Rys. 2.1. Formy rezonansowe wiązania peptydowego

1 ĆWICZENIE 2 BUDOWA I WŁAŚCIWOŚCI PEPTYDÓW I BIAŁEK 2.1. Peptydy i białka 2.1.1. Budowa peptydów oraz białek Peptydy i białka zbudowane są z reszt aminokwasów połączonych wiązaniami peptydowymi. W zależności od liczby reszt aminokwasowych w cząsteczce peptydu wyróżnia się oligopeptydy (do 10 reszt aminokwasowych, np. dipeptydy, tripeptydy, itd.) oraz polipeptydy, czyli peptydy składające się z licznych reszt aminokwasowych. Przyjęto umownie, że peptydy o masie cząsteczkowej do 10 000 Da (10 kda) (lub do ok. 90 reszt aminokwasowych) to polipeptydy, a peptydy o masie cząsteczkowej przekraczającej tę wartość to makropeptydy, czyli białka. Największe pojedyncze łańcuch białek mogą być zbudowane z kilku tysięcy aminokwasów. Na przykład tripeptydem jest glutation (γ-glutamylocysteinyloglicyna) związek występujący we wszystkich tkankach roślinnych i zwierzęcych, a nonapeptydami: oksytocyna i wazopresyna - hormony wydzielane przez tylny płat przysadki mózgowej. Właściwości chemiczne i fizyczne peptydów i białek są pochodną właściwości aminokwasów wchodzących w ich skład. Ze względu na możliwość występowania wiązania peptydowego w dwóch formach rezonansowych, wiązanie C-N ma częściowo charakter wiązania podwójnego, tzn. nie wykazuje swobodnej rotacji (rysunek 2.1). Rys. 2.1. Formy rezonansowe wiązania peptydowego Oprócz tzw. struktury pierwszorzędowej (sekwencji aminokwasów), w białkach wyróżnia się jeszcze trzy poziomy organizacji strukturalnej: struktury II-, III-rzędowe i IV-rzędowe w białkach podjednostkowych. Przestrzenne ukształtowanie cząsteczki białka (konformacja) wynika z sekwencji aminokwasów i "dążenia" układu (cząsteczki białka i środowiska) do osiągnięcia stanu o najniższej energii. Sekwencja aminokwasowa białka determinuje w sposób jednoznaczny (w danych warunkach środowiska) jego strukturę przestrzenną. Struktury II-rzędowe to lokalne struktury

2 przestrzenne utworzone przez kolejne aminokwasy w łańcuchu polipeptydowym. Struktury drugorzędowe są stabilizowane przez wiązania wodorowe pomiędzy grupami atomów tworzącymi wiązania peptydowe. Typowe, regularne struktury drugorzędowe to: α-heliks, struktura β (dywanowa lub pofałdowanej kartki) i zakręt β. Struktura trzeciorzędowa opisuje rozmieszczenie w przestrzeni całego łańcucha polipeptydowego. Oddziaływaniami determinującymi powstanie struktury trzeciorzędowej są oddziaływania grup bocznych aminokwasów ze środowiskiem (najczęściej wodnym, ale np. dla białek błonowych - lipidowym) oraz oddziaływania wodorowe, jonowe i van der Waalsa pomiędzy grupami bocznymi aminokwasów. Niekiedy struktura trzeciorzędowa jest stabilizowana mostkami disiarczkowymi. Mostki te mogą łączyć fragmenty tego samego łańcucha lub, w przypadku białek o strukturze IV-rzędowej, różne łańcuchy polipeptydowe. Strukturę IV-rzędową posiadają białka składające się z więcej niż jednego łańcucha polipeptydowego np. insulina (rys. 2.2.), hemoglobina, immunoglobuliny. Struktura ta powstaje z powiązania ze sobą kilku łańcuchów polipeptydowych, z których każdy ma swoją własną strukturę I-, II- i III-rzędową. Dopiero w wyniku właściwego dopasowania tych łańcuchów powstaje biologicznie aktywna cząsteczka białka. Rys. 2.2. Insulina - hormon zbudowany z dwóch łańcuchów polipeptydowych Ze względu na kształt cząsteczki rozróżniamy białka globularne i fibrylarne (włókienkowe). W białkach fibrylarnych łańcuchy polipeptydowe są rozciągnięte, a ich kształt przypomina długą płytkę. W białkach globularnych łańcuchy są zwinięte w zwartą strukturę sferyczną (globulę). Metodami badawczymi o największej dokładności, stosowanymi przy badaniu struktury przestrzennej białek, są krystalografia rentgenowska i dwukierunkowy magnetyczny rezonans jądrowy (NMR).

