(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/US97/12244

RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 189309 (21) Numer zgłoszenia 331240 (13) B1 (22) Data zgłoszenia. 09.07.1997 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 09.07.1997, PCT/US97/12244 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego 15.01.1998, WO98/01555, PCT Gazette nr 02/98 (51) IntCl7 C12N 15/12 C12N 1/21 C07K 14/715 A61K 38/17 A61K 47/48 A61P 37/00 (54)Obcięty rozpuszczalny receptor czynnika martwicy nowotworu (stnfr), wielowartościowa proteina wiążąca czynnik martwicy nowotworu (TNFbp), polinukleotyd posiadający sekwencję kodującą stnfr, wektor oraz komórka gospodarza zawierające taki polinukleotyd, sposób wytwarzania stnfr, kompozycja farmaceutyczna, sposób jej wytwarzania oraz zastosowanie stnfr do wytwarzania środka leczniczego (30) Pierwszeństwo: 09.07.1996,US,60/021,443 06.12.1996,US,60/032,534 23.01.1997,US,60/037,737 07.02.1997,US,60/039,314 04.03.1997,US,60/039,792 (43) Zgłoszenie ogłoszono: 05.07.1999 BUP 14/99 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 29.07.2005 WUP 07/05 (73)Uprawniony z patentu: AMGEN INC, Thousand Oaks, US (72) Twórcy wynalazku: Eric F Fisher, New Braunfels, US Carl K III Edwards, Superior, US Gary L Kieft, Boulder, US (74) Pełnomocnik: Ewa Malewska, Malewska Ewa & Partnerzy PL 189309 B1 (57) 1. Obcięty rozpuszczalny receptor czynnika martwicy nowotworu (obcięty stnfr) obejmujący strukturę określoną następującym wzorem R1-[Cys19-Cys103]-R 2, w którym [Cys19-Cys103] oznacza reszty od 19 do 103 w obciętym stnfr typu-i (którego schemat numeracji reszt aminokwasowych odpowiada kolejności reszt aminokwasowych na rysunku fig 1 - SEQ ID NO 2, dla ułatwienia porównania), R1 oznacza grapę o wzorze NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC, zaś R2 oznacza grupę o wzorze -FN-COOH oraz jego warianty i pochodne 2 Obcięty stnfr według zastrz 1, znam ienny tym, że jest wybrany z grupy obejmującej stnfr 2 6D/C105 NH2- MDSVCPQGKYIHPQNNSlC-[Cys19-Cys103]-FC-COOH, stnfr 2 6D/C106 NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]- FNCSL-COOH, stnfr-i 2 6D/N105 NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FN-COOH, stnfr-i 2 3D/d8 NH2- MYlHPQNNSIC-[Cys19-C ys103]-fncsl-cooh, stnfr-i 2 3D /dl5 NH2-M SIS-[C ys19-cys103]-fncsl-cooh oraz stnfr-i 2 3D /d18nh2-m -[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH 31 Kompozycja farm aceutyczna zawierająca substancję aktywną oraz nośnik i/lub substancje pomocnicze, znam ienna tym, że jako substancję aktywną zawiera a) wielowartościową proteinę wiążącą czynnik martwicy nowotworu (TNFbp), obejm ującą co najmniej jeden obcięty stnfr obejmujący strukturę określoną następującym wzorem R 1-[Cys19-Cys103]-R2, w którym [Cys19-Cys103] oznacza reszty od 19 do 103 w obciętym stnfr typu-i (którego schemat numeracji reszt aminokwasowych odpowiada kolejności reszt aminokwasowych na rysunku fig 1 - SEQ ID NO 2, dla ułatwienia porownania), R 1oznacza grupę o wzorze NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC, zaś R2 oznacza grupę o wzorze -FN-COOH lub jego warianty i pochodne, a w szczególności obejm ującą obcięty stnfr wybrany z grupy, do której należą stnfr 2 6D/C105 NH2- -MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FC-COOH, stnfr 2 6D /C 106 NH2-M DSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]- -FNCSL-COOH, stnfr-i 2 6D/N105 N H 2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-C ys103-fn-cooh, stnfr-i 2 3D/d8 NH2- -MYIHPQNNSIC-[Cys19-C ys103]-fncsl-cooh, stnfr-i 2 3D /d15 NH2-M SIS-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH oraz stnfr-i 2 3D/d18 NH2-M -[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH,

