polarności rozpuszczalnika Siła elucji zależy od adsorbentu: ε 0 (SiO 2 ) = 0.77*ε 0 (Al 2 O 3 ) ε 0 (MgO) = 0.58*ε 0 (Al 2 O 3 )
Rozpuszczalniki
Rozpuszczalniki Mieszaniny rozpuszczalników o sile elucji e 0 = 0.4 na żelu krzemionkowym: 40 % tetrahydrofuranu w heksanie, 50 % octanu etylu w heksanie, 15 % izopropanolu w heksanie, 50 % octanu etylu dichlorometanie.
Rozpuszczalniki Współczynnik retencji jest zależny od składu fazy ruchomej: log k = c - n log (% B) %B zawartość rozpuszczalnika bardziej polarnego Im więcej składnika polarnego tym mniejszy współczynnik retencji.
Żel krzemionkowy Przykłady Który związek będzie eluowany pierwszy w układzie faz normalnych: A) kwas benzoesowy i bezoesan metylu B) alkohol benzylowy i eter benzylowo-metylowy C) o-nitrofenol i p-nitrofenol
Modyfikowany żel krzemionkowy
Modyfikowany żel krzemionkowy Związana faza stacjonarna
Modyfikowany żel krzemionkowy Pochodne z grupami metylowymi są wrażliwe na niskie ph Grupy izobutylowe zwiększają stabilność w niskim ph
Modyfikowany żel krzemionkowy Podwójne przyłączenie grup siloksanowych powoduje ich stabilność w zakresie ph 2-11.5
Układ faz odwróconych Faza ruchoma jest bardziej polarna niż faza stacjonarna Najbardziej typowym przykładem fazy stacjonarnej jest C18
Układ faz odwróconych Modyfikacje żelu krzemionkowego Rodzaj modyfikacji Grupa funkcyjna Skrót n-alkany -CH 2 CH 3 C2 -CH 2 (CH 2 ) 2 CH 3 -CH 2 (CH 2 ) 6 CH 3 -CH 2 (CH 2 ) 16 CH 3 C4 C8 C18 fenyl -CH 2 (CH 2 ) n C 6 H 5 Fenylowa cyjanopropyl -CH 2 (CH 2 ) 2 CN cyjanowa perfluoroalkan -CH 2 (CF 2 ) n CF 3 amid -CH 2 (CH 2 ) 2 NHCO(CH 2 ) n CH 3
Układ faz odwróconych Sposób otrzymywania modyfikowanego żelu krzemionkowego ma bardzo duży wpływ na retencję Współczynniki retencji toluenu i etylobenzenu dla różnych faz C18.
Układ faz odwróconych Eluenty: woda i rozpuszczalnik organiczny mieszający się z wodą Rozpuszczalnik Absorbcja światła [nm] Współczynnik załamania światła Lepkość Woda 190 1.333 1 100 Metanol 205 1.3284 0.55 64.7 Acetonitryl 190 1.3441 0.38 81.6 tetrahydrofuran 212 1.4072 0.55 66.0 Temperatura wrzenia [ o C]
Układ faz odwróconych Najbardziej polarny rozpuszczalnik woda ma najmniejszą siłę elucji. (1) Metanol (2) Metanol/woda, 9/1 (3) Metanol/woda, 8/2 H(CH 2 ) n COOMe C n H 2n+2 PhC n H 2n+1
Układ faz odwróconych Używanie wody bez dodatku rozpuszczalnika organicznego może zaburzyć strukturę fazy stacjonarnej Typowo chromatografię prowadzi się od 10% AcCN do 90% AcCN
Układ faz odwróconych Substancje kwaśne lub zasadowe Równowaga kwasowo-zasadowa zaburza proces chromatograficzny k = k 0 + k 1 1 + K a H + K a H + k współczynnik retencji k 0 współczynnik retencji formy uprotonowanej (neutralnej) k 1 współczynnik retencji formy zjonizowanej K a stała dysocjacji kwasu
Układ faz odwróconych ph = 2.5 1- kwas 2-nitrobenzoesowy 2 kwas ftalowy 3 * 4 kwas 2-fluorobenzoesowy 5 kwas 3-cyjanobenzoesowy 6 - kwas 2-chlorobenzoesowy 7 kwas 3-nitrobenzoesowy 8 kwas 3-fluorobenzoesowy 9 kwas 2,6-dimetylobenzoesowy ph = 3.0 ph = 3.5 ph = 4.0
Układ faz odwróconych Aby uniknąć problemów z równowagami kwasowozasadowymi do eluentów można dodać się silnego kwasu organicznego. Typowo 0.05% kwasu trifluorooctowego. pk a = 0.23
Podsumowanie Najczęściej stosowane fazy stacjonarne to: żel krzemionkowy i C18. W zależności od rodzaju substancji rozdzielanych można użyć układu faz normalnych lub odwróconych.