3 2.1.2. Właściwości peptydów oraz białek W określonym ph środowiska, powyżej lub poniżej pi, białka maja ładunek odpowiednio ujemny lub dodatni, w wyniku czego zostają otoczone dipolowymi cząsteczkami wody. Wokół cząsteczek białka powstaje warstwa solwatacyjna (otoczka wodna). Właściwość ta warunkuje zawieszenie białek w roztworze (tzw. koloidalnym). Pozbawienie cząsteczek białka ładunku lub otoczki wodnej prowadzi do łączenia się pojedynczych cząsteczek w agregaty i tworzenia się osadu (koagulacja). Dzięki temu, że białka o różnym pi w tym samym ph środowiska będą miały różny ładunek i powinowactwo do wody, możliwe jest ich frakcjonowanie. Wytrącanie poszczególnych białek z roztworu otrzymuje się przez selektywne pozbawianie ich ładunku, które można uzyskać w wyniku: zobojętnienia cząsteczek białka odpowiednimi przeciwjonami, doprowadzenie ph roztworu do pi danego białka. Wytrącanie białek uzyskuje się także przez usunięcie warstwy solwatacyjnej, dodając związki o wyższym powinowactwie do wody niż cząsteczka białka (wysalanie) lub też zmniejszenie ilości dipolowych cząsteczek wody na powierzchni białka w wyniku dodania rozpuszczalnika o niskiej stałej dielektrycznej (etanol, aceton). Aby uzyskać natywne białka, należy proces prowadzić w niskiej temperaturze (0-5 o C) i dość wolno (np. powolny wzrost stężenia soli lub rozpuszczalnika). Zbyt nagłe i drastyczne zmiany środowiska będą prowadziły do zniszczenia struktur białka (denaturacja). Denaturacją nazywane są wszystkie zmiany w strukturze cząsteczki białka, prowadzące do utraty właściwości biologicznych (jest to przejście od wysoko uporządkowanej i rozwiniętej struktury do nieuporządkowanych łańcuchów polipeptydowych z jednoczesną utratą właściwości biologicznych). Denaturacja cząsteczek białka, polegająca na zniszczeniu słabych oddziaływań stabilizujących cząsteczkę, najczęściej jest odwracalna, zniszczenie wiązań kowalencyjnych na ogół prowadzi do denaturacji nieodwracalnej. Do denaturacji dochodzi pod wpływem czynników chemicznych lub fizycznych. Do czynników denaturujących należą: duże stężenia soli nieorganicznych, jony metali ciężkich, silne kwasy, zasady, reakcje utlenienia i redukcji, wysoka temperatura, promieniowanie UV, rentgenowskie, uszkodzenia mechaniczne. Rozpuszczalniki organiczne obniżające potencjał elektrokinetyczny (alkohole, aceton, eter dietylowy) i detergenty osłabiają wiązania hydrofobowe cząsteczek białka; oddziaływują bezpośrednio z naładowanymi grupami na powierzchni cząsteczki, przez co dezorganizują warstwę solwatacyjną. Działanie denaturujące tych związków pojawia się przy stosowaniu ich w większych stężeniach lub po dłuższym czasie działania i często w wyższych temperaturach (powyżej 30 o C).

4 Do selektywnego wytrącania białek stosuje się najczęściej siarczan(vi) amonu, a niekiedy siarczan(vi) magnezu lub etanol. Różnice stężeń tych odczynników, w których poszczególne rodzaje białek dają się wysalać, służą do rozdzielenia mieszanin różnych rodzajów białek. Globuliny w środowisku o ph 5-6 wytrącają się już przy stężeniu 15% etanolu, albuminy w środowisku o ph 4,8 przy 40% stężeniu etanolu. W przypadku albumin w roztworze o ph znacznie różniącym się od pi (4,8) konieczne jest użycie wyższych stężeń etanolu. 2.2. Chromatografia podstawowa metoda oczyszczania białek Podstawowe metody izolowania, oczyszczania i charakterystyki białek wykorzystują ich właściwości elektrostatycznych (wysalanie, chromatografia jonowymienna, elektroforeza) oraz na różnicach mas cząsteczkowych (sączenie molekularne, ultrawirowanie). Chromatografia jest jedną z metod rozdzielania mieszanin związków. Wśród typów chromatografii można wyróżnić te, w których rozdzielane związki z różną siłą wiążą się (w sposób odwracalny) z nośnikiem. Z najsłabszymi oddziaływaniami mamy do czynienia w przypadku chromatografii adsorpcyjnej, gdzie w wiązaniu substancji rozdzielanych na nośniku (adsorbencie) odrywają główną rolę oddziaływania typu elektrostatycznego (dipolowe, van der Waalsa, wodorowe, itp.). Ten typ chromatografii został szczegółowo omówiony w ćwiczeniu poświęconym związkom lipidowym. Mieszaninę związków różniących się ładunkiem elektrycznym można rozdzielić metodą chromatografii jonowymiennej. W tej metodzie stosuje się złoża (jonity) obdarzone odpowiednim ładunkiem: na kationitach wiązane są i wymieniane kationy, na anionitach zaś aniony. Chcąc na przykład wydzielić (spośród różnych białek) białka, które w ph 6,0 mają wypadkowy ładunek dodatni, zastosujemy jonit o ładunku ujemnym (kationit), np. CM-Sephadex, przez który przepuszczony będzie (np. w kolumnie) roztwór o ph 6,0 zawierający rozdzielane białka. Białka o ładunku ujemnym lub zerowym (pi) nie zwiążą się z jonitem i wypłyną z kolumny, natomiast wszystkie kationy zostaną związane, z siłą zależną od liczby i mocy utworzonych wiązań jonowych. Aby je wymyć z jonitu, należy spowodować rozerwanie tych wiązań. W tym celu należy przepuścić przez jonit roztwór zawierający silne kationy (o wyższym ph lub większej sile jonowej), co spowoduje, że między związanymi białkami a jonitem nie będzie oddziaływań i zostaną wypłukane (wyeluowane). W chromatografii powinowactwa mamy do czynienia ze specyficznymi oddziaływaniami danego typu związków z odpowiednio zmodyfikowanym nośnikiem. Na nośniku unieruchomione może zostać np. jakieś przeciwciało (zwiąże się wówczas odpowiedni antygen), substrat, inhibitor

5 lub koenzym danej reakcji enzymatycznej (zwiąże się enzym), łańcuch poliurydylowy (zwiążą się mrna z końcami poliadenylowymi). Chromatografia powinowactwa jest niewątpliwie najbardziej selektywną spośród stosowanych metod chromatograficznych, niestety, nie zawsze można znaleźć specyficzny element, który umożliwi wybiórcze związanie izolowanej substancji na nośniku, a dodatkowy problem stanowi często odłączenie związanej cząsteczki bez zmiany jej właściwości chemicznych lub biologicznych. Oczyszczane związki, selektywnie związane z ligandem, uwalniane są najczęściej przez dodanie roztworu wolnego ligandu, odpowiedniego stężenia soli lub zmianę ph. Specyficznym rodzajem chromatografii powinowactwa jest chromatografia IMAC czyli chromatografia na nośnikach z immobilizowanymi jonami metali, stosowana najczęściej do wydzielania białek rekombinowanych nadprodukowanych w różnych systemach ekspresyjnych. Technika ta zostanie omówiona dokładniej w następnej części ćwiczenia. W ostatnim z podstawowych typów chromatografii, chromatografii podziałowej, rozdzielane związki nie powinny oddziaływać z nośnikiem, a ich rozdział opiera się na zróżnicowanym powinowactwie (głównie chodzi o rozpuszczalność) do nieruchomej fazy (stacjonarnej) związanej na nośniku i do przepływającej przez nośnik fazy ruchomej. Zgodnie z prawem Nernsta, substancja znajdująca się w układzie nie mieszających się ze sobą dwóch faz ciekłych, występuje w tych fazach w określonych stężeniach, a stosunek jej stężeń w obu fazach jest (w stanie równowagi) wielkością stałą, nazywaną współczynnikiem podziału. Wartość współczynnika podziału nie zależy od ilości rozdzielanej substancji, zależy natomiast od warunków chromatografii (temperatura, ciśnienie, skład chemiczny i czystość obu faz, itp.). Najczęściej obie fazy są cieczami (chromatografia cieczowo cieczowa). Jeśli faza stacjonarna jest bardziej polarna niż faza ruchoma, to mamy do czynienia z chromatografią podziałową fazy normalnej, natomiast gdy sytuacja jest odwrotna (faza stacjonarna mniej polarna niż ruchoma), mówimy o chromatografii w fazie odwróconej. Fazę ruchomą może także stanowić gaz (zwykle gaz szlachetny), jest to wówczas chromatografia cieczowo gazowa. Chromatografia podziałowa znalazła szerokie zastosowanie do rozdzielania praktycznie wszystkich typów związków, zarówno drobnocząsteczkowych, jak i wielkocząsteczkowych. Stosowana jest w różnych technikach: kolumnowej, bibułowej, cienkowarstwowej, wysokorozdzielczej i wysokociśnieniowej (HPLC). Specyficznym rodzajem chromatografii podziałowej jest tzw. sączenie molekularne (filtracja żelowa), w którym fazę stacjonarną i ruchomą stanowi taka sama ciecz, a rozdziela się rozpuszczalne w wodzie wielkie cząsteczki (głównie białka) charakteryzujące się zbliżonym kształtem (zwykle sferyczne), ale różne co do wielkości. Ta technika zostanie dokładniej omówiona w dalszej części ćwiczenia.

6 2.3. Wykonanie ćwiczenia 2.3.1. Oddzielanie białek od zanieczyszczeń drobnocząsteczkowych Podczas oczyszczania białek często zachodzi konieczność usunięcia z roztworu związków drobnocząsteczkowych (np. soli) lub zmiany składu buforu. W tym celu stosuje się dializę lub sączenie molekularne. W ćwiczeniu zamiast białka używany jest łatwy do bezpośredniej obserwacji barwny związek - Blue Dextran (zabarwiony na niebiesko polisacharyd o masie cząsteczkowej około 2 000 kda) oraz związek drobnocząsteczkowy heksacyjanożelazian(iii) potasu o barwie żółtej. A. Dializa Zjawisko dializy polega na przechodzeniu przez półprzepuszczalną błonę małych cząsteczek, a zatrzymywaniu związków o cząsteczkach zbyt dużych, by mogły przejść przez pory w błonie. Woreczki do dializy wykonywane są m.in. z celofanu o porach o ściśle określonej wielkości. W środowisku wodnym następuje wyrównanie stężeń (po obu stronach błony) dla związku o cząsteczkach mniejszych niż pory w błonie, natomiast cząsteczki większe pozostają w woreczku dializacyjnym. Mieszanie przyśpiesza proces wyrównywania się stężeń, a wymiana płynu (buforu), w którym znajduje się woreczek, zwiększa efektywność procesu. Odczynniki i aparatura 1. 5 ml roztworu Blue Dextranu w wodzie (3 mg/ml) 2. 5 ml roztworu heksacyjanożelazianu(iii) potasowego w wodzie (30 mg/ml) 3. woreczek do dializy o pojemności ok. 5-10 ml 4. zlewka o pojemności 0,8-1,5 litra 5. mieszadło magnetyczne. Wykonanie W woreczku dializacyjnym namoczonym uprzednio w wodzie umieścić zmieszane w proporcji 1:1 roztwory Blue Dextranu i heksacyjanożelazianu(iii) potasowego (około 5-10 ml). Woreczek zawiązać lub zacisnąć ściskaczem i umieścić w zlewce z wodą, mieszać na mieszadle magnetycznym. Obserwować zmianę zabarwienia roztworu w woreczku z zielonej (mieszanina) na niebieską (Blue Dextran) i cieczy w zlewce z bezbarwnej (woda) na żółtą (roztwór heksacyjanożelazianu(iii) potasowego). B. Sączenie molekularne Sączenie molekularne (filtracja żelowa, chromatografia na sitach molekularnych) jest jedną z odmian chromatografii podziałowej. Ziarna żeli używanych do sączenia są silnie porowate, a związki z jakich są zbudowane (np. usieciowane polisacharydy) wykazują duże powinowactwo do wody, co

7 prowadzi do ich pęcznienia. Do wnętrza wypełnionych wodą porów w cząstkach żelu łatwo mogą wnikać (dyfundować) związki drobnocząsteczkowe, ale nie penetrują tam cząsteczki o średnicy większej niż średnica porów. Im cząsteczka mniejsza, tym łatwiej i głębiej może wniknąć w głąb ziarna żelu. Im cząsteczka łatwiej wnika do ziaren żelu, tym ma dłuższą drogę do pokonania w czasie rozdziału: cząsteczki duże przepływają szybko pomiędzy ziarnami żelu, a małe, wnikając do wnętrza ziaren, wypływają z kolumny chromatograficznej dopiero po dłuższym czasie (rys. 2.5.). Rys. 2.5. Schematyczne przedstawienie sączenia molekularnego Najczęściej stosowanym złożem do sączenia molekularnego jest żel dekstraowy Sephadex. Materiałem wyjściowym do produkcji tego sita molekularnego jest naturalny dekstran, wielkocząsteczkowy glikan wytwarzany przez bakterie Leuconostoc mesenteroides. Zawiera on 90-95% wiązań α-1 6-glikozydowych (pozostałe wiązania to 1 3). Naturalny dekstran jest substancją niejednorodną o masie cząsteczkowej 10-300 kda, natomiast do syntezy ziaren typu Sephadex wykorzystuje się dekstran o masie 30-50kDa. Daje to ziarna o zdolności wiązania wody w graniczach 25 ml/g suchego żelu. Usieciowanie cząsteczek polega na kontrolowanym wprowadzaniu w reakcji z epichlorohydryną mostków poprzecznych łączących dwa sąsiednie łańcuchy dekstranu (rys. 2.6.).

8 Rys. 2.6. Schemat sieciowania łańcuchów dekstranu za pomocą epichlorohydryny. Liczba mostków wyznacza rozmiar oczek wytworzonej sieci, im więcej mostków poprzecznych, tym mniejsze oczka sieci i od nich zależy zdolność rozdzielcza (frakcjonowania) żelu. Dostępne są preparaty Sephadex o różnej, ściśle określonej wielkości porów, dostosowane do rozdziału cząsteczek o różnej wielkości. Charakterystyka najważniejszych przedstawiona jest w tabeli 1. Tabela 1. Charakterystyka i zastosowanie żeli Sephadex Typ żelu Wiązanie wody [ml] przez 1g suchego żelu Objętość 1g spęczniałego żelu [ml] Średnica ziaren [µm] G-10 1,0 2-3 40-120 do 0,7 G-15 1,5 2,5-3 40-120 do 1,5 G-25 2,5 4-6 50-150 1-5 G-50 5,0 9-11 50-150 1,5-30 G-100 10,0 15-20 10-40 4-150 G-200 20,0 20-25 10-40 5-800 Zakres frakcjonowania wg mas cząst. [kda] Sączenie molekularne stosuje się najczęściej do oznaczania orientacyjnej masy cząsteczkowej białek, rozdzielania mieszanin i odsalania roztworów substancji wielkocząsteczkowych. W przypadku związków wielkocząsteczkowych o zbliżonych rozmiarach cząsteczek (np. dwóch białek globularnych

9 o masach cząsteczkowych 25 i 40 kda) także możliwe jest ich rozdzielenie dzięki wykorzystaniu drobnych różnic w łatwości wnikania ich cząsteczek do ziaren odpowiednio dobranego żelu. Związek niepenetrujący do wnętrza ziaren żelu (w ćwiczeniu Blue Dextran) pojawi się w wycieku z kolumny chromatograficznej wcześniej (tzn. w objętości pustej V 0 ), niż związek swobodnie wnikający do ziaren żelu (w ćwiczeniu heksacyjanożelazianu(iii) potasu). Odczynniki i aparatura 1. 0,9% roztwór NaCl 2. zawiesina Sephadex G-25 medium w 0,9% NaCl napęczniała uprzednio przez 24 h w H 2 O, przechowywana w lodówce 3. roztwór Blue Dextranu 2000 3 mg/ml w 0,9% NaCl 4. roztwór heksacyjanożelazianu(iii) potasowego 30 mg/ml w 0,9% NaCl 5. kolumna chromatograficzna (około 1 15 cm) 6. pipetka pasteurowska 7. probówki kalibrowane 10 15 ml (15 szt.) Wykonanie Wylot kolumny chromatograficznej zatkać, kolumnę napełnić roztworem NaCl do około 1/3 wysokości, następnie wlać taką ilość zawiesiny Sephadex, by uformowało się złoże o wysokości około 10 12 cm. Otworzyć wylot i przepłukać kolumnę około 20 ml roztworu NaCl. Po zrównaniu poziomu cieczy z górną powierzchnią słupa żelu, zatkać wylot kolumny. Nanieść na powierzchnię żelu około 200-400 µl mieszaniny 1:1 roztworów Blue Dextranu i żelazicyjanku. Otworzyć wylot kolumny i od tego momentu zbierać do kalibrowanych ponumerowanych probówek wyciek z kolumny (frakcje o objętości około 1 ml). W chwili wsiąknięcia barwnego roztworu w żel delikatnie, nie naruszając powierzchni żelu, nawarstwić kilka mililitrów roztworu NaCl i prowadzić chromatografię, uzupełniając poziom roztworu nad żelem, aż do całkowitego wymycia z kolumny żółtego roztworu heksacyjanożelazianu(iii) potasowego. Zmierzyć objętość wycieku do momentu pojawienia się w nim Blue Dextranu (V 0, objętość pusta kolumny) i objętość wycieku do momentu pojawienia się w nim heksacyjanożelazianu (V t objętość całkowita kolumny). 2.3.2. Oczyszczanie białek za pomocą chromatografii powinowactwa Chromatografia chelatująca na nośnikach z immobilizowanymi jonami metali (IMAC Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography) jest jedną z najczęściej stosowanych metod w oczyszczaniu białek rekombinowanych. Wykorzystuje się w niej obecność w łańcuchu białkowym aminokwasów takich jak histydyna, arginina, tryptofan, które mogą być donorami par elektronowych i mogą tworzyć kompleksy z jonami metali. W metodzie tej jon metalu (najczęściej Cu 2+, Ni 2+, Zn 2+,

10 Co 2+ ) jest immobilizowany na nierozpuszczalnym w wodzie nośniku z kowalencyjnie związanym chelatorem, takim jak kwas iminodioctowy (IDA) lub kwas nitrylotrioctowy (NTA) (rys 2.7.). Rys.2.7. Struktura chelatujących ligandów i ich kompleksów z jonem niklu (materiały firmy Qiagen) Związki te mają zdolność do silnego kompleksowania jonów metali przejściowych. Pozostałe wartościowości metalu mogą być wykorzystane do wytworzenia kompleksu z białkiem, w zależności od chelatora poprzez trzy lub dwa wiązania koordynacyjne. Siła adsorpcji białka zależy od zawartości wyżej wymienionych aminokwasów, od rodzaju metalu i ph. W przypadku naturalnie występujących białek, ich adsorpcja na nośniku zależy głównie od tworzenia kompleksów pomiędzy immobilizowanym metalem, a resztami histydyny (inne aminokwasy odgrywają niewielką rolę). Wykazano również, że siła adsorpcji w mniejszym stopniu zależy od zawartości reszt imidazolowych histydyny, a bardziej od ich położenia w łańcuchu polipeptydowym, najsilniej adsorbują się białka, w których reszty histydynowe są w pobliżu siebie. Wykorzystano to do opracowania szybkiej, prostej i wydajnej metody oczyszczania białek rekombinowanych, w których do sekwencji kodującej dane białko dodano sekwencję kodującą kilka reszt histydyny (zazwyczaj 6 reszt), czyli tzw. metkę histydynową (nazywane też Histag lub znacznikiem histydynowym) (rys. 2.8). Tak zmodyfikowane białko wiąże się silnie na kolumnie z immobilizowanymi jonami metalu niż większość natywnych białek, które mogą być wymyte roztworem o niskim stężeniu imidazolu. Zaadsorbowane białka eluuje się przy wysokim stężeniu imidazolu, który zależy od chelatora i jonu metalu. Najczęściej jonem metalu jest nikiel, a chelatorem kwas nitrylotrioctowy i do elucji stosuje się imidazol o bardzo wysokim stężeniu (250-500 mm).

11 Rys. 2.8. Schematyczny obraz kompleksu NTA metka histydynowa (materiały firmy Qiagen) Celem ćwiczenia będzie wydzielenie bezpośrednio z lizatu bakteryjnego rekombinowanego enzymu podjednostki katalitycznej ludzkiej kinazy kazeinowej 2 (CK2α) z wykorzystaniem techniki IMAC. Następnie za pomocą elektroforezy SDS-PAGE sprawdzona zostanie efektywność oczyszczania. (Uwaga! Teoria dotycząca elektoforezy SDS-PAGE opisana jest w ćwiczeniu 10). Odczynniki i aparatura 1. lizat bakteryjny w buforze ekstrakcyjnym A, zawierający rekombinowany enzym (otrzymany przez wklonowanie genu kodującego CK2α w wektor ekspresyjny petduet i użytym następnie do transformacji E.coli BL21(DE3)pLysS) 2. Nośnik chromatograficzny Ni-NTA agaroza (Qiagen) 3. Bufor ekstrakcyjny A: 20 mm NaH 2 PO 4, 500 mm NaCl, 10 mm imidazol, ph 8 4. Bufor myjący B: 20 mm NaH 2 PO 4, 500 mm NaCl, 30 mm imidazol, ph 8 5. Bufor elucyjny C: 20 mm NaH 2 PO 4, 500 mm NaCl, 300 mm imidazol, ph 8 6. Mieszanina standardów białkowych M 7. Bufor ładujący do elektoforezy: 100 mm Tris ph 6,8; 4% SDS; 20% glicerol; 2% β-metkaptoetanol; 0,02% Bromophenol Blue 8. Bufor elektrodowy: 100 mm Tris base, 100 mm glicyna, 0,1% SDS 9. Roztwór do barwienia żeli D: 45% metanol, 10% kwas octowy, 0,25% Coomassie blue R-250 10. Roztwór odbarwiający E: 45% metanol, 10% kwas octowy 11. Roztwór odbarwiający F: 10% kwas octowy 12. kolumna chromatograficzna (około 1 10 cm) 13. pipetki pasteurowskie 14. probówki szklane 15. Zestaw do elektroforezy: zasilacz stabilizowany do 300V, komora elektroforetyczna, płytki szklane z żelem poliakryloamidowym o stężeniu 12,5% (przygotowane przez prowadzącego). 16. Pipety automatyczne 17. Próbówki typu eppendorf 18. Termoblok

12 Wykonanie A. Chromatografia IMAC a) Przygotowanie kolumny do chromatografii: kolumn zawiera 1ml agarozy Ni-NTA, przed nałożeniem roztworu białka należy przemyć ją 3x1,5ml buforu A. Nad złożem powinna pozostać 1mm warstwa buforu, a następnie należy założyć na wylot kolumny korek. b) Z otrzymanego lizatu przenieść ok. 200 µl do próbówki eppendorf (próba kontrolna L1 do elektroforezy). Następnie pipetką do kolumny przenieść 3 ml lizatu, delikatni wymieszać ze złożem i zostawić na 15 min w celu związania białka ze złożem. c) Zdjąć korek z wylotu kolumny i wyciek zebrać do czystej próbówki (frakcja W0). d) Nanieść na kolumnę 5x1,5 ml buforu B i każdą z porcji zbierać do osobnych próbówek (frakcje W1-W5) e) Na wylot kolumny założyć korek. Nanieść na kolumnę 1,5 buforu C, delikatnie wymieszać ze złożem i zostawić na 10 min. Wyciek zebrać do czystej próbówki (frakcja E1) f) Na kolumnę nanieść 2x1,5 ml buforu C, a wyciek zbierać do kolejnych próbówek (frakcje E2- E3). g) Kolumnę zregenerować przepłukując ją kolejno 2x1,5 ml budoru C i 5x1,5 ml buforu A. Pozostawić kolumnę z warstwą buforu nad złożem. B. Elektroforeza a) Przygotować 9 probówek eppendorf. Odpipetować kolejno po 15 µl roztworów M, L1, W0, W1, W3, W5, E1, E2, E3. Do każdej próbówki dodać po 15 µl buforu ładującego do elektroforezy, dokładnie wymieszać i zwirować. Próbki zdenaturować w 90 o C przez 2 min. b) Płytki z żelem PAGE umieścić w aparacie do elektroforezy. Nalać buforu elektrodowego pomiędzy płytki, tak aby grzebienie były całkowicie zanurzone, a także do głównego pojemnika do oznaczonego poziomu. Delikatnie wyjąć grzebienie i założyć prowadnice do wprowadzania próbek. c) 20 µl każdej z próbek przenieść do studzienek żelu poliakrylamidowego w kolejności podanej w pkt. a. Zamknąć pokrywę i podłączyć zasilacz. Elektroforezę prowadzić przez 30 min pod napięciem 200V. Wyłączyć zasilacz. d) Płytki wyjąć z aparatu, bufor zlać do butelki. Koniec plastikowej szpachelki wsunąć pomiędzy płytki, delikatnie podważyć i rozdzielić płytki. Ostrożnie przenieść żel do plastikowego pojemnika. Żel zalać roztworem do barwienia żeli D i umieść na 5 min na wytrząsarce. Roztwór zleć z powrotem do butelki. Żel odbarwiać w buforze E przez 5 min, a następnie zalać go 10% kwasem octowym i pozostawić na wytrząsarce do całkowitego uwidocznienia białek.

13 IV. DODATEK - ELEKTROFOREZA SDS-PAGE Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (PAGE, poliacryl gel electrophoresis) umożliwia rozdział cząsteczek na zasadzie różnic w ruchliwości w polu elektrycznym przy jednoczesnym działaniu nośnika jako sita molekularnego. Żel poliakrylamidowy ma wiele zalet: jest łatwy i szybki w przygotowaniu, chemicznie obojętny, bezbarwny i pozbawiony ładunków elektrostatycznych. Odznacza się dużą wytrzymałością mechaniczna i termiczną, a także ma określone rozmiary oczek sita molekularnego. Wielkość oczek sieci zależy od proporcji pomiędzy monomerami substancji polimeryzujących: akrylamidu i N,N -metyleno-bis-akrylamidu (pot. bis-akrylamid). Od ilości bisakrylamidu w mieszaninie zależy liczba wiązań poprzecznych, która decyduje o gęstości sita molekularnego. Do przeprowadzenia polimeryzacji konieczny jest dodatek inicjatora czyli nadsiarczanu(vi) amonu (APS), który pod wpływem katalizatora N,N,N,N -tetrametyloetylenodiaminy (TEMED) rozpada się na wolne rodniki tlenowe, pod wpływem których tworzą się rodniki akrylamidowe i zostaje rozpoczęta reakcja polimeryzacji. W standardowej elektroforezie żelowej rozdział białek w polu elektrycznym następuje głównie na podstawie różnic w posiadanym ładunku, ale technika ta może być też wykorzystana do określania mas cząsteczkowych. Jeżeli białko zdenaturuje się poddając je działaniu substancji redukujących wiązania disiarczkowe (β-merkaptoetanol lub ditiotrienol) oraz anionowych związków powierzchniowo czynnych (sól sodowa siarczanu dodecylu, SDS), oprócz masy cząsteczkowej, można także określić skład podjednostkowy danego białka. SDS oddziaływuje w podobny sposób z większością polipeptydów, ponieważ ujemnie naładowane cząsteczki detergentu wiążą się z białkiem w stałym stosunku wagowym i maskują ich natywny ładunek. Kompleksy SDS-białko charakteryzują się stałym stosunkiem ładunku do masy i identycznym kształtem, ponieważ SDS powoduje rozwinięcie struktur globularnych. Dlatego też w elektroforezie kompleksy takie rozdzielają się tylko na podstawie sączenia molekularnego w żeli poliakrylamidowym, a ich ruchliwość jest funkcją tylko masy cząsteczkowej. Stosując elektroforezę SDS-PAGE możemy wyznaczyć masę cząsteczkową nieznanego białka, porównując jego ruchliwość do białek wzorcowych. W praktyce stosuje się kilka podstawowych metod rozdziału SDS-PAGE, głównie metodę Leammli ego, w której elektroforezę prowadzi się w nieciągłym systemie buforowym, w układzie dwóch żeli poliakrylamidowych (żel zagęszczający i żel rozdzielający), różniących się stężeniem i ph. Do przygotowania 12,5% żelu SDS-PAGE potrzebne są: a) Roztwór monomerów: 40% roztwór akrylamidu-bisakrylamidu w stosunku 37,5:1 b) Bufor żelowy A: 1,5 M Tris-HCl ph 8,8

14 c) Bufor żelowy B: 0,5 M Tris-HCl ph 6,8 d) 20% SDS e) 10% APS f) TEMED g) ddh 2 O Żel rozdzielający przygotowuje się mieszając składniki w określony stosunku (dla żelu o stężeniu akrylamidu 12,5% to 6,6ml akrylamidu, 7,0ml buforu A, 7,0ml wody, 100µl 20% SDS, 140µl 10% APS i 20µl TEMED). Mieszaninę natychmiast przelewa się do kasety zbudowanej z dwóch szklanych płytek, nanosi się niewielką objętość wody i pozostawia na 20-30min, aby zaszła reakcja polimeryzacji. Następnie usuwa się wodę, powierzchnię żelu delikatnie osusza bibułą, nanosi się żel zagęszczający (akrylamid 0,9 ml; bufor B 2,0 ml, woda 4,5 ml; 20% SDS 35µl; 10% APS 70µl; TEMED 15µl) i wsuwa grzebień w taki sposób żeby pomiędzy zębami nie powstały pęcherzyki powietrza, a roztwór wypełnił szczeliny pomiędzy zębami (rys.2.9). Całość ponownie pozostawia się na 20 min do polimeryzacji. Rys. 2.9. Przygotowanie kasety i polimeryzacja

15 V. PYTANIA I ZADANIA 1. Narysuj tripeptyd: Ala-Gly-Trp. 2. Scharakteryzuj struktury białek (I-, II-, III- i IV-rzędową) i omów wiązania chemiczne biorące udział w tworzeniu każdej z nich. 3. Podaj przykłady białek o strukturze IV-rzędowej i omów ich budowę. 4. Omów poszczególne rodzaje chromatografii. 5. Wyjaśnij co to jest biuret. Podaj mechanizm reakcji biuretowej (reakcji Piotrowskiego). 6. Wyjaśnij na czym polega proces denaturacji białek. Wymień czynniki które ją powodują. 7. Wyjaśnij, jaki rodzaj żelu należy zastosować, aby rozdzielić dwa związki, których cząsteczki znacznie różnią się od siebie wielkością.