2 189 309 Obcięty rozpuszczalny receptor czynnika martwicy nowotworu (stnfr), wielowartościowa proteina wiążąca czynnik martwicy nowotworu (TNFbp), polinukleotyd posiadający sekwencję kodującą stnfr, wektor oraz komórka gospodarza zawierające taki polinukleotyd, sposób wytwarzania stnfr, kompozycja farmaceutyczna, sposób jej wytwarzania oraz zastosowanie stnfr do wytwarzania środka leczniczego Zastrzeżenia patentowe 1. Obcięty rozpuszczalny receptor czynnika martwicy nowotworu (obcięty stnfr) obejmujący strukturę określoną następującym wzorem: R1-[Cys19-Cys103]-R2, w którym [Cys19-Cys103] oznacza reszty od 19 do 103 w obciętym stnfr typu-i (którego schemat numeracji reszt aminokwasowych odpowiada kolejności reszt aminokwasowych na rysunku fig. 1 - SEQ ID NO:2, dla ułatwienia porównania), R1 oznacza grupę o wzorze NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC, zaś R2 oznacza grupę o wzorze -FN-COOH oraz jego warianty i pochodne. 2. Obcięty stnfr według zastrz. 1, znamienny tym, że jest wybrany z grupy obejmującej: stnfr 2.6D/C105 NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FC-COOH, stnfr 2.6D/C106 NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH, stnfr-i 2.6D/N105 NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FN-COOH, stnfr-i 2.3D/d8 NH2-MYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH, stnfr-i 2.3D/d15 NH2- -MSIS-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH oraz stnfr-i 2.3D/d18NH2-M-[Cys19-Cys103]- FNCSL-COOH. 3. Obcięty stnfr według zastrz. 1, znamienny tym, że na końcu karboksylowym jest sprzężony z częścią lub całością stałej domeny ciężkiego lub lekkiego łańcucha ludzkiej immunoglobuliny. 4. Obcięty stnfr według zastrz. 1, znamienny tym, że wskazana sekwencja aminokwasów obciętego stnfr jest nieglikozylowana. 5. Obcięty stnfr według zastrz. 1, znamienny tym, że wskazana sekwencja aminokwasów obciętego stnfr jest glikozylowana. 6. Obcięty stnfr według zastrz. 1, znamienny tym, że obcięty stnfr jest sprzężony z rozpuszczalnym w wodzie polimerem. 7. Obcięty stnfr według zastrz. 6, znamienny tym, że rozpuszczalnym w wodzie polimerem jest glikol polietylenowy 8. Wielowartościowa proteina wiążąca czynnik martwicy nowotworu (TNFbp), znamienna tym, że obejmuje co najmniej jeden obcięty stnfr obejmujący strukturę określoną następującym wzorem: R1-[Cys19-Cys103]-R2, w którym [Cys19-Cys103] oznacza reszty od 19 do 103 w obciętym stnfr typu-i (którego schemat numeracji reszt aminokwasowych odpowiada kolejności reszt aminokwasowych na rysunku fig. 1 - SEQ ID NO:2, dla ułatwienia porównania), R1 oznacza grupę o wzorze NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC, zaś R2 oznacza grupę o wzorze -FN-COOH lub jego warianty i pochodne. 9. TNFbp według zastrz. 8, znamienna tym, ze obejmuje obcięty stnfr wybrany z grupy, do której należą: stnfr 2.6D/C105 NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19 -Cys103]-FC-COOH, stnfr 2.6D/C106 NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-

