Wysokosprawna chromatografia cieczowa instrukcja do ćwiczenia.

Wysokosprawna chromatografia cieczowa instrukcja do ćwiczenia. Dr inż. Andrzej Wasik, Katedra Chemii Analitycznej, Wydział Chemiczny, Politechnika Gdańska wasia@chem.pg.gda.pl Instrukcja dostępna on-line (http://www.pg.gda.pl/~wasia/hplc/instrukcja_hplc_2011.pdf) Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z analizą jakościową i ilościową wykonywaną za pomocą techniki HPLC. W pierwszej części ćwiczenia studenci będą wyznaczać optymalny przepływ fazy ruchomej, obliczać sprawność kolumny chromatograficznej, symetrię piku i rozdzielczość. Następnie, na podstawie uzyskanych chromatogramów, wyznaczą kolejność elucji związków (substancji o wysokiej mocy słodzącej) w mieszaninie. Na podstawie uzyskanych widm UV studenci wybiorą optymalną długość fali do detekcji, po czym sprawdzą wpływ zawartości rozpuszczalnika organicznego w fazie ruchomej na retencję analitów. W drugiej części ćwiczenia studenci mają za zadanie wyznaczyć krzywe kalibracyjne dla badanych substancji i oznaczyć ich zawartość w próbce napoju. Zagadnienia do przygotowania: - podział metod chromatograficznych, - co to jest retencja (R), czas retencji (t R ), objętość retencji (V R ), - kształt piku, - co to jest współczynnik retencji k, - jak wyznaczyć czas retencji substancji nie zatrzymywanej na kolumnie, - co to jest sprawność kolumny chromatograficznej, jak ją wyznaczyć i od czego zależy, - co oznacza termin półka teoretyczna, wysokość równoważna półce teoretycznej, - narysować zależność wysokości półki teoretycznej H od prędkości przepływu fazy ruchomej, - jak wyznaczyć rozdzielczość kolumny, - fazy stacjonarne w chromatografii cieczowej, - detektory w chromatografii cieczowej, - elucja izokratyczna i gradientowa, - chromatografia w odwróconym układzie faz, - analiza jakościowa i ilościowa w chromatografii cieczowej. Literatura uzupełniająca 1. Z. Witkiewicz, Podstawy chromatografii, WNT, 1992, 2005. 2. Wysokosprawna chromatografia cieczowa; Chemiczna analiza instrumentalna - ćwiczenia ; http://www.mcm.ar.krakow.pl/uploads/documents/hplc%20instrukcja.pdf 3. M. Kamiński, materiały dydaktyczne, Podstawowe pojęcia i parametry opisujące układy

chromatograficzne. http://www.pg.gda.pl/chem/dydaktyka/analityczna/n_tech_anal/chroma~1.pdf 4. Książka: Chromatografia cieczowa, praca zbiorowa pod redakcją M. Kamińskiego, CEEAM, Gdańsk, 2004; http://www.pg.gda.pl/chem/dydaktyka/analityczna/lc/lc.htm Wstęp Chromatografia jest bardzo rozpowszechnioną techniką instrumentalną wykorzystywaną w chemii analitycznej, a w analizie związków organicznych zajmuje pozycję wiodącą. Zapewnia ona możliwość zarówno identyfikacji substancji oraz ich ilościowej analizy, nawet w niskich stężeniach oraz w obecności innych związków. Proces rozdzielania chromatograficznego substancji wykorzystuje fakt, iż poszczególne składniki próbki w niejednakowym stopniu ulegają podziałowi między dwie niemieszające się fazy: jedna z tych faz jest ruchoma (tzw. faza ruchoma, eluent, rozpuszczalnik) i może nią być ciecz (chromatografia cieczowa LC), gaz (chromatografia gazowa GC) lub płyn w stanie nadkrytycznym (chromatografia z płynem w stanie nadkrytycznym - SFC), druga faza jest nieruchoma (tzw. faza stacjonarna) i jest nią wypełnienie kolumny chromatograficznej. Aparatura Analizę techniką chromatografii cieczowej przeprowadza się za pomocą chromatografu cieczowego (a to niespodzianka, prawda!). Chromatograf cieczowy składa się zwykle z następujących elementów: zbiornika na fazę ruchomą (rozpuszczalniki, bufory, inne roztwory); automatycznego odgazowywacza fazy ruchomej, który usuwa gazy rozpuszczone w eluentach (przy chromatografii gradientowej po zmieszaniu składników często następuje samorzutne, niekontrolowane odgazowanie cieczy, przez co w strumieniu eluenta pojawiają się pęcherzyki powietrza mogące silnie zakłócać proces rozdziału na kolumnie i detekcji wymywanych składników) zaworów proporcjonujących, w których faza ruchoma osiąga zadany skład, co ma szczególne znaczenie w analizach gradientowych (tzw. gradient niskociśnieniowy, gdyż

mieszanie składników eluenta następuje przed pompą, czyli w obszarze niskiego ciśnienia). Drugim typem jest tzw. gradient wysokociśnieniowy, gdzie najczęściej stosuje się dwie identyczne pompy dla obu mieszanych składników eluentu (obie pompy zintegrowane są w jednej obudowie), mieszanie następuje za pompami, czyli w obszarze wysokiego ciśnienia. Układ z zaworami proporcjonującymi zazwyczaj umożliwia mieszanie większej ilości roztworów (najczęściej 4, podczas gdy układ wysokociśnieniowy najczęściej 2), w zamian układ wysokociśnieniowy umożliwia znacznie szybszą zmianę składu eluenta (dzięki znacznie mniejszej objętości układu między mieszaczem a kolumną). pomp zapewniających odpowiednie parametry przepływu eluenta w układzie. Pompa zazwyczaj zintegrowana jest w jednej obudowie z mieszaczem (wspomniany wcześniej układ nisko, lub wysokociśnieniowy). dozownika umożliwiającego wprowadzanie analizowanych próbek na czoło (początek) kolumny chromatograficznej bez rozszczelnienia układu. Dozowniki takie są często zautomatyzowane (automatyczny podajnik próbek, autosampler). Objętość dozowanych próbek zależy od konstrukcji dozownika i zazwyczaj mieści się w zakresie (1 100) µl. przedkolumny, która usuwa z eluenta zanieczyszczenie mechaniczne, które mogłyby zniszczyć kolumnę chromatograficzną oraz zatrzymuje substancje, które w sposób nieodwracalny sorbują się na wypełnieniu; najczęściej stosuje się wypełnienie identyczne lub porównywalne z właściwą kolumną chromatograficzną. kolumny (kolumn) chromatograficznej z odpowiednim wypełnieniem żel krzemionkowy lub jego modyfikację polarnymi grupami (faza normalna, NP) żel krzemionkowy modyfikowany grupami o niskiej polarności (faza odwrócona, RP), najczęściej grupami oktadecylowymi, C18 wypełnienia polimerowe bardzo odporne chemicznie, umożliwiają prace w całym zakresie ph, ale ustępują jak na razie możliwościom rozdzielczym wypełnień opartych na żelu krzemionkowym termostatu zapewniającego żadną temperaturę pracy kolumny (pracującego w zakresie najczęściej od 5 do 80 C) detektora, który wykrywa obecność analitów w dopływającym do niego strumieniu fazy ruchomej. W chromatografii cieczowej wykorzystuje się wiele rodzajów detektorów, mogą nimi być przepływowe spektrofotometry UV-VIS, spektrofotometry fluorescencyjne, spektrometry mas, detektory laserowego światła rozproszonego, detektory refraktometryczne lub elektrochemiczne. zbiornika na zużyty eluent lub - w przypadku aparatów preparatywnych - kolektora frakcji (systemu naczyń zmienianych automatycznie po upływie zadanego czasu lub sterowanego sygnałami z detektora). komputera rejestrującego i zapisującego sygnał z detektora w postaci piku chromatograficznego.

Wiadomości podstawowe Techniki chromatograficzne, w których wykorzystuje się ruchomą fazę ciekłą to: chromatografia bibułowa, chromatografia cienkowarstwowa (TLC), chromatografia cieczowa (LC) - dzisiaj zwykle określana mianem HPLC wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa (wysokosprawna, wysokorozdzielcza), chromatografia jonowymienna (IC). Technika HPLC znajduje obecnie szerokie zastosowanie między innymi w analizie związków wielkocząsteczkowych, takich jak białka, sterydy, oligosacharydy, wysokowrzących (WWA), nietrwałych termicznie, takich jak nukleotydy, glikozydy, węglowodory, farmaceutyki polarnych takich jak akrylamid kwaśnych, obojętnych i zasadowych, organicznych i nieorganicznych (wszystkich z wyjątkiem gazowych). W wyniku analizy chromatograficznej uzyskuje się chromatogram (chromatogram graficzny zapis wyniku prowadzonego rozdzielenia), czyli zależność intensywności sygnału detektora w funkcji czasu analizy. Chromatograf - aparat umożliwiający prowadzenie procesu rozdzielenia substancji. Intensywność sygnału Czas retencji Chromatograf Chromatogram Chromatogram może być źródłem informacji dwojakiego typu:

jakościowych na podstawie położenia piku na chromatogramie można wnioskować o rodzaju (właściwościach fizykochemicznych) rozdzielanych substancji, na podstawie liczby pików, o liczbie składników w mieszaninie (jednakże pod warunkiem, że zastosowany układ chromatograficzny zapewnia rozdzielenie wszystkich składników mieszaniny a detektor jest czuły na wszystkie substancje - wszystkie je widzi ); ilościowych wielkość rejestrowanego sygnału detektora (mierzona za pomocą wysokości lub powierzchni piku chromatograficznego zależy, częstokroć wprost proporcjonalnie, od stężenia substancji w próbce wprowadzanej do kolumny chromatograficznej. Proces chromatograficzny to wielokrotna sorpcja i desorpcja substancji z fazy stacjonarnej do fazy ruchomej i odwrotnie, z fazy ruchomej do stacjonarnej. Sam proces chromatograficznego rozdzielenia składników mieszaniny następuje wskutek różnic w ich współczynnikach podziału (K) pomiędzy fazę ruchomą i fazę stacjonarną: gdzie: K = C s C m C s - stężenie składnika w fazie stacjonarnej C m - stężenie składnika w fazie ruchomej Współczynnik podziału K jest wielkością charakteryzującą oddziaływania pomiędzy daną substancją i daną fazą stacjonarną oraz ruchomą. Między liczbą cząsteczek związków chromatografowanych, obecnych w fazie ruchomej i stacjonarnej, ustala się równowaga dynamiczna. Naturalne przemieszczanie się substancji rozdzielanych w kolumnie następuje tylko w fazie ruchomej za pośrednictwem eluentu. Toteż większe wartości K oznaczają dłuższy czas przebywania w fazie stacjonarnej i późniejsze opuszczenie kolumny, czyli większą wartość czasu retencji. Parametry chromatograficzne W wyniku oddziaływań pomiędzy składnikami próbki a fazą stacjonarną i ruchomą, substancje wędrują wzdłuż kolumny z prędkością mniejszą niż eluent. Stosunek prędkości poruszania się substancji wzdłuż kolumny do prędkości poruszania się fazy ruchomej określa się mianem współczynnika retencji (k): k= t r t 0 t 0 = t ' r t 0

gdzie: t r - całkowity czas retencji analitu [min] t 0 - czas retencji substancji niezatrzymywanej przez kolumnę (nazywany również martwym czasem retencji t m ) [min] t' r tzw. zredukowany czas retencji analitu [min] Czas odpowiadający elucji maksimum piku, nazywany czasem retencji tr, to czas przebywania substancji chromatografowanej w kolumnie. Jest on funkcją równowagowego współczynnika podziału (K). Czas elucji jest funkcją prędkości przepływu fazy ruchomej i objętości eluentu potrzebnego do wymycia składnika z kolumny (tzw. objętości retencji (Vr)); gdzie: V r = F t r V r całkowita objętość retencji analitu [ml] F - prędkość przepływu fazy ruchomej [ml/min]

Substancja, która zupełnie nie oddziałuje z fazą stacjonarną (K=0), wymaga skończonego czasu na przejście przez cały układ chromatograficzny i dotarcie do detektora. Ten czas, nazywany jest zerowym czasem retencji t 0 lub t m. Iloczyn tego czasu i prędkości przepływu eluenta daje wielkość zwaną zerową objętość retencji V0; gdzie: V 0 =F t 0 V 0 zerowa (martwa) objętość retencji [ml] Zerowy czas retencji (inaczej martwy czas retencji), czyli czas przebywania składnika w fazie ruchomej nie jest cechą charakterystyczną substancji. Jest nią natomiast czas oddziaływania substancji z fazą stacjonarną. Czas ten nazywamy zredukowanym czasem retencji, t'r. Jest on równy różnicy pomiędzy całkowitym czasem retencji i zerowym czasem retencji: t ' r = t r t 0 Analogicznie do pojęcia zredukowany czas retencji, można posłużyć się terminem zredukowana objętość retencji, V' r. Zredukowana objętość retencji jest to różnica pomiędzy całkowitą objętością retencji analitu i zerową objętością retencji; V ' r = V r V 0 Zerowa objętość retencji (V 0 ) nie ma bezpośredniego wpływu na rozdzielenie chromatograficzne i zależy od wymiarów kolumny, wypełnienia oraz objętości układu wprowadzającego próbkę, objętości celi pomiarowej detektorów i łączników. Rozdzielenie substancji na kolumnie następuje na skutek ich zróżnicowanych prędkości migracji. To czy za pomocą danego układu chromatograficznego (faza stacjonarna + rozpuszczalnik) można spowodować rozdzielenie dwóch substancji, zależy od termodynamicznych właściwości tego układu. Właściwości te można opisać ilościowo posługując się pojęciem retencji względnej α, zwanej również współczynnikiem selektywności; = k 2 k 1 = t ' r2 t ' r1 gdzie: k 2 (t' r2 ) współczynnik retencji (zredukowany czas retencji) substancji eluującej później k 1 (t' r1 ) współczynnik retencji (zredukowany czas retencji) substancji eluującej wcześniej Sprawność kolumny chromatograficznej mierzy się dla danej substancji efektywną liczbą półek teoretycznych, N e. Pod pojęciem półki teoretycznej należy rozumieć najmniejszą objętość (długość) kolumny, w której zostaje osiągnięty stan równowagi pomiędzy stężeniem

analitu w fazie ruchomej i stacjonarnej. Efektywną liczbę półek teoretycznych wyznaczyć można na podstawie poniższego wzoru (przy założeniu, że pik pochodzący od substancji ma kształt krzywej Gaussa); gdzie: w 1/2 szerokość piku substancji w połowie jego wysokości [min] w b szerokość piku substancji przy jego podstawie [min] Wysokość równoważna półce teoretycznej WRPT, jest zdefiniowana za pomocą równania; WRPT = L N e gdzie: L długość kolumny [mm] N e efektywna liczba półek teoretycznych [1]

Rozdzielczość (zdolność rozdzielcza) pików RS, zazwyczaj podawana dla dwóch składników, które są najgorzej rozdzielone, wyznaczana jest na podstawie równania : gdzie: R s = t r2 t r1 0,5 w b2 w b1 = 2 t r2 t r1 w b2 w b1 t r2 czas retencji substancji eluującej później [min] t r1 czas retencji substancji eluującej wcześniej [min] w b2 szerokość (przy podstawie) piku substancji eluującej później [min] w b1 szerokość (przy podstawie) piku substancji eluującej później [min]

Aby piki chromatograficzne były rozdzielone do podstawy wartość R S musi wynieść ponad 1,5. Dobór warunków rozdzielania substancji jest zwykle procesem trudnym i pracochłonnym. Często bywa tak, że nie jest możliwe rozdzielenie analitów w układzie izokratycznym (stały skład fazy ruchomej) i należy stosować gradient (zmiana skokowa bądź ciągła składu fazy ruchomej). Obecnie najczęściej stosowanymi układami rozdzielania za pomocą techniki wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) jest tzw. układ faz odwróconych (RP) i można zaryzykować stwierdzenie, że 90% wszystkich rozdzieleń wykonuje się w tym układzie, najczęściej z zastosowaniem fazy stacjonarnej typu RP 18, tzn. żel krzemionkowy modyfikowany grupą oktadecylową. W praktyce laboratoryjnej doboru warunków rozdzielania dokonuje się przez: zmianę składu fazy ruchomej (zmiana ilościowego udziału rozpuszczalników), zmianę ph fazy ruchomej, zastosowanie pary jonowej, zmianę typu fazy stacjonarnej. Rozpuszczalniki stosowane jako fazy ruchome w układach RP wg ich siły elucyjnej to woda (najsłabszy) < MeOH< ACN < EtOH < THF < iproh < chlorek metylenu (najsilniejszy). W

praktyce najczęściej stosuje się pierwsze trzy rozpuszczalniki w różnych proporcjach tj. wodę, metanol i/lub acetonitryl. Podstawowa zasada mówi, że w odwróconym układzie faz, wzrost zawartości rozpuszczalnika organicznego w fazie ruchomej obniża wartość współczynnika retencji (k). Substancje eluują w kolejności od najbardziej polarnych (najbardziej hydrofilowych, najsłabiej zatrzymywanych przez wysoce niepolarną fazę stacjonarną) do niepolarnych (najmniej hydrofilowych), a w szeregach homologicznych od nisko- do wysokocząsteczkowych.

Wykonanie ćwiczenia. 1. Zapoznanie się z chromatografem cieczowym. Chromatograf cieczowy Agilent Seria 1100 jest wyposażony w detektor UV-VIS DAD, automatyczny podajnik próbek, dwukanałową pompę, termostat kolumny i system do zbierania danych (ChemStation). Rozpuszczalnik Wprowadzanie próbki Pompa Kolumna Detektor Zbieranie danych Do analiz zostanie wykorzystana kolumna analityczna Nucleodur (Machery-Nagel) o wymiarach 250mm (L) 3 mm (ø wew. ), której wypełnienie stanowi żel krzemionkowy modyfikowany grupami C18 (oktadecylowe). Średnica ziaren wypełnienia: 5 µm. Fazą ruchomą jest mieszanina metanolu i buforu (kwas mrówkowy-amoniak, ph= 4,5). Kolumna powinna pracować w temperaturze 25 C. Zalecana objętość próbki poddawanej analizie chromatograficznej to 20 µl. Dane uzyskane podczas analiz są zbierane w katalogu: AW-LABORATORIUM 2. Po zapoznaniu się z aparatem należy wypełnić tabelę 1 (tabele znajdują się na końcu tej instrukcji). 3. Przygotowanie kolumny chromatograficznej do analiz izokratycznych. Przed rozpoczęciem analiz należy przemyć kolumnę fazą ruchomą o składzie 30% MeOH i 70% buforu w ciągu minimum 10 minut aż do uzyskania stabilnej linii zerowej (przepływ 0,7 ml/min) i stałego ciśnienia ( + /- 2 bary). Uwaga: nie wolno doprowadzić do zapowietrzenia pompy poprzez zaciągnięcie powietrza przez rurki, używanie nieodgazowanych rozpuszczalników lub pozostawienie rurek, które nie są zanurzone w odpowiedniej ilości cieczy. Pytanie dla chętnych: dlaczego nie wolno dopuścić do zapowietrzenia kolumny chromatograficznej?

4. Przygotowanie detektora UV-VIS DAD do analiz Detektor należy przygotować poprzez wybranie odpowiednich długości fal do monitorowania chromatograficznego rozdzielenia. W tym celu jako długość fali należy ustawić wartość 210 nm, 225 nm, oraz 254 nm (nie wybieramy długości referencyjnej). Szerokość pasma ustawiamy na 16 nm. Podczas analiz rekomenduje się zbieranie widma dla poszczególnych pików w szczycie piku i w okolicy linii bazowej (opcja apex+baseline). 5. Wykonanie analizy chromatograficznej pojedynczego analitu. Należy przygotować trzy roztwory wzorcowe zawierające aspartam, acesulfam i sacharynę o stężeniu 100 µg/ml. W tym celu należy odważyć 10mg substancji i rozpuścić ją w kolbie miarowej o poj. 10 ml uzupełniając do kreski fazą ruchomą (roztwory podstawowe 1 mg/ml), a następnie roztwór ten rozcieńczyć dziesięciokrotnie. Roztwory wzorcowe słodzików (100 µg/ml ) są już przygotowane do zajęć! Roztwór wzorcowy aspartamu należy zadozować do kolumny i rozpocząć zbieranie danych. Czas analizy ok. 10 minut. Podobnie należy postąpić w przypadku acesulfamu i sacharyny. 6. Z uzyskanego chromatogramu należy: - wyznaczyć czas martwy kolumny chromatograficznej w danych warunkach (jeśli jest to możliwe) - odczytać czas retencji aspartamu, acesulfamu i sacharyny - na podstawie widma UV wskazać optymalną długość fali, która powinna posłużyć do oglądania chromatogramu, a jest nią maksimum zaobserwowane na widmie UV Pytanie dla chętnych: absorpcja światła mierzona w detektorze UV-Vis jest cechą specyficzną danego związku i zależy od jego budowy jak? 7. Wykonanie analizy chromatograficznej mieszaniny analitów. Należy przygotować roztwór będący mieszaniną trzech słodzików: aspartam, acesulfam, sacharyna. W tym celu do kolby miarowej o poj. 10 ml należy wlać po jednym mililitrze roztworu podstawowego aspartamu, acesulfamu, sacharyny i dopełnić do kreski fazą ruchomą. Otrzymany roztwór będący mieszaniną słodzików o stężeniu 100 µg/ml każdy, zadozować do kolumny i rozpocząć zbieranie danych. Czas analizy ok. 10 minut. 8. Z uzyskanego chromatogramu należy: - odczytać czasy retencji słodzików - obliczyć sprawność kolumny analitycznej dla każdego z analitów - określić symetrię piku dla każdego z analitów - określić stopień rozdzielenia (R s ) pomiędzy substancjami 1 i 2, 2 i 3 - obliczyć selektywność kolumny Pytanie dla chętnych: można wyróżnić trzy rodzaje selektywności związane z oddziaływaniem substancji z fazą stacjonarną; jakie? 9. Badanie wpływu składu fazy ruchomej na rozdzielenie analitów. Należy wykonać analizę HPLC roztworu będącego mieszaniną słodzików z zastosowaniem

trzech różnych składów fazy ruchomej: układ 1: układ 2: układ 3: 30% MeOH, 70% buforu 40% MeOH, 60% buforu 50% MeOH, 50% buforu 10. Po wykonaniu tego zadania dane z punków 6-9 należy zebrać w tabeli 2. 11. Badanie wpływu natężenia przepływu fazy ruchomej na sprawność kolumny chromatograficznej Ze względów czasowych ten punkt będzie zrealizowany na podstawie dostarczonych chromatogramów. Chromatogramy te zostały uzyskane dla następujących warunków: Chromatogram S0: 0.2 ml/min Chromatogram S1: 0.3 ml/min Chromatogram S2: 0.5 ml/min Chromatogram S3: 0.7 ml/min Chromatogram S4: 0.9 ml/min Dla każdego z nich (dla każdego z dwóch analitów osobno) należy wyznaczyć wysokość równoważną półce teoretycznej H (height equivalent to a theoretical plate HETP) wyznaczając sprawność kolumny chromatograficznej a następnie korzystając z zależności H = L/N e ; gdzie L długość kolumny chromatograficznej, N e sprawność kolumny chromatograficznej. Uzyskane wyniki należy przedstawić na wykresie (H = f(natężenie przepływu) ) i opatrzyć stosownym komentarzem. 12. Krzywa kalibracyjna W celu wykonania analizy ilościowej należy wykonać krzywą kalibracyjną dla każdego z badanych analitów. Aby to zrobić konieczne jest sporządzenie serii roztworów wzorcowych słodzików (roztwory wzorcowe szykuje się w postaci mieszaniny, a nie każdego z osobna!). W tym celu roztwór wzorcowy będący mieszaniną słodzików o najwyższym stężeniu 100 µg/ml należy rozcieńczyć uzyskując kolejne roztwory zawierające: 1; 5; 10; 20; i 50 µg/ml (mg/l) każdego z analitów. Stężenie analitu Objętość roztworu podstawowego Objętość końcowa (kolby miarowej) 1 µg/ml 0.5 ml 50 ml 5 µg/ml 0.5 ml 10 ml 10 µg/ml 1 ml 10 ml 20 µg/ml 2 ml 10 ml 50 µg/ml 5 ml 10 ml Kolejne rozcieńczenia należy sporządzać w sposób równoległy, nigdy szeregowo. Każde rozcieńczenia przygotowujemy stosując bufor mrówczanowy jako medium do rozcieńczania.

13. Wszystkie roztwory wzorcowe należy wprowadzić do kolumny chromatograficznej i wykonać analizy HPLC w kolejności od najniższego stężenia do najwyższego. Czas całkowity analiz ok. 1 godzina. 14. Z uzyskanych chromatogramów należy: - odczytać czas retencji substancji badanych oraz odpowiadające im pole powierzchni piku chromatograficznego - odczytać pola powierzchni przypadające dla poszczególnych stężeń i uzupełnić tabelę 3 - narysować wykres zależności pola powierzchni piku chromatograficznego (A) od stężenia analitu w roztworze wzorcowym: A = f(c). - obliczyć równanie prostej opisującej krzywą wzorcową (metodą regresji liniowej) Uzyskane dane należy przedstawić w postaci uzupełnionych tabel i wykresów wraz ze stosownym opisem i komentarzem 15. Analiza ilościowa - Wykonać analizę HPLC próbki (napoje) o nieznanej zawartości słodzików. W tym celu do fiolki pobrać około 10 ml napoju i umieścić na 5 minut w łaźni ultradźwiękowej celem odgazowania (jeśli to napój gazowany). Następnie umieścić dokładnie 1 ml odgazowanego napoju w kolbie miarowej o pojemności 10 ml i dopełnić ją do kreski buforem mrówczanowym. Zawartość kolby dokładnie wymieszać a następnie przenieść około 1 ml roztworu do fiolki chromatograficznej. Uwaga! Jeśli roztwór nie jest idealnie przeźroczysty, przed umieszczeniem we fiolce chromatograficznej należy go przefiltrować za pomocą filtra membranowego o średnicy porów około 0,45 µm. - porównując czasy retencji pików na otrzymanym chromatogramie próbki (napoju) z czasem retencji wzorców słodzików należy zidentyfikować piki chromatograficzne - identyfikację potwierdzić poprzez porównanie widm UV zebranych w trakcie ćwiczenia (punkt 5 i 6 niniejszej instrukcji) - z otrzymanego chromatogramu uzyskanego dla próbki (napoju) odczytać czas retencji analitu oraz pole powierzchni piku chromatograficznego a dane zamieścić w tabeli 4 - korzystając z wcześniej wyznaczonej krzywej kalibracyjnej obliczyć zawartość związków w badanej próbce, a wyniki zamieścić w tabeli 4. 16. Sprawozdanie. W sprawozdaniu należy dokładnie opisać sposób wykonania analizy jakościowej oraz ilościowej, ponadto należy dołączyć wypełnione tabele zamieszczając wszystkie wykonane obliczenia oraz wyniki. Analizy chromatograficzne roztworów należy udokumentować poprzez zamieszczenie w sprawozdaniu odpowiednio opisanych (opracowanych) chromatogramów. Należy zwrócić uwagę na podanie komentarza/wniosków/konkluzji wynikających z otrzymanych wyników analizy HPLC. Należy zapoznać się obowiązującymi przepisami co do dopuszczalnych zawartości badanych słodzików w napojach. Informacje te zawarte są w dyrektywie numer 94/35/WE Komisji Europejskiej (wraz z późniejszymi zmianami). Termin oddania sprawozdania upływa 14 dnia od daty przeprowadzonego ćwiczenia. Po tym dniu ocena za sprawozdanie zostanie obniżona. Dr inż. Andrzej Wasik

Tabela 1. Opis warunków chromatograficznych wykorzystywanych w trakcie ćwiczenia Chromatograf Detektor Parametry pracy detektora Kolumna Długość: średnica wewnętrzna: wypełnienie: Faza ruchoma Parametr Zakres pracy Warunki optymalne Przepływ Temperatura Objętość wprowadzanych roztworów (stosowane w trakcie ćwiczenia)

Tabela 2. Parametry chromatograficzne uzyskane w trakcie zajęć aspartam acesulfam sacharyna Wzór strukturalny MW pka układ 1: 30% MeOH, 70% buforu Czas retencji λ max (nm) Symetria piku Sprawność Rozdzielenie Selektywność układ 2: 40% MeOH, 60% buforu Czas retencji λ max (nm) Symetria piku Sprawność Rozdzielenie Selektywność układ 3: 50% MeOH, 50% buforu Czas retencji λ max (nm) Symetria piku Sprawność Rozdzielenie Selektywność Z uzyskanych danych należy wyznaczyć zależność współczynnika retencji i współczynnika rozdzielenia od zawartości rozpuszczalnika organicznego. Do sprawozdania należy dołączyć przykładowe obliczenia i zależności przedstawione na wykresach oraz podać stosowany do nich komentarz.

Tabela 3. Dane chromatograficzne do krzywej kalibracyjnej Aspartam (tr =...) Acesulfam (tr =...) Sacharyna (tr =...) Pole powierzchni piku C1 =... µg/ml C2 =... µg/ml C3 =... µg/ml C4 =... µg/ml C5 =... µg/ml Wysokość piku C1 =... µg/ml C2 =... µg/ml C3 =... µg/ml C4 =... µg/ml C5 =... µg/ml

Tabela 4. Wyniki analizy ilościowej słodzików w próbkach napojów Aspartam (tr =...) Acesulfam (tr =...) Sacharyna (tr =...) Pole powierzchni piku Napój 1... Napój 2... Napój 3... Napój 4... Stężenie w próbce badanej [mg/l] Napój 1... Napój 2... Napój 3... Napój 4... Przykładowe przeliczenie wyniku: