1. WSTĘP: Testy proliferacji są szeroko stosowane w biologii komórki do badania czynników wzrostu, cytokin, substancji odżywczych oraz kontroli środków cytotoksycznych lub chemioterapeutycznych. Istnieje kilka sposobów ustalania liczby komórek: poprzez badanie mikroskopowe, za pomocą elektronicznych liczników cząstek lub pośrednio poprzez pomiar włączania promieniotwórczych prekursorów, określanie ilości białka całkowitego przy użyciu barwników chromogennych lub poprzez pomiar aktywności metabolicznej enzymów komórkowych. Najpopularniejszym testem wykorzystywanym do analizy proliferacji komórek jest włączenie 3H-tymidyny do DNA komórek. Test ten jest jednak bardzo pracochłonny, ponieważ wymaga usunięcia nadmiaru, niezwiązanego znacznika. W 1956 roku został opublikowany pierwszy dokument na temat stosowania soli tetrazolu jako wskaźnika żywotności komórek. Metoda ta opiera się na stwierdzeniu, że żywe komórki są zdolne do redukcji nieznacznie zabarwionych lub bezbarwnych soli tetrazolu do intensywnie zabarwionych pochodnych formazanu. Proces ten wymaga funkcjonowania mitochondriów, które są inaktywowane w ciągu kilku minut po śmierci komórki. Metoda ta stanowi zatem doskonałe narzędzie do dyskryminacji żywych i martwych komórek. Jednakże początkowo stosowane sole tetrazolu miał kilka wad, w tym nierozpuszczalnośd powstających pochodnych formazanu. Potrzebne były czaso- i pracochłonnych procedury ich rozpuszczania, w tym wielokrotne pipetowanie i mieszanie lub stosowanie niebezpiecznych solubilizatorów. Zabiegi te jednak nieodwracalnie kooczyły proliferację komórek, a tym samym uniemożliwiły przedłużanie inkubacji w celu osiągnięcia zwiększonej wrażliwości lub kontynuowanie hodowli komórkowej. Niedogodności te doprowadziły do
opracowania nietoksycznych soli tetrazolu dających rozpuszczalne produkty redukcji. Chociaż procedura testu została znacznie uproszczona przez zastosowanie barwników rozpuszczalnych, w praktyce jej wykorzystanie było ograniczone ze względu na niestabilnośd barwnika formazanu i stosunkowo niską absorbancję produktu koocowego w porównaniu do klasycznego testu MTT. Dział badao BIOMEDICA rozwiązał oba problemy i stworzył łatwy w wykorzystaniu, szybki i niezawodny nieizotopowy test proliferacji komórek. Dla wygody, zrobiliśmy test o dużej zgodności ze standardowym testem włączenia tymidyny. W związku z tym, żadne zmiany nie są wymagane podczas przygotowania testu i procedury znakowania. Ponadto nie ma potrzeby usuwania pożywki przed lub po dodaniu chromogennego substratu. Praca wykonana przez zespół BIOMEDICA zaowocowała testem, który łączy w sobie najlepsze cechy metod włączania tymidyny i MTT, a mianowicie: dokładnośd, szybkośd, niezawodnośd oraz prostotę wykonania. Ponadto, według naszych danych uzyskanych do tej pory chromofory wydają się byd nietoksyczne. 2. ZAWARTOŚD ZESTAWU Zawartośd zestawu: Ilośd SUB Substrat, zliofilizowany 10 fiolek ACT Roztwór aktywatora, gotowy do użycia 1 x 30 ml Instrukcja 1 sztuka 3. MATERIAŁY I SPRZĘT WYMAGANE, ALE NIE DOSTARCZONE: Czytnik mikropłytek wyposażony w filtr o długości fali 450 nm lub 492 nm (patrz rys. 1). Zalecamy wykorzystanie jako referencji fali o długości 620 nm do 690 nm, jest to korzystne, ale nie jest absolutnie konieczne. Rysunek 1. Spektrum absorbancji formazanu. 4. PRZYGOTOWANIE ODCZYNNIKÓW ORAZ PRÓBEK: Jedna fiolka SUB zawiera ilośd substratu wystarczającą na jedną 96-studzienkową płytkę z 200 μl medium/studzienkę.
Rozpuścid SUB (substrat) w 2,5 ml ACT (aktywator). Roztwór ogrzad do 37 C przed dodaniem. W razie potrzeby, ogrzad fiolkę substratu w dłoni podczas mieszania z aktywatorem. Procedura daje roztwór o słomkowym zabarwieniu. Rozpuszczony substrat należy wykorzystad natychmiast, nie powinien byd przechowywany. 5. OGÓLNE UWAGI DO NASTAWIANIA TESTU Z EZ4U: Przygotowanie testu odbywa się w sposób podobny do standardowej metody włączania 3Htymidyny. Zamiast inkubacji z trytonowym nukleotydem, do 200 μl próbki dodaje się 20 μl roztworu barwnika. Czas inkubacji zależy od zdolności metabolicznych komórek. Zazwyczaj dwu- do pięciogodzinnej inkubacja w temperaturze 37 C wystarcza do znacznego wzrostu intensywności koloru. Ponieważ różne komórki różnią się między sobą zdolnością do przekształcania żółtych związków tetrazolowych do czerwonych pochodnych formazanu, zalecamy testowanie zdolności metabolicznych każdej nowej linii komórkowej (patrz rys. 2). Po inkubacji płytka jest usuwana z inkubatora i delikatnie mieszana. Aby uniknąd podwyższonego odchylenia standardowego, płytka musi byd dokładnie wytrząsana przed pomiarem gęstości optycznej. Absorbancja mierzona jest przez czytnik mikropłytek, ustawiony na 450 nm lub 492 nm, jako referencję wykorzystuje się falę o długości 620 nm. Absorbancję przy 620 nm (lub długości fali 620-690 nm) wykorzystuje się w celu skorygowania wartości niespecyficznego tła wywołanego przez zanieczyszczenia komórkowe, odciski palców i inne czynniki powodujące zakłócenia. Jednak referencję można pominąd bez istotnej zmiany w dokładności testu. Rysunek 2. Zróżnicowane zdolności metaboliczne różnych linii komórkowych. 3x10 3 komórek/studzienkę było hodowane w 200 μl RPMI 1640. Po okresie hodowli wynoszącym 3 dni, do każdej studzienki dodano 25 μl barwnika. Gęstośd optyczna została zmierzona po 4 godzinach wykazując istotne różnice w zdolnościach metabolicznych różnych liniach komórkowych.
6. UWAGI: Podłoże nie jest sterylne. Jeśli warunki sterylne są wymagane, rozpuszczony gotowy do użycia barwnik musi zostad wysterylizowany przez filtrację. (Drobne zmętnienie przed filtracją nie wpływa na proces filtracji, ani na wyniki testu). Ze względu na wysoką czułośd tego testu zaleca się stosowania najmniej komórek, jak to tylko możliwe. W przeciwnym razie uzyskanie liniowej krzywej może byd niemożliwe. W celu uzyskania powtarzalnych czasów zmiany koloru, wyrównad temperaturę kultur komórkowych w 37 C. Nie należy przedłużyd czasu inkubacji bez wstępnego badania, może to spowodowad zwiększenie tła bez poprawy czułości. Wykorzystanie długości fali 620 nm jako referencji (która jest odejmowana od wartości uzyskanych w 450 lub 492 nm) nie jest absolutnie konieczne, ale zwiększa wydajnośd badania. Zastosowany chromofor wydaje się byd nietoksyczny i dlatego przedłużenie hodowli komórkowej jest możliwe po usunięciu pochodnych formazanu. 7. PROTOKÓŁ TESTU: 1. Wszystkie odczynniki i próbki przed użyciem muszą zostad doprowadzone do temperatury pokojowej (18-26 C) 2. Dodad 200 μl hodowli komórkowej do odpowiednich studzienek. 3. Dodad 20 μl SUB (substratu) do każdej studzienki, delikatnie obracad. 4. Inkubowad w temperaturze 37 C przez 2-5 godzin, w zależności od zdolności metabolicznych komórek. 5. Jeśli nie jest dostępny czytnik z możliwością wytrząsania płytek, zmixowąd płytkę na wytrząsarce lub manualnie. 6. Odczytad absorbancję przy 450 nm lub 492 nm, przyjmując 620 nm za referencję. 7. W celu uzyskania najdokładniejszych wyników od wszystkich wartości odjąd absorbancję uzyskaną dla próby ślepej - substrat w medium bez komórek. 8. WSKAZÓWKI TECHNICZNE: Odczynników nie należy mieszad ani zastępowad reagentami z innych partii lub źródeł. Nie używad korków i zakrętek pochodzących z innych odczynników, oraz nie używad odczynników między partiami. Nie należy używad odczynników po upływie ich daty ważności. Chronid przed bezpośrednim światłem słonecznym. Podczas mieszania odczynników należy unikad tworzenia piany.
9. ŚRODKI OSTROŻNOŚCI: Nie pipetowad ustami. Nie jeśd, nie pid, nie palid i nie stosowad kosmetyków w miejscu używania reagentów Należy unikad kontaktu z odczynnikami poprzez używanie rękawic. 10. LITERATURA: Hansen M. B., Nielsen S.E. and Berg K., J. Immunol. Meth. 119, 203-210, (1989) Denizoit F. and Lang R., J. Immunol. Meth. 89, 271-277, (1986) Carmichael J. et al., Cancer Res., 47, 943-946, (1987) Karasek M; Gruszka. Et al. Department of Electron Microscopy, J Pineal Res 2003 May;34(4):294-6 Klocking R. et al; Institute for Antiviral Chemotherapy; Antivir Chem Chemother 2002 13(4):241-9 Wutzler P. et al.; Institute for Antiviral Chemotherapy; Antiviral Res 2002 May;54(2):89-97