Ampli-LAMP Salmonella species

Transkrypt

1 Novazym Products Novazym Polska ul. Żywokostowa 23, Poznań, tel , fax , info@novazym.com Zestaw do identyfikacji materiału genetycznego bakterii z rodzaju Salmonella techniką Loop-mediated Isothermal AMPlification (LAMP) Numery katalogowe produktu: AML-SLM-200 AML-SLM-400 Wydanie 1 (kwiecień 2013)

2 1. Przeznaczenie testu Salmonella spp. jest to rodzaj Gram-ujemnych pałeczek wywołujących liczne zakażenia i zatrucia pokarmowe u ludzi oraz zwierząt. Ze względu na zróżnicowanie antygenowe i biochemiczne pałeczek Salmonella spp. oraz zmienne nasilenie występowania poszczególnych serotypów, diagnozowanie oraz dochodzenie epidemiologiczne w przebiegu salmoneloz jest bardzo problematyczne. Wszystkie serowary Salmonella spp. są uznawane za potencjalnie chorobotwórcze dla ludzi i/lub zwierząt, przy czym różnią się one stopniem chorobotwórczości. Dawka zakaźna niezbędna do wywołania objawów chorobowych u ludzi i zwierząt, w zależności od serotypu Salmonella spp. wynosi komórek bakteryjnych. Głównymi rezerwuarami szczepów Salmonella wśród zwierząt hodowlanych są świnie, drób oraz gołębie. Serowary dominujące wśród tych gatunków to Salmonella Typhimurium oraz Samonella Enteritidis. Wielokrotnie źródłem zakażenia są nie tylko nosiciele drobnoustrojów, ale także środowisko, do którego przedostają się pałeczki Salmonella wraz z odchodami zwierząt np. do gleby lub wody. Test pozwala na jakościową detekcję DNA bakterii z rodzaju Salmonella. W zależności od wielkości, zestaw pozwala na przeprowadzenie 200 i 400 testów. Zestaw zawiera: - Isothermal Master Mix fluorescent dye, OptiGene (bufor reakcyjny, MgCl 2, dntps, pirofosfataza, polimeraza GspSSD, barwnik fluorescencyjny pochodna 6-FAM) - Primers (F3, B3, FIP, BIP, LF, LB każdy w stężeniu 10 µm) - kontrolę pozytywną DNA (sekwencja DNA amplikonu w wektorze plazmidowym) - sterylną wodę MiliQ do reakcji. 2. Zasada działania testu Test oparty jest na technice LAMP (ang. Loop-mediated Isothermal Amplification) i zapewnia bardzo szybką oraz wysoce specyficzną identyfikację materiału genetycznego bakterii z rodzaju Salmonella spp. Zoptymalizowane mieszaniny i specjalnie zaprojektowane startery umożliwiają specyficzną amplifikację konserwatywnego regionu DNA genu inva kodującego białko wchodzące w skład III systemu sekrecji, istotnego w procesach wirulencji m.in. wnikania Salmonella do komórek epitelialnych jelita. Czas potrzebny na przeprowadzenie reakcji to ok. 30 minut w przypadku wykorzystania standardowego termocyklera oraz minut w przypadku termocyklera do Real-time PCR lub platformy Genie II. Test oparty o metodę amplifikacji LAMP jest co najmniej dwukrotnie szybszy od testu opartego o standardową amplifikację PCR. 2

3 W zależności od urządzenia wykorzystanego do przeprowadzenia testu, różni się sposób analizy wyników testu: PLATFORMA Łaźnia wodna Blok grzewczy Termocykler do PCR Termocykler do Real-time PCR Platforma Genie II do LAMP SPOSÓB ANALIZY WYNIKÓW Rozdział elektroforetyczny w 2% żelu agarozowym Obserwacja fluorescencji w probówce w świetle UV Analiza turbidymetryczna obserwacja zmętnienia roztworu w probówce po reakcji LAMP Analiza przyrostu ilości produktu w czasie rzeczywistym, na podstawie pomiaru fluorescencji (odczyt przez kanał FAM) Analiza profilu topnienia produktu po reakcji LAMP Produkt reakcji wybarwiony bromkiem etydyny w żelu agarozowym ma postać tzw. drabinki (ang. ladder-pattern structure), ponieważ w wyniku reakcji LAMP powstają różnej długości konkatamery złożone z powtórzeń sekwencji matrycowej. Wynik pozytywny reakcji można również zaobserwować w postaci silnej fluorescencji produktów reakcji w świetle UV lub w postaci zmętnienia roztworu w probówce po reakcji (analiza turbidymetryczna). Wynik pozytywny reakcji przeprowadzonej w termocyklerze do Real-time PCR oraz na platformie Genie II umożliwia analizę przyrostu ilości produktu w czasie rzeczywistym (proporcjonalnie do wzrostu emisji fluorescencji, odczytywanej przez kanał FAM). Możliwa jest również analiza specyficzności reakcji na podstawie profilu topnienia produktów amplifikacji (ang. melt curve analysis). W analizie Melt Peak widoczny jest jeden specyficzny produkt reakcji, który topnieje w zakresie temp C. Zaleca się prowadzenie analizy wyników testu w układzie zamkniętym (wizualizacja w świetle UV lub na podstawie analizy profilu topnienia produktów reakcji). 3. Zawartość zestawu Lp. Oznaczenie Element zestawu [1] [2] [3] [4] Isothermal Master Mix Primers Positive Control MiliQ Water AML-SLM- 200 AML-SLM Warunki przechowywania: przechowywanie długoterminowe -20 C przy częstym, rutynowym użyciu +4 C chronić przed światłem unikać częstego zamrażania i rozmrażania. 3

4 4. Zalecana procedura przed analizą LAMP Ekstrakcja DNA z zainfekowanej pałeczkami Salmonella sp. tkanki zwierzęcej, produktów spożywczych lub próbek środowiskowych (np. gleby, wody). 5. Przeprowadzenie testu Warunki reakcji STANDARD PCR Etap Temperatura Czas Ilość cykli Amplifikacja 65 C 30 min 1 Chłodzenie 4 C 1 min REAL-TIME PCR Etap Temperatura Czas Ilość cykli Amplifikacja 65 C 30 sek 70 Pomiar fluorescencyjny ilości produktu amplifikacji po każdym cyklu reakcji, w czasie rzeczywistym Topnienie produktu C 0,5 C / 5 sek Pomiar fluorescencji po każdorazowej zmianie temp. o 0,5 C Chłodzenie 40 C 30 sek Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej Lp. [1] [2] [3] [4] Oznaczenie probówki Element zestawu Objętość na 1 reakcję 15 µl Isothermal Master Mix Primer F3/B3 10 µm 0,5 µl 7 µl Primer FIP/BIP 10 µm 2 µl Primer LF/LB 10 µm 1 µl Positive Control 1 µl lub inna matryca DNA 2 µl MiliQ Water RAZEM 25 µl 4

5 Obligatoryjne kontrole testu Dla prawidłowej interpretacji wyników testu należy obok próbek badanych zastosować trzy kontrole reakcji: kontrolę pozytywną reakcji (Positive Control), która pozwala ocenić poprawność przebiegu amplifikacji docelowego produktu matrycę stanowi próbka zawierająca amplifikowaną sekwencję DNA [3]. kontrolę negatywną reakcji, która pozwala ocenić poprawność przebiegu amplifikacji matrycę stanowi izolat DNA ze zdrowej tkanki zwierzęcej. kontrolę negatywną reakcji bez matrycy DNA, która pozwala ocenić czystość odczynników używanych do reakcji amplifikacji LAMP zamiast matrycy, woda MiliQ [4]. Fakultatywnie kontrole testu Okresowo zaleca się przeprowadzić: kontrolę negatywną izolacji DNA pozwala ocenić czystość odczynników do izolacji. Należy wykonać jedną taką kontrolę w każdej serii izolacji lub okresowo w krótkich odstępach czasu, izolując z wody (zamiast z zainfekowanej tkanki). kontrolę pozytywną izolacji pozwala potwierdzić skuteczność procesu izolacji. Należy stosować okresowo np. dla nowej partii odczynników do izolacji DNA (do izolacji należy podać tkankę naturalnie lub sztucznie zainfekowaną bakterią). 5

6 6. Analiza wyników testu Rozdział elektroforetyczny produktów reakcji amplifikacji LAMP w 2% żelu agarozowym Analiza przyrostu ilości produktu w czasie rzeczywistym na podstawie pomiaru fluorescencji (odczyt przez kanał FAM) oraz analiza profili topnienia produktów reakcji 6

7 7. Analiza specyficzności testu w stosunku do bakterii z rodzaju Salmonella M marker masy DNA 1 S. Typhimurium 2 MIC Virkon 2 S. Enteritidis 2 MIC Virkon 3 S. Enteritidis 2 MIC Virusolve+ 4 S. Typhimurium 2 MIC Virkon 5 S. Enteritidis 2 MIC Virkon 6 S. Enteritidis 2 MIC Virusolve+ 7 S. Typhimurium 4 MIC Virusolve+ 8 S. Typhimurium 2 MIC Virusolve+ 9 S. Typhimurium 4 MIC Virusolve+ 10 S. Typhimurium 2 MIC Virusolve+ 11 S. Enteritidis ATCC Escherichia coli 13 Neisseria sp. 14 Proteus sp. 15 Pseudomonas aeruginosa 16 Klebsiella pneumoniae 17 kontrola bez matrycy DNA 13 Neisseria sp. 16 Klebsiella pneumoniae 17, 18 kontrole bez matrycy DNA 19 S. Zanzibar 20 S. Saintpaul 21 S. Instanbul 22 S. Hadar 23 S. California 24 S. Branderup 25 S. Thompson M marker masy DNA MIC szczepy Salmonella oporne na zwiększone stężenia środków dezynfekcyjnych Virkon i Virusolve+ (ang. minimal inhibitory concentration minimalne stężenie hamujące wzrost, wyznaczone wg rekomendacji Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). 7

8 UWAGA! Wysokie ryzyko kontaminacji miejsca pracy! Aby zapobiegać kontaminacji laboratorium produktami amplifikacji LAMP, należy zwrócić szczególną uwagę, aby nie otwierać probówek z produktami amplifikacji w tym samym pomieszczeniu, gdzie jest wykonywany proces izolacji DNA z zainfekowanego materiału oraz przygotowywanie mieszaniny reakcyjnej do testu. Reakcję LAMP charakteryzuje bardzo wysoka wydajność - powstaje nawet do 25 µg DNA, zawierającego bardzo dużą liczbę kopii amplikonu! Zalecamy wykonywanie izolacji DNA i przygotowywanie mieszaniny reakcyjnej w innym pomieszczeniu, niż rozdział elektroforetyczny produktów amplifikacji. Pomimo możliwości analizy wyników reakcji w żelu agarozowym, zalecamy korzystanie z możliwości wykonania reakcji i analizy wyników w układzie zamkniętym, bez konieczności otwierania probówek z produktami reakcji LAMP (obserwacja fluorescencji produktów amplifikacji w probówce w świetle UV oraz wykorzystanie do wykonania testu aparatu do Real-time PCR lub platformy Genie II). Technologia LAMP została wynaleziona i jest własnością firmy Eiken Chemical Co., Ltd. Dane empiryczne dotyczące optymalnych warunków reakcji oraz czułości i specyficzności testu Ampli-LAMP Salmonella species zostały zamieszczone w powyższym protokole dzięki współpracy z Panią dr Bożeną Futomą- Kołoch, pracownikiem Zakładu Mikrobiologii Uniwersytetu Wrocławskiego w Instytucie Genetyki i Mikrobiologii na Wydziale Nauk Biologicznych. Dane zamieszczone w powyższym protokole oczekują na publikację. Lot nr: Data ważności: 8