Nr kat. EM09, EM11 Wersja zestawu: 1.2014 Zestaw do izolacji RNA z tkanek zwierzęcych oraz linii komórkowych EXTRACTME jest zastrzeżonym znakiem towarowym firmy BLIRT S.A.
www.dnagdansk.com
Nr kat. EM09, EM11 I. PRZEZNACZENIE ZESTAWU Zestaw EXTRACTME TOTAL RNA przeznaczony jest do szybkiej i wydajnej izolacji całkowitego RNA o wysokiej czystości z 1 30 mg tkanki (świeżej lub mrożonej) oraz 10 4 10 7 komórek linii komórkowych. Protokół izolacji i składy buforów zostały zoptymalizowane w celu osiągnięcia wysokiej wydajności i czystości izolowanego RNA. Produkt przeznaczony jest wyłącznie do użytku w celach badawczych. II. SKŁAD I PRZECHOWYWANIE ZESTAWU LICZBA IZOLACJI 25 IZOLACJI 100 IZOLACJI 250 IZOLACJI 3 IZOLACJE (DEMO) Nr katalogowy EM09-025 EM09-100 EM09-250 EM09-D RLys Buffer * (RNA Tissue Lysis Buffer) 17 ml 68 ml 170 ml 2 ml RW1 Buffer (conc.) ** (RNA Wash Buffer 1) 9 ml 36 ml 90 ml 2 ml **** RW2 Buffer (RNA Wash Buffer 2) 29 ml 116 ml 290 ml 3,5 ml REB (RNA Elution Buffer) 2,5 ml 2 x 5 ml 5 x 5 ml 0,3 ml RNA Homogenizing Columns H (kolumny homogenizacyjne) RNA Purification Columns B (kolumny wiążące) Bead Beating Tubes*** (probówki z kulkami ceramicznymi) 25 szt. 2 x 50 szt. 5 x 50 szt. 3 szt. 25 szt. 2 x 50 szt. 5 x 50 szt. 3 szt. 25 szt. 2 x 50 szt. 5 x 50 szt. 3 szt. Collection Tubes (2 ml) 25 szt. 2 x 50 szt. 5 x 50 szt. 3 szt. * Bezpośrednio przed izolacją do RLys Buffer należy dodać 100% ß-merkaptoetanolu do końcowego stężenia 1%. Trwałość RLys Buffer po dodaniu ß-merkaptoetanolu wynosi 4 tygodnie w temp. 2 8⁰C. Stąd też, w przypadku izolacji RNA prowadzonej partiami, należy przenieść odpowiednią do izolacji ilość RLys Buffer do osobnej butelki (wolnej od RNaz) i dodać ß-merkaptoetanol. Po dodaniu ß-merkaptoetanolu zalecane jest oznaczenie butelki. 3
** Przed pierwszym użyciem do RW1 Buffer należy dodać odpowiednią ilość 96 100% etanolu (informacja na etykietach oraz w tabeli na następnej stronie). Po dodaniu etanolu zalecane jest oznaczenie butelki. *** Wchodzą w skład zestawu EXTRACTME TOTAL RNA PLUS (EM11). **** Uwaga: w zestawie DEMO (EM09 D) RW1 Buffer zawiera już etanol. LICZBA IZOLACJI 25 IZOLACJI 100 IZOLACJI 250 IZOLACJI 3 IZOLACJE (DEMO) Nr katalogowy EM09-025 EM09-100 EM09-250 EM09-D RLys Buffer 17 ml 68 ml 170 ml 2 ml 100% ß-merkaptoetanol 170 µl 680 µl 1,7 ml 20 µl RW1 Buffer 9 ml 36 ml 90 ml 2 ml Etanol 96-100% 9 ml 36 ml 90 ml - Całkowita objętość 18 ml 72 ml 180 ml 2 ml Bufory RLys, RW1, REB należy przechowywać w temp. +4⁰C. Pozostałe składniki zestawu należy przechowywać w temp. pokojowej (15-25 C). Wszystkie roztwory z zestawu należy przechowywać szczelnie zamknięte, aby uniknąć zmiany stężeń w wyniku parowania. Odpowiednio przechowywany zestaw zachowuje stabilność minimum przez okres 12 miesięcy. III. WYMAGANE MATERIAŁY I SPRZĘT etanol 96 100% cz.d.a. 100% ß-merkaptoetanol (ß-ME) jałowe probówki wirownicze typu Eendorf (1,5 2 ml) wolne od RNaz pipety automatyczne oraz odpowiednie końcówki do pipet (wolne od RNaz) rękawiczki jednorazowe mikrowirówka z rotorem na probówki o obj. 1,5 2 ml (> 11 tys. x g) worteks statywy mrożeniowe (temp. <7 C) na probówki 1,5 2 ml lub kuwety umożliwiające trzymanie probówek w warunkach chłodniczych www.dnagdansk.com 4
Nr kat. EM09, EM11 Opcjonalnie nożyczki, skalpel probówki z kulkami ceramicznymi wolne od RNaz (nr kat. HPLM100) (lub w zestawie EXTRACTME TOTAL RNA PLUS, nr kat. EM11) homogenizator tkankowy na probówki 2 ml homogenizator nożowy termomikser o orbicie ruchu min. 2 mm moździerz z gładkim wylewem (50 75 ml) z dopasowanym pistonem ciekły azot worteks z przystawką na probówki 2 ml wirówka na falkony 10 15 ml (linie komórkowe) woda utleniona 3% lub roztwór podchlorynu sodu <0,5% IV. ZASADA IZOLACJI Zestaw EXTRACTME TOTAL RNA o p i e r a s i ę n a z d o l n o ś c i z ł ó ż k r z e m i o n ko w y c h do wiązania kwasów nukleinowych w obecności wysokich stężeń soli chaotropowych. Procedura oczyszczania RNA składa się z 6 etapów i jest przeprowadzana z wykorzystaniem minikolumn wirowniczych. Pierwszym e t a p e m j e s t h o m o g e n i z a c j a t k a n k i, m a j ą c a n a c e l u d e z i n t e g r a c j ę p o ł ą c z e ń międzykomórkowych (tkanki nabłonkowe) oraz fragmentację białek wysokocząsteczkowych (tkanka mięśniowa, łączna). Następnie homogenat poddawany jest lizie chemicznej z wykorzystaniem rodanku guanidyny oraz detergentów. Obecne w materiale tkankowym RNazy inaktywowane s ą p o p r z e z z a s t o s o w a n i e w y s o k i e g o s t ę ż e n i a r o d a n k u g u a n i d y n y o r a z 1% ß-merkaptoetanolu. Wirowanie oraz przepuszczenie supernatantu przez kolumnę homogenizacyjną umożliwia eliminację niezlizowanych fragmentów tkanki/komórek. Immobilizacja RNA na kolumnie wiążącej następuje dzięki dodatkowi etanolu. Trzyetapowe przemywanie RNA związanego do złoża minikolumny ma na celu usunięcie pozostałych zanieczyszczeń i/lub inhibitorów reakcji enzymatycznych. Oczyszczone RNA eluowane jest ze złoża buforem o niskiej sile jonowej (Elution Buffer) lub wodą wolną od RNaz (ph 7,0 9,0) i jest gotowe do bezpośredniego wykorzystania w technikach biologii molekularnej, takich jak RT PCR, RT qpcr i Northern blotting. 5
V. KONTROLA JAKOŚCI Każda partia produkcyjna (LOT) zestawu EXTRACTME TOTAL RNA testowana jest według opracowanych procedur. Wydajność oraz efektywność izolacji i oczyszczania RNA analizowane są metodami spektrofotometrycznymi oraz elektroforetycznymi. Dodatkowo funkcjonalna jakość oczyszczonego RNA sprawdzana jest w reakcji qpcr poprzedzonej reakcją odwrotnej transkrypcji. VI. SPECYFIKACJA PRODUKTU MATERIAŁ WYJŚCIOWY tkanka świeża lub mrożona (najlepiej w temp. -80⁰C): 1 30 mg, tkanka przechowywana w buforach inaktywujących RNazy: 1 30 mg linie komórkowe: 10 4 10 7 komórek WYDAJNOŚĆ IZOLACJI RNA Przykładowe wydajności izolacji RNA ze świeżego materiału biologicznego podane są w sekcji XIII. POJEMNOŚĆ ZŁOŻA ok. 90 µg RNA CZAS IZOLACJI 16 20 min (po etapie lizy lub w przypadku braku homogenizacji dla linii komórkowych) 30 60 min w przypadku homogenizacji w ciekłym azocie 30 40 min w przypadku homogenizacji mechanicznej (kulki ceramiczne) CZYSTOŚĆ RNA A 260 /A 280 = 1,9-2,1 www.dnagdansk.com 6
Nr kat. EM09, EM11 VII. ŚRODKI OSTROŻNOŚCI Tkanka jest biologicznym materiałem niebezpiecznym ze względu na potencjalną zawartość mikroorganizmów patogennych lub substancji zagrażających zdrowiu, bądź życiu człowieka. Przy pracy z materiałem tkankowym należy stosować się do wymogów dotyczących biologicznych materiałów niebezpiecznych. Zaleca się przeprowadzać całą procedurę izolacji w komorze II klasy bezpieczeństwa biologicznego lub przy palniku laboratoryjnym, używać ochronnej odzieży laboratoryjnej oraz rękawiczek jednorazowych. Zalecane jest używanie jałowych końcówek do pipet z filtrami wolnymi od RNaz. Odpady zawierające sole guanidyny mogą tworzyć wysoce reaktywne związki w połączeniu z substancjami utleniającymi. W przypadku rozlania buforu, powierzchnię zmyć wodą z detergentem. W przypadku rozlania cieczy zawierającej krew, zanieczyszczoną powierzchnię zmyć najpierw wodą z detergentem, a następnie 1% roztworem podchlorynu sodu. Należy unikać dotykania ścianek minikolumn pipetą, aby nie przenosić śladów RNA lub zanieczyszczeń pomiędzy kolejnymi minikolumnami. VIII. SZCZEGÓLNE ZALECENIA I UWAGI Ilość materiału wyjściowego Jeśli istnieje konieczność izolacji całkowitego RNA z większej ilości materiału (>30 mg, >10 7 komórek), należy tak zwiększyć ilość buforu RLys oraz rozdzielić na większą ilość minikolumn, aby nie przekroczyć maksymalnej wielkości 30 mg tkanki (lub 10 7 komórek) na minikolumnę. Przekroczenie tej wartości może spowodować zatkanie się kolumny homogenizacyjnej H lub/i uzyskanie zanieczyszczonego RNA. Pobieranie i przechowywanie prób do izolacji RNA Kluczowym elementem dobrej jakościowo i ilościowo izolacji RNA jest rygorystyczna procedura pobierania i przechowywania materiału biologicznego. M a t e r i a ł p o u z y s k a n i u ( p o b r a n i u ) n a l e ż y u t r w a l i ć p o p r z e z m r o ż e n i e (-80⁰C lub w ciekłym azocie) lub przechowywać w buforach chroniących RNA (np. RNAlater, Ambion) w temp. -20⁰C. W przypadku większości tkanek granicznym momentem jest 30 minuta od momentu pobrania, natomiast w przypadku tkanek bogatych w RNazy (trzustka, wątroba), tkankę należy natychmiast utrwalić. 7
Najlepsze efekty izolacji RNA z linii komórkowych uzyskuje się ze świeżych komórek. W przypadku późniejszej pracy, po odwirowaniu należy odrzucić pożywkę znad osadu komórek i mrozić w temp. -80⁰C lub w ciekłym azocie (LN 2 ). Eliminacja RNaz R N a z y s ą b a r d z o a k t y w n y m i e n z y m a m i, n i e w y m a g a j ą c y m i k o f a k t o r ó w do aktywacji oraz odpornymi na autoklawowanie w temp. 121⁰C przez 15 min. W celu wykluczenia możliwości degradacji RNA przez RNazy należy zastosować się do następujących zaleceń: a. Zawsze stosować jednorazowe rękawiczki lateksowe/winylowe/nitrylowe podczas pracy. Nie należy dotykać innych rzeczy niż bezpośrednio związanych z izolacją RNA. b. Próby na każdym etapie izolacji (w miarę możliwości również wirówka) powinny zachować temp. 2 8⁰C. Najlepiej korzystać ze statywów mrożeniowych, ze względu na kontaminację lodu RNazami. Wyizolowane RNA należy obowiązkowo niezwłocznie wstawić do statywu mrożeniowego. c. P l a s t i k i z u ż y w a l n e (t i p s y, p r o b ó w k i ) n a l e ż y s t o s o w a ć w o l n e o d R N a z, lub też autoklawować w temp. 134⁰C przez 18 20 min. d. Plastiki niezużywalne, szkło, porcelana: moczyć przez noc w roztworze 0,1 N NaOH/0,1% woda DEPC (lub woda wolna od RNaz), a następnie płukać wodą DEPC lub wodą wolną od RNaz. Szkło i porcelanę (moździerze) w miarę możliwości prażyć w temp. 150 240⁰C przez 2 4 h, następnie schłodzić do temp. pokojowej. e. Za pomocą 3% H 2 O 2 lub <0,5% podchlorynu sodu (lub komercyjnie dostępnych płynów inaktywujących RNazy) należy przetrzeć: blaty, pipety, wirówkę (rotor osobno), statywy do probówek. Przed traktowaniem płynami należy wykonać próbę, czy nie następuje reakcja z materiałami odkażanymi. Elucja RNA ze złoża Optymalną objętość buforu elucyjnego REB (RNA Elution Buffer) należy dobrać w zależności od ilości materiału użytego do izolacji oraz od wymaganego poziomu stężenia RNA w eluacie. Zaleca się stosowanie 30 50 μl REB przy izolacji z 2 10 mg tkanki lub <10 4 komórek oraz zwiększenie objętości buforu elucyjnego do 100 μl w przypadku izolacji z 10 30 mg tkanki lub 10 4 10 7 komórek. Jeśli pożądane jest otrzymanie RNA o wysokim stężeniu, objętość buforu elucyjnego można zmniejszyć nawet do 20 μl. Należy mieć jednak na uwadze, że obniży to wydajność odzysku RNA. Istotne w tym przypadku jest dodanie buforu elucyjnego centralnie na powierzchnię złoża. W przypadku pracy z większą ilością materiału (niezalecane ze względu na możliwość zatkania kolumn), możliwe jest odzyskanie całkowitego RNA z minikolumny poprzez przeprowadzenie dodatkowej elucji (100 μl). www.dnagdansk.com 8
Nr kat. EM09, EM11 W tym przypadku należy powtórzyć punkty 16 19 Protokołu izolacji, umieszczając minikolumnę w nowej probówce 1,5 ml typu Eendorf. Bufor elucyjny REB nie zawiera EDTA, którego obecność może przeszkadzać w niektórych reakcjach enzymatycznych. Zanieczyszczenie DNA Każdy materiał biologiczny podlegający izolacji RNA zawiera DNA. Żadna z obecnie stosowanych metod izolacji RNA nie gwarantuje usunięcia 100% DNA bez zastosowania metod enzymatycznych (DNaza) po izolacji RNA. Nawet śladowe zanieczyszczenie DNA (rzędu kilku kopii gdna na próbę) może spowodować uzyskanie fałszywie pozytywnych wyników w reakcji qpcr (po etapie odwrotnej transkrypcji). W celu wyeliminowania tego zagrożenia, proponujemy zastosowanie komercyjnie dostępnych metod enzymatycznego usuwania DNA po izolacji RNA (np. termolabilna dsdnaza, nr kat. EN32). W przypadku Eukaryota zalecamy projektowanie układów qpcr niewrażliwych na zanieczyszczenia DNA (startery obejmujące sąsiednie egzony lub z intronem >1,5 kpz). Pienienie buforu RLys Ze względu na zawartość detergentów niejonowych w buforze lizującym może dojść do pienienia, co jest zjawiskiem normalnym dla tego typu buforów podczas etapu homogenizacji, po worteksowaniu lub intensywnym pipetowaniu. W celu usunięcia piany, probówkę należy wirować 1 min przy 10 tys. rpm (11 tys. x g). IX. PRZED PRZYSTĄPIENIEM DO IZOLACJI 1. Każdy z odczynników zestawu należy dobrze wymieszać. Nie należy mieszać zbyt intensywnie RLys Buffer. 2. Należy upewnić się czy do RW1 Buffer został dodany etanol. Jeśli nie, należy dodać odpowiednią ilość 96 100% etanolu (ilości podane są na etykietach oraz w tabeli w sekcji II). 3. Bezpośrednio przed izolacją RNA do RLys Buffer n a l e ż y d o d a ć 100% ß-merkaptoetanolu do końcowego stężenia 1%. Tr w a ł o ś ć R L y s B u f f e r p o d o d a n i u ß - M E w y n o s i 4 t y g o d n i e w t e m p. 2 8 ⁰ C. Stąd też, w przypadku izolacji RNA prowadzonej partiami, należy przenieść odpowiednią do izolacji ilość RLys Buffer do osobnej butelki (wolnej od RNaz) i dodać ß-merkaptoetanol. 4. W przypadku wytrącenia osadu w buforach RLys lub RW1, butelkę z roztworem należy ogrzać do temp. 37 C (RW1 Buffer) lub temp. 50 C (RLys Buffer) i inkubować, aż do całkowitego rozpuszczenia osadu, mieszając co kilka minut, a następnie schłodzić do temp. pokojowej. 9
5. Przygotować statyw mrożeniowy, odpowiednie plastiki wolne od RNaz oraz pozostałe elementy stanowiska do pracy z RNA. 6. Wszystkie etapy wirowania zostały zoptymalizowane z wykorzystaniem mikrowirówki Eendorf 5417C. Prędkości wirowania podane w jednostkach rpm odnoszą się do tej mikrowirówki. X. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI A. TKANKA STAŁA ŚWIEŻA LUB MROŻONA Ilość: 1 30 mg Materiał: tkanki zwierzęce, tkanki ludzkie Procedura ogólna niezależna od stosowanej metody homogenizacji Tkankę podzielić za pomocą pęsety i nożyczek lub skalpela na jak najmniejsze fragmenty. W zależności od stopnia fragmentacji oraz rodzaju tkanki, przejść do wyboru metod homogenizacji (poniżej) lub przejść do pkt. 1 Protokołu izolacji (sekcja XI). Ciekły azot (LN 2 ) 1. Zamrożoną w LN 2 tkankę umieścić w jałowym, uprzednio schłodzonym moździerzu i za pomocą schłodzonego pistonu delikatnie lecz zdecydowanie rozbić na małe fragmenty, następnie rozetrzeć. 2. Otrzymany proszek przenieść do probówki (2 ml) zawierającej 600 μl RLys Buffer i przejść do pkt. 2 Protokołu izolacji (sekcja XI). Jeśli po roztarciu powstaje cienka kleista warstwa zamiast proszku, zhomogenizowaną tkankę zawiesić dodając do moździerza 600 μl RLys Buffer i poprzez staranne pipetowanie zebrać całość i przenieść do probówki (2 ml), nie zapominając o starannym przemyciu pistonu z resztek tkanki. Homogenizacja z użyciem homogenizatora nożowego 1. Umieścić tkankę w probówce (2 ml), dodać 100 μl RLys Buffer, homogenizować ostrożnie sterylną końcówką homogenizatora. 2. P o u z y s k a n i u h o m o g e n a t u, o p ł u k a ć k o ń c ó w k ę n o ż o w ą z a p o m o c ą 500 μl RLys Buffer, a następnie przenieść całość do nowej probówki (2 ml). 3. Przejść do pkt. 2 Protokołu izolacji (sekcja XI). www.dnagdansk.com 10
Nr kat. EM09, EM11 Homogenizacja z wykorzystaniem kulek ceramicznych (polecamy zestaw EXTRACTME TOTAL RNA PLUS, nr kat. EM11, w skład którego wchodzą dodatkowo probówki z kulkami - Bead Beating Tubes) 1. Do probówki zawierającej kulki ceramiczne dodać 200 μl RLys Buffer i przenieść pociętą tkankę. 2. Następnie umieścić w homogenizatorze tkankowym i rozdrabniać przez 30 s przy 5 6 tys. rpm. Procedurę powtórzyć w razie konieczności. W przypadku braku możliwości oceny stopnia rozdrobnienia tkanki spowodowanej pienieniem buforu, probówkę zwirować przez 2 min przy 10 tys. rpm (11 tys. x g). W przypadku braku homogenizatora próbkę można rozdrobnić korzystając z odpowiedniej przystawki do worteksu; minimum 5 min przy maksymalnych obrotach. 3. Dodać 400 μl RLys Buffer i wymieszać przez pipetowanie. 4. Przejść do pkt. 2 Protokołu izolacji (sekcja XI). B. LINIE KOMÓRKOWE Ilość: 10 4 10 7 komórek Materiał: świeże lub mrożone (-80 C lub -196 C) linie komórek adherentnych lub zawiesinowych. 1. Zamrożone komórki rozmrozić w temp. 37 C lub RT. Komórki w pożywce lub PBS zwirować w falkonie (15 ml) lub probówce (2 ml) przez 5 min przy 5 tys. rpm (ok. 3 tys. x g). Odrzucić supernatant. W przypadku, gdy nie tworzy się zwarty osad komórkowy należy komórki dwukrotnie przemyć przy pomocy 1 ml zimnego PBS. 2. Dodać 600 μl RLys Buffer. Wymieszać przez intensywne worteksowanie 30 s, a następnie pipetowanie. Dla części komórek, szczególnie tworzących syncytia (mioblasty) i połączenia zwarte (kom. nabłonkowe) oraz komórek w dużej ilości (~10 7 ) mogą wystąpić trudności z rozpuszczeniem osadu w RLys Buffer. Należy wtedy rozpipetować ostrożnie osad z wykorzystaniem pipety z końcówką 1000 ml lub jałową strzykawką. Nie stosować w tym celu końcówek z filtrem do pipet. 3. Całość przenieść do nowej probówki (2 ml). 4. Przejść do pkt. 2 Protokołu izolacji (sekcja XI). 11
XI. PROTOKÓŁ IZOLACJI 1. Rozdrobniony materiał biologiczny umieścić w probówce (2 ml). Dodać 600 μl RLys Buffer. Worteksować przez 60 s. W przypadku pienienia roztworu należy go zwirować przez 1-2 min przy 10 tys. rpm (11 tys. x g). Patrz sekcja VIII. Szczególne zalecenia i uwagi.wirować 2 min przy 12-14 tys. rpm (15-21 tys. x g). 2. Supernatant ( 600 μl) przenieść do minikolumny homogenizacyjnej H umieszczonej w probówce odbierającej (2 ml) i wirować 2 min przy 12-14 tys. rpm (15-21 tys. x g). Zachować przesącz. W przypadku homogenizacji z wykorzystaniem kulek ceramicznych należy ostrożnie pobrać odpowiednią ilość supernatantu wprowadzając końcówkę pipety o poj. 200 μl pomiędzy kulki (uwaga: końcówki 1 ml mogą ulec zatkaniu kulkami) i delikatnie pobrać supernatant. Resztki tkanki powinny być widoczne na jednej ze ścianek lub na dnie probówki. W przypadku pozostania niezwirowanego płynu w górnej części minikolumny, należy powtórzyć wirowanie przez 2 min przy prędkości 14 tys. rpm ( 21 tys. x g). Jeśli to nie pomaga, prawdopodobnie materiał nie uległ poprawnej homogenizacji lub trawienie było zbyt krótkie lub wyjściowego materiału tkankowego było zbyt dużo. 3. Do przesączu dodać 600 μl 96-100% etanolu. Wymieszać przez pipetowanie lub worteksowanie 5 s. 4. Przenieść do minikolumny wiążącej B umieszczonej w probówce odbierającej (2 ml). 5. Wirować 1 min przy 12 tys. rpm (15 tys. x g). 6. Przenieść minikolumnę do nowej probówki odbierającej. 7. Do minikolumny dodać 650 μl RW1 Buffer i wirować 1 min przy 10-12 tys. rpm (11-15 tys. x g). 8. Wylać przesącz z probówki odbierającej i umieścić w niej z powrotem minikolumnę. www.dnagdansk.com 12
Nr kat. EM09, EM11 9. Do minikolumny dodać 650 μl RW2 Buffer i w i r ow a ć 3 0 s przy 10-12 tys. rpm (11-15 tys. x g). 10. Wylać przesącz z probówki odbierającej i umieścić w niej z powrotem minikolumnę. 11. Do minikolumny dodać 500 μl RW2 Buffer i wirować 30 s przy 10-12 tys. rpm (11-15 tys. x g). 12. Wylać przesącz z probówki odbierającej i umieścić w niej z powrotem minikolumnę. 13. Wirować 1-2 min przy 12 14 tys. rpm (15 21 tys. x g). Bufor płuczący zawiera alkohol, który może powodować inhibicję niektórych reakcji enzymatycznych, a także obniżenie wydajności elucji, dlatego istotne jest jego całkowite usunięcie przed etapem elucji. 14. Ostrożnie wyjąć suchą minikolumnę z probówki odbierającej i umieścić ją w jałowej probówce 1,5 ml typu Eendorf. 15. Nanieść 50-100 μl buforu elucyjnego REB centralnie na złoże w minikolumnie. Możliwa jest zmiana objętości buforu elucyjnego w zakresie 20-200 µl. Więcej wskazówek na temat elucji znajduje się w sekcji VIII. Szczególne zalecenia i uwagi. 16. Inkubować minikolumnę z buforem przez 2 min. 17. Wirować 2 min przy 8-10 tys. rpm (7-11 tys. x g). 18. Minikolumnę usunąć, a wyizolowane RNA umieścić w s t a t y w i e m r oże ni ow y m. W y i zo l ow a n e R N A p r ze ch ow y w a ć w temp. -80 C lub -20 C do czasu dalszych analiz. 13
XII. MOŻLIWE PROBLEMY I ICH ROZWIĄZYWANIE Problem Prawdopodobna przyczyna Rozwiązanie Niska wydajność izolacji RNA. Niskie stężenie RNA. Zatkana minikolumna H lub B. Tkanka źle przechowywana lub utrwalona degradacja RNA. Zbyt mała ilość materiału wyjściowego. Tkanka nieprawidłowo rozdrobniona. Zatkana minikolumna. Obecność RNaz. Zbyt duża objętość buforu elucyjnego. Materiał niewystarczająco rozdrobniony. Przeniesienie osadu komórkowego na kolumnę H. Przeładowanie minikolumny H lub B. Przechowywać tkankę w -80 C nie dłużej niż rok. W przypadku stosowania buforu utrwalającego do przechowywania tkanek, upewnić się, że jest on dobrej jakości, a warunki przechowywania odpowiednie. Zwiększyć ilość materiału wyjściowego. Upewnić się, że tkanka została odpowiednio zhomogenizowana w RLys Buffer. Tkankę należy uprzednio pokroić na jak najmniejsze fragmenty, a następnie dobrać odpowiednią metodę homogenizacji. Patrz Zatkana minikolumna H lub B. Patrz sekcja VIII. Szczególne zalecenia i uwagi, Eliminacja RNaz. Zmniejszyć objętość buforu elucyjnego REB do 20-50 μl. Dobrać odpowiednie warunki homogenizacji. Ostrożnie przenieść supernatant bez naruszania resztek komórek (osadu). Nie przekraczać zalecanej ilości materiału wyjściowego. Zdegradowane RNA. Tkanka zbyt stara. Używać tkanek świeżych lub odpowiednio utrwalonych. Kontaminacja DNA. Tkanka kilkukrotnie rozmrażana. RNA fizycznie zdegradowane/ zbyt gwałtowna homogenizacja. Obecność RNaz. Zbyt duża ilość materiału wyjściowego. Niewłaściwa homogenizacja. Unikać cykli zamrażanie-rozmrażanie. Dobrać odpowiednie warunki homogenizacji. Patrz sekcja VIII. Szczególne zalecenia i uwagi, Eliminacja RNaz. Zmniejszyć ilość materiału wyjściowego. Opcjonalne trawienie DNazą po izolacji RNA. Dobrać odpowiednie warunki homogenizacji. Opcjonalne trawienie DNazą po izolacji RNA. www.dnagdansk.com 14
Nr kat. EM09, EM11 XIII. PRZYKŁADOWE WYDAJNOŚCI IZOLACJI RNA ZE ŚWIEŻEGO MATERIAŁU BIOLOGICZNEGO MATERIAŁ Masa/ilość V elucji Stężenie RNA A 260 /A 280 Ilość RNA Linie komórkowe HCT116 10 7 100 μl 947,2 ng/μl 2,09 94,72 μg Linie komórkowe HCT116 10 4 100 μl 328,3 ng/μl 2,03 32,83 μg Nerka 30 mg 100 μl 923,6 ng/μl 2,07 92,36 μg Nerka 10 mg 100 μl 319,3 ng/μl 1,88 31,93 μg Rak nerki 30 mg 100 μl 534,6 ng/μl 2,04 53,46 μg Rak nerki 15 mg 100 μl 467,9 ng/μl 1,91 46,79 μg Jelito grube 10 mg 100 μl 168,8 ng/μl 2,14 16,88 μg Rak jelita grubego 30 mg 100 μl 603,7 ng/μl 2,06 60,37 μg
XIV. BEZPIECZEŃSTWO I POSTĘPOWANIE Z PRODUKTEM RLys BUFFER Niebezpieczeństwo H302, H312, H315, H319, P273, P280, P305+P351+P338, P302+P352 RW1 BUFFER Niebezpieczeństwo H302, H312, H332, P273, P302+P352 RW2 BUFFER Niebezpieczeństwo H225, H319, H336, P210, P233, P305+P338 H225 Wysoce łatwopalna ciecz i pary. H302 Działa szkodliwie po połknięciu. H315 Działa drażniąco na skórę. H319 Działa drażniąco na oczy. H336 Może wywoływać uczucie senności lub zawroty głowy. P210 Przechowywać z dala od źródeł ciepła/ iskrzenia/ otwartego ognia/ gorących powierzchni. Palenie wzbronione. P233 Przechowywać pojemnik szczelnie zamknięty. P273 Unikać uwolnienia do środowiska. P280 Stosować rękawice ochronne/ odzież ochronną/ ochronę oczu /ochronę twarzy. P305 + P351 + P338 W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: Ostrożnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeżeli są i można je łatwo usunąć. Nadal płukać. P302 + P352 W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ NA SKÓRĘ: Umyć dużą ilością wody z mydłem. www.dnagdansk.com