189 309 3 -FNCSL-COOH, stnfr-i 2.6D/N105 NH2-MDSVCPQGKYMPQNNSIC-[Cys19-Cys103]- FN -CO O H, stnfr-i 2.3D/C8 NH2- M Y IH P Q N N SIC -[C ys19-c y s103]-fn C SL-C O O H, stnfr-i 2.3D/d15 NH2-MSIS-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH oraz stnfr-i 2.3D/d18 NH2- -M-[Cys19-Cys103]- FNCSL-COOH. 10. TNFbp według zastrz. 8, znamienna tym, że obcięty stnfr jest na końcu karboksylowym sprzężony z częścią lub całością stałej domeny ciężkiego lub lekkiego łańcucha ludzkiej immunoglobuliny. 11. TNFbp według zastrz. 8, znamienna tym, ze wskazana sekwencja aminokwasów obciętego stnfr jest glikozylowana lub nieglikozylowana. 12. TNFbp według zastrz. 8, znamienna tym, ze obcięty stnfr jest sprzężony z rozpuszczalnym w wodzie polimerem, korzystnie z glikolem polietylenowym. 13. TNFbp według zastrz. 8, znamienna tym, że ma budowę określoną wzorem ogólnym Ra-X- Rb, w którym: X zawiera linker, gdzie ów linker jest rozpuszczalnym w wodzie polimerem, zaś Ra i Rb są biologicznie aktywnymi cząsteczkami kowalentnie związanymi ze wskazanym rozpuszczalnym w wodzie polimerem, przy czym co najmniej jeden z podstawników Ra i Rb jest obciętym stnfr według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5. 14. TNFbp według zastrz. 13, znamienna tym, że rozpuszczalnym w wodzie polimerem jest glikol polietylenowy. 15. TNFbp według zastrz. 14, znamienna tym, że obcięty stnfr ma budowę określoną wzorem ogólnym Ra-X-Rb, w którym: X zawiera linker, gdzie ów linker jest PEG-20.000-bis-winylo sulfonem, zaś Ra i Rb - każdy oznacza NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FC-COOH (określany także jako stnfr-i 2.6D/C105) albo wzorem ogólnym Ra-X-Rb, w którym: X zawiera linker, gdzie ów linker jest PEG-20.000-bis-winylo sulfonem, zaś Ra i Rb - każdy oznacza NH2-MDSVCPQGKYMPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL- -COOH (określany także jako stnfr-i 2.6D/C106). 16. Polinukleotyd posiadający sekwencję kodującą obcięty stnfr obejmujący strukturę określoną następujący m wzorem: R1-[Cys19-Cys103]-R2, w którym [Cys19-Cys103] oznacza reszty od 19 do 103 w obciętym stnfr typu-i (którego schemat numeracji reszt aminokwasowych odpowiada kolejności reszt aminokwasowych na rysunku fig. 1 - SEQ ID NO:2, dla ułatwienia porównania), R1 oznacza grupę o wzorze NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC, zaś R2 oznacza grupę o wzorze -FN-COOH lub jego warianty i pochodne, bądź sekwencję do niej komplementarną. 17. Polinukleotyd według zastrz. 16, znamienny tym, że posiada sekwencję kodującą obcięty stnfr wybrany z grupy obejmującej: stnfr 2.6D/C105 NH2- -MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FC-COOH, stnfr 2.6D/C106 NH2- -MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys10 3]-FNCSL-COOH, stnfr-i 2.6D/N105 NH2- -MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103] -FN-COOH, stnfr-i 2.3D/d8 NH2- -MYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH, stnfr-i 2.3D/d15 NH2-MSIS-[Cys19- Cys103]-FNCSL-COOH oraz stnfr-i 2.3DM18 NH2-M-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH, bądź sekwencję do niej komplementarną. 18. Polinukleotyd według zastrz. 16, znamienny tym, że posiada sekwencję kodującą obcięty stnfr sprzężony na końcu karboksylowym z częścią lub całością stałej domeny

4 189 309 ciężkiego lub lekkiego łańcucha ludzkiej immunoglobuliny, bądź sekwencję do niej komplementarną. 19. Polinukleotyd według zastrz. 16, znamienny tym, że ma sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy obejmującej sekwencje przedstawione na rysunku fig. 2, 3, 4, 5, 6 i 7, a także tę sekwencję o zdegenerowanych obszarach kodujących. 20. Wektor zawierający polinukleotyd posiadający sekwencję kodującą obcięty stnfr obejmujący strukturę określoną następującym wzorem: R1-[Cys19-Cys103]-R2, w którym [Cys19-Cys103] oznacza reszty od 19 do 103 w obciętym stnfr typu-i (którego schemat numeracji reszt aminokwasowych odpowiada kolejności reszt aminokwasowych na rysunku fig. 1 - SEQ ID NO:2, dla ułatwienia porównania), R1 oznacza grupę o wzorze NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC, zaś R2 oznacza grupę o wzorze -FN-COOH lub jego warianty i pochodne, bądź sekwencję do niej komplementarną, operacyjnie przyłączony do sekwencji kontrolującej ekspresję. 21. Wektor według zastrz. 20, znamienny tym, że zawiera polinukleotyd posiadający sekwencję kodującą obcięty stnfr wybrany z grupy obejmującej: stnfr 2.6D/C105 NH2- -MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FC-COOH, stnfr 2.6D/C106 NH2- -MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH, stnfr-i 2.6D/N105 NH2- -MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FN-COOH, stnfr-i 2.3D/d8 NH2 -MYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys10 3]-FNCSL-COOH, stnfr-i 2.3D/d15 NH2-MSIS-[Cys19- Cys10 3]-FNCSL-COOH oraz stnfr-i 2.3D/d18 NH2-M-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH, bądź sekwencję do niej komplementarną, operacyjnie przyłączony do sekwencji kontrolującej ekspresję. 22. Wektor według zastrz. 20 albo 21, znamienny tym, że zawiera polinukleotyd posiadający sekwencję kodującą obcięty stnfr sprzężony na końcu karboksylowym z częścią lub całością stałej domeny ciężkiego lub lekkiego łańcucha ludzkiej immunoglobuliny, bądź sekwencję do niej komplementarną, operacyjnie przyłączony do sekwencji kontrolującej ekspresję. 23. Wektor według zastrz. 20, znamienny tym, ze zawiera polinukleotyd posiadający sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy obejmującej sekwencje przedstawione na rysunku fig. 2, 3, 4, 5, 6 i 7, a także tę sekwencję o zdegenerowanych obszarach kodujących, operacyjnie przyłączony do sekwencji kontrolującej ekspresję. 24. Prokariotyczna lub eukariotyczna komórka gospodarza zawierająca polinukleotyd posiadający sekwencję kodującą obcięty stnfr obejmujący strukturę określoną następującym wzorem: R1-[Cys19-Cys103]-R2, w którym [Cys19-Cys103] oznacza reszty od 19 do 103 w obciętym stnfr typu-i (którego schemat numeracji reszt aminokwasowych odpowiada kolejności reszt aminokwasowych na rysunku fig. 1 - SEQ ID NO:2, dla ułatwienia porównania), R1 oznacza grupę o wzorze NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC, zaś R2 oznacza grupę o wzorze -FN-COOH lub jego warianty i pochodne, bądź sekwencję do niej komplementarną, korzystnie mający sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy obejmującej sekwencje przedstawione na rysunku fig. 2, 3, 4, 5, 6 i 7, a także tę sekwencję o zdegenerowanych obszarach kodujących. 25. Sposób wytwarzania obciętego stnfr, znamienny tym, że obejmuje a) prowadzenie hodowli komórki gospodarza zawierającej polinukleotyd posiadający sekwencję kodującą obcięty stnfr obejmujący strukturę określoną następującym wzorem: R1-[Cys19-Cys103]-R2, w którym

189 309 5 [Cys19-Cys103] oznacza reszty od 19 do 103 w obciętym stnfr typu-i (którego schemat numeracji reszt aminokwasowych odpowiada kolejności reszt aminokwasowych na rysunku fig. 1 - SEQ ID NO:2, dla ułatwienia porównania), R1 oznacza grupę o wzorze N H 2-M D SV C PQ G K Y IH P Q N N SIC, zaś R2 oznacza grupę o wzorze -FN -CO O H lub jego warianty i pochodne, bądź sekwencję do niej komplementarną, korzystnie mający sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy obejmującej sekwencje przedstawione na rysunku fig. 2, 3, 4, 5, 6 i 7, a także tę sekwencję o zdegenerowa nych obszarach kodujących, b) utrzymywanie komórek gospodarza w warunkach pozwalających na ekspresję obciętego stnfr przez te komórki gospodarza. 26. Sposób wytwarzania obciętego stnfr, znamienny tym, że obejmuje a) prowadzenie hodowli komórki gospodarza zawierającej polinukleotyd posiadający sekwencję kodującą obcięty stnfr obejmujący strukturę określoną następującym wzorem: R1-[Cys19-Cys103]-R2, w którym [Cys19-Cys103] oznacza reszty od 19 do 103 w obciętym stnfr typu-i (którego schemat numeracji reszt aminokwasowych odpowiada kolejności reszt aminokwasowych na rysunku fig. 1 - SEQ ID NO.2, dla ułatwienia porównania), R1 oznacza grupę o wzorze NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC, zaś R2 oznacza grupę o wzorze -FN-COOH lub jego warianty i pochodne, bądź sekwencję do niej komplementarną, korzystnie mający sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy obejmującej sekwencje przedstawione na rysunku fig. 2, 3, 4, 5, 6 i 7, a także tę sekwencję o zdegenerowa nych obszarach kodujących, b) utrzymywanie komórek gospodarza w warunkach pozwalających na ekspresję obciętego stnfr przez te komórki gospodarza oraz c) wyodrębnienie wytworzonego obciętego stnfr. 27. Sposób według zastrz. 25 albo 26, znamienny tym, ze jako komórki gospodarza stosuje się komórki E coli. 28. Obcięty stnfr będący rekombinacyjnym produktem ekspresji prokariotycznej lub eukariotycznej komórki gospodarza zawierającej polinukleotyd posiadający sekwencję kodującą obcięty stnfr obejmujący strukturę określoną następującym wzorem: R1-[Cys19-Cys103]-R2, w którym [Cys19-Cys103] oznacza reszty od 19 do 103 w obciętym stnfr typu-i (którego schemat numeracji reszt aminokwasowych odpowiada kolejności reszt aminokwasowych na rysunku fig. 1 - SEQ ID NO:2, dla ułatwienia porównania), R1 oznacza grupę o wzorze N H 2-M D SV C PQ G K Y IH P Q N N SIC, zaś R 2 oznacza grupę o wzorze -FN -CO O H lub jego warianty i pochodne, bądź sekwencję do niej komplementarną, korzystnie mający sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy obejmującej sekwencje przedstawione na rysunku fig. 2, 3, 4, 5, 6 i 7, a także tę sekwencję o zdegenerowanych obszarach kodujących, 29. Sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej zawierającej substancję aktywną oraz nośnik i/lub substancje pomocnicze, znamienny tym, ż e jako substancję aktywną stosuje się a) obcięty stnfr obejmujący strukturę określoną następującym wzorem: R1-[Cys19-Cys103]-R2, w którym [Cys19-Cys103] oznacza reszty od 19 do 103 w obciętym stnfr typu-i (którego schemat numeracji reszt aminokwasowych odpowiada kolejności reszt aminokwasowych na rysunku fig. 1 - SEQ ID NO:2, dla ułatwienia porównania), R1 oznacza grupę o wzorze NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC, zaś R2 oznacza grupę o wzorze -FN-COOH

6 189 309 Iub jego warianty i pochodne, albo b) obcięty stnfr będący rekombinacyjnym produktem ekspresji prokariotycznej lub eukariotycznej komórki gospodarza zawierającej polinukleotyd posiadający sekwencję kodującą obcięty stnfr obejmujący strukturę określoną następującym wzorem: R1[Cys19-Cys103]-R2, w którym [Cys19-Cys103] oznacza reszty od 19 do 103 w obciętym stnfr typu-i (którego schemat numeracji reszt aminokwasowych odpowiada kolejności reszt aminokwasowych na rysunku fig. 1 - SEQ ID NO:2, dla ułatwienia porównania), R1 oznacza grupę o wzorze NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC, zaś R2 oznacza grupę o wzorze -FN-COOH lub jego warianty i pochodne, bądź sekwencję do niej komplementarną, korzystnie mający sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy obejmującej sekwencje przedstawione na rysunku fig. 2, 3, 4, 5, 6 i 7, a także tę sekwencję o zdegenerowanych obszarach kodujących, bądź c) wielowartościową proteinę wiążącą czynnik martwicy nowotworu (TNFbp), obejmującą co najmniej jeden obcięty stