Ekspresja receptorów Toll-like na komórkach chłoniaka Burkitta

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2011, 63: 349-354 Joanna Siennicka, Agnieszka Trzcińska, Agnieszka Częścik, Milena Dunal Ekspresja receptorów Toll-like na komórkach chłoniaka Burkitta Zakład Wirusologii NIZP-PZH w Warszawie Kierownik: dr hab. B.Litwińska, prof. nadzw. w NIZP-PZH Przedstawiono charakterystykę linii komórkowych wyprowadzonych z chłoniaka Burkitta (Raji, P3HR-1 i Namalwa) dotyczącą ekspresji receptorów Toll-like (TLR 2, TLR3, TLR 4) na poziomie mrna. TLR - receptory Toll-podobne (Toll-like receptors) są ważnym elementem reakcji odpornościowej. Stanowią pomost między odpowiedzią wrodzoną (innate response) a nabytą (adoptive response). Przy ich udziale rozpoznawane są struktury charakterystyczne dla patogenów (PAMP pathogen associated molecular patterns). TLR rozpoznają strukturalne składniki czynników zakaźnych takie jak lipopolisacharydy (LPS), lipoproteiny i lipopeptydy, białka (flagellina, białka szoku cieplnego), glikoproteiny (białko fuzyjne RSV, hemaglutynina wirusa odry) i różne struktury kwasów nukleinowych takie jak podwójne nici RNA (dsrna) i niemetylowane struktury DNA bogate w cytozynę i guanozynę (CpG) (8). Rola receptorów Toll-like polega na przekazaniu sygnału do cytoplazmy i aktywowaniu jądrowego czynnika transkrypcyjnego NF-kB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells). Aktywacja czynnika NF-kB pociąga za sobą szereg zdarzeń, między innymi wzrost ekspresji cytokin zapalnych (IL-1,-6,-8,-12, TNFα), chemokin i cząsteczek kostymulacyjnych (CD80, CD86, CD40) jak również aktywację kaspaz i uruchomienie procesu apoptozy (4, 6, 9). W świetle obecnej wiedzy wydaje się, że aktywacja NF-kB i indukcja cytokin prozapalnych może być ważnym mechanizmem związanym z reaktywacją zakażeń latentnych wywołanych przez herpeswirusy (5). Obecność receptorów TLR potwierdzono na komórkach różnego typu (4). Limfocyty B wykazują ekspresję większości poznanych do tej pory TLR i mogą odpowiadać na szerokie spektrum PAMP (2). Zasiedlając obwodowe tkanki limfatyczne, gdzie stanowią do 50% populacji wszystkich komórek, limfocyty B są ważnym elementem obrony, w dużym stopniu wykorzystując mechanizmy związane z odpowiedzią wrodzoną. Z drugiej strony należy pamiętać, że miejscem latencji EBV jest właśnie limfocyt B (7). Tak więc można pokusić się o pytanie, jaki wpływ może mieć stymulacja poprzez TLR na reaktywację zakażenia latentnego wirusa Epsteina-Barr. Dogodnym modelem do badania tego procesu mogą być linie limfocytów B wyprowadzone z chłoniaka Burkitta. Badanie finansowane w ramach projektu MNiSW NN 404 002 337

350 J. Siennicka i inni Nr 4 Podjęte badania miały na celu określenie ekspresji TLRs na poziomie m-rna w komórkach chłoniaka Burkitta poddawanych działaniu ligandów dla wybranych receptorów Tool-like. MATERIAŁ I METODY K o m ó r k i. Badania prowadzono na komórkach pochodzących z kolekcji ATCC: P3HR-1 (HTB-62), Raji (CCL-86) i Namalwa (CRL-1432) hodowanych w RPMI (Roswell Park Memorial Institute, Sigma, R8005) z dodatkiem 10% cielęcej surowicy płodowej (FCS; Sigma, F6178), 1mM pirogronianu sodu (Sigma, S8636), 1,5 g/l NaHCO 3 (Biomed Lublin) i antybiotyków (streptomycyna 80 μg/ml, penicilina 100 U/ml). Hodowle prowadzono w 37 o C, w 5% CO 2. W a r u n k i s t y m u l a c j i T L Rs. Do hodowli o gęstości 2x10 5 komórek/ml dodawano Pam3CSK4 (10 mg/ml), PolyI:C (25 mg/ml) i LPS (10 mg/ml) i wirusa odry (MeV, moi 0,02). Po 24h inkubacji (37 o C, 5% CO 2 ) komórki odwirowywano i płukano PBS. Kontrolę negatywną stanowiły komórki hodowane w identycznych warunkach, ale nie podlegające stymulacji (NS). Kontrolę pozytywną stanowiły komórki stymulowane PMA (0,5 mg/ml). I z o l a c j a m R N A. Po okresie inkubacji komórki odwirowywano i zawieszano w PBS. Izolację mrna wykonano przy użyciu zestawu Oligotex Direct mrna (Qiagen). N e s t e d R T P C R - m R N A T L Rs. Pierwszy etap reakcji amplifikacji ze starterami dla genów kodujących receptory TLR2, TLR3 i TLR4 (InvivoGen) prowadzono jednocześnie z reakcją odwrotnej transkrypcji (RT-PCR) stosując zestaw OneStep RT- -PCR f-my Qiagen. Reakcję RT-PCR przeprowadzono zgodnie z procedurą podaną przez producenta zestawu, stosując startery o końcowym stężeniu 0,15 mm. W 25 ml mieszaniny reakcyjnej 2,5 ml stanowiła próbka badana lub kontrola. Warunki reakcji amplifikacji: odwrotna transkrypcja 30 min. w 50 o C; aktywacja polimerazy 15 min. w 95 o C; 25 cykli: 30 sek. 94 o C, 30 sek 60 o C, 90 sek. 72 o C; końcowe wydłużanie 10 min. w 72 o C. Drugi etap reakcji amplifikacji przeprowadzono z tymi samymi primerami (końcowe stężenie 0,15 mm), zastepując OneStep RT-PCR bufor 2 ml MgCl 2 oraz 2,5 ml PCR Gold Buffer f-my Applied Biosystems. Enzyme Mix z zestawu OneStep RT-PCR zastąpiono Ampli- TaqGold DNA polimeraza (Applied Biosystems) o końcowym stężeniu 0,06U/ml. Warunki amplifikacji były takie same jak w I rundzie z pominięciem reakcji odwrotnej transkrypcji. Elektroforezę produktów amplifikacji prowadzono w 2% żelu agarozowym z barwnikiem GelRed f-my Biotium. N e s t e d R T P C R - m R N A G A P D H. Ekspresję genu dehydrogenazy gliceroaldehydofosforanowej (GADPH), jako genu odniesienia, oznaczano metodą nested RT- PCR wg. procedury podanej przez Bergallo i wsp. (1) z zastosowaniem zestawu OneStep RT-PCR (Qiagen). Pierwszy etap amplifikacji przeprowadzono zgodnie z procedurą producenta, stosując primery zewnętrzne dla genu GAPDH (Genomed) o końcowym stężeniu 0,6 mm. Objętość dodawanej próbki wynosiła 1 ml przy końcowej objętości mieszaniny reakcyjnej - 25ml. Drugi etap amplifikacji przeprowadzono z primerami wewnętrznymi dla genu GAPDH (końcowe stężenie 0,6 ml) oraz z wykorzystaniem zestawu OneStep RT- -PCR z modyfikacją polegającą na zastąpieniu Enzyme Mix polimerazą AmpliTaqGold DNA (Applied Biosystems) o końcowym stężeniu 0,06U/ml. Ilość dodawanej próbki była

Nr 4 Ekspresja receptorów Tool-like 351 taka sama jak w przypadku I etapu. Warunki amplifikacji dla I i II etapu były identyczne jak w przypadku RT-PCR dla TLRs z 1 modyfikacją dotyczącą skrócenia czasu końcowego wydłużania z 10 do 5 min. Elektroforezę produktów amplifikacji prowadzono w 2% żelu agarozowym z barwnikiem GelRed f-my Biotium. A n a l i z a. Żele agarozowe poddawano analizie w aparacie Gel Doc TM XR przy użyciu programu Quantity One 4.4 (Bio-Rad). Wykorzystując narzędzia do analizy ilościowej określano intensywność (INT) uzyskanych po rozdziale elektroforetycznym prążków. INT definiowano jako intensywność wszystkich pikseli w badanym obszarze pomnożoną przez współczynnik 0,001 i podzieloną przez powierzchnie analizowanego obszaru. WYNIKI Poziom ekspresji GAPDH w hodowlach niestymulowanych (NS) był podobny i wyniósł 92, 92 i 98 INT dla P3HR, Namalwa i Raji odpowiednio. Poddanie komórek działaniu stymulatorów(pam3, PolyI:C, LPS, MeV, PMA) miało wpływ na poziom m-rna GAPDH. We wszystkich przypadkach (oprócz LPS dla Namalwa) obserwowany efekt miał charakter supresyjny. Średni poziom ekspresji GADPH w komórkach stymulowanych i NS (rycina 1) był najniższy dla P3HR i znamiennie niższy od obserwowanego dla Raji (test t-studenta, p=0,02). Pozostałe wartości nie wykazały statystycznie znamiennych różnic (P3HR versus Namalwa, Namalwa versus Raji, p>0,05). W celu analizy ekspresji genów TLR wartości INT odczytane dla TLR2, TLR3 i TLR4 w badanych liniach komórkowych wyrażano jako %, przyjmując średni poziom ekspresji GAPDH za 100%. Uzyskane wyniki przedstawiono na rycinie 2. Za wyznacznik zmiany ekspresji po stymulacji przyjęto 25% wartości INT kontroli ujemnej (komórek niestymulowanych). Wartości INT dla NS oraz zakres granic zmienności wyniosły dla: P3HR - 85,1 (63,8-106,3) dla TLR2, 35,6 (26,7-44,4) dla TL3, 94 (70,5-117,4) dla TLR4; Raji - 50 (67,5-112,5) dla TLR2, 55,6 (41,7-69,4) dla TLR3, 75,6 (36,7-94,4) dla TLR4. W kontroli NS komórek Namalwa nie stwierdzono ekspresji na poziomie m-rna żadnego z badanych genów. Ryc 1. Poziom ekspresji genu GAPDH w badanych liniach chłoniaka Burkitta (INT)

352 J. Siennicka i inni Nr 4 Ryc. 2. Poziom ekspresji genów TLR2, TLR3 i TLR4 w badanych liniach chłoniaka Burkitta wyrażony jako % w stosunku do poziomu ekspresji GAPDH (100%) dla danej linii komórkowej

Nr 4 Ekspresja receptorów Tool-like 353 Przyjmując wyżej opisane kryteria stwierdzono, że wzrost ekspresji TLR2 uzyskano po stymulacji Pam3 (P3HR), PolyI:C, LPS, PMA, MeV (Namalwa) a TLR3 - po stymulacji PMA i MeV (P3HR), Pam3, PolyI:C, LPS, PMA, MeV (Namalwa), Pam3, PolyI:C, MeV (Raji). W żadnej z badanych linii komórek stymulacja nie miała wpływu na wzrost ekspresji genu TLR4. Po stymulacji PolyI:C, PMA i MeV w P3HR obserwowano spadek ekspresji TLR2. Spadek ekspresji TLR3 uzyskano po stymulacji Pam3, PolyI:C (P3HR) i PMA (Raji), natomiast TLR4 PolyI:C, LPS (Raji). Opisaną powyżej zmienność w zakresie 25% w stosunku do kontroli NS dla danej linii zaznaczono strzałkami na wykresach prezentowanych na rycinie 2. DYSKUSJA We wcześniej prezentowanej pracy (10) stwierdzono ekspresję TLR4 w Namalwa stymulowanych Pam3, oraz w P3HR stymulowanych Pam3 i LPS. Zaznaczyć należy, że obecnie prezentowane wyniki uzyskano stosując czulszą metodę. Ekspresja receptorów Toll-like jest zróżnicowana zarówno pod względem typu komórek jak i rodzaju stymulacji. Przedstawione w tej pracy wyniki dotyczyły ekspresji na poziomie m-rna genów TLR2, TLR3 i TLR4 w komórkach chłoniaka Burkitta, prezentujących fenotyp niedojrzałych limfocytów B. Limfocyty B wykazują szeroki zakres ekspresji receptorów Toll-like - od TLR1 do TLR9 (2, 11, 12), co z uwagi na fakt, że stanowią pierwszą linię obrony w obwodowych narządach limfatycznych jest w pełni logiczne. Zarember i Godowski (12) potwierdzili ekspresję genów TLR2, TLR3 i TLR4 na komórkach CD19+ (limfocytach B) izolowanych z krwi zdrowych dawców. Jednak pamiętać należy, że przedstawione wyniki dotyczyły badań na komórkach chłoniaka, które jako linie nowotworowe niekoniecznie muszą odzwierciedlać właściwości zdrowych limfocytów B. I tak, Henault i wsp. (3) stwierdzili, że Namalwa wykazuje ekspresję TLR9 i TLR7 ale nie TLR2, TLR3 i TLR4. Wyniki naszych badań potwierdziły tę obserwację. W nie stymulowanych komórkach Namalwa nie stwierdzono ekspresji na poziomie m-rna żadnego z badanych genów. W większości przypadków stymulacja znosiła ten stan supresji. Wyniki przedstawionych przez nas badań, wraz z wynikami nad ekspresją białek EBV mogą stanowić przyczynek do poznania wpływu stymulacji TLRs na reaktywację EBV. J. Siennicka, A. Trzcińska, A. Częścik, M. Dunal Toll-like receptors expression on Burkitt lymphoma cells SUMMARY Toll like receptors (TLRs) are an important component of the immune response. They are link between innate and adaptative response. Lymphocytes B express most of the toll-like receptors and they may respond to a broad spectrum of PAMP. Lymphocytes B are one of the major lymphocyte populations in secondary lymphoid tissues, where they represent up to 50% of cells population. These cells are an important element of the defense, largely by using the mechanisms associated with innate

354 J. Siennicka i inni Nr 4 response. On the other hand, lymphocytes B are the site of EBV latency, so Burkitt lymphoma cells can may be a convenient model to study the mechanisms associated with EBV infection. The aim of study was to determine the expression of TLRs at the m-rna level of in Burkitt lymphoma cells treated with ligands for selected TLRs. P3HR, Raji and Namalwa cells were stimulated with Pam3 (10µg/ml), PolyI:C (25µg/ml), LPS (10µg/ml) and measles virus (MeV, moi 0,02). Unstimulated cells and cells treated with PMA (0,5µg/ml) served as negative and positive controls. After incubation, from stimulated and unstimulated cells mrna was extracted, RT-PCR reaction was performed and electrophoretic separation was made. The intensity (INT) of bands were determined using the tools for quantitative analysis. In order to analyze the expression of TLR genes, INT values for TLR2, TLR3 and TLR4 in tested cell lines are expressed as %, assuming an average level of GAPDH expression as 100%. The 25% of INT for negative control was accepted as a change in expression level. It was found that the expression of Toll-like receptors in Burkitt lymphoma cells is diverse both in terms of cell type and the type of stimulation. PIŚMIENNICTWO 1. Bergallo M, Costa C, Baro S, i inni. Multiplex-nested RT-PCR to evaluate latent and lytic Epstein Barr virus gene expression. J Biotechnol 2007; 128: 462-76. 2. Gray D, Gray M, Barr T. Innate responses of B cells. Eur J Immunol 2007; 37: 3304-10. 3. Henault M, Lee LN, Evans GF, i inni. The human Burkitt lymphoma cell line Namalwa represents a homogenous cell system characterized by high levels of Toll-like receptor 9 and activation by CpG oligonucleotides. J Immunol Methods 2005; 300: 93-9. 4. Hopkins PA, Sriskandan S. Mammalian Toll-like receptors: to immunity and beyond. Clin Exp Immunol 2005; 140: 395-407. 5. Hummel M, Abecassis MM. A model for reactivation of CMV from latency. J Clin Virol 2002; 25: S123 - S136. 6. Janssens S, Beyaert R. Role of Toll-like receptors in pathogen recognition. Clin Microbiol Rev 2003; 16: 637-46. 7. Kieff E.D. Epstein-Barr Virus and its replication. W: Principles and practice of infectious diseases. Red. G.L. Mandell, J.E. Bennett, R. Dolin, Elsevier Churchill Livingstone, Philadelphia 2005, 2604-54. 8. Majewska M, Szczepanik M. Rola receptorów toll-like (TLR) w odporności wrodzonej i nabytej oraz ich funkcja w regulacji odpowiedzi immunologicznej. Post Hig Med Dosw 2006; 60: 52-63. 9. Medzhitov R. Toll-like receptors and innate immunity. Nat Rev Immunol 2001; 1: 135-45. 10. Rek O, Cześcik A, Trzcińska A, i inni. Raji, P3HR-1 and Namalwa cells as a model for the study of Epstein-Barr virus (EBV) reactivation. Med Dosw Mikrobiol 2010; 62: 263-9. 11. Xie P, Kraus ZJ, Stunz LL, i inni. Roles of TRAF molecules in B lymphocyte function. Cytokine Growth Factor Rev 2008; 19: 199-207. 12. Zarember KA, Godowski PJ. Tissue expression of human Toll-like receptors and differential regulation of Toll-like receptor mrnas in leukocytes in response to microbes, their products, and cytokines. J Immunol 2002; 168: 554 61. Otrzymano: 14 XI 2011r. Adres Autora: 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Wirusologii NIZP-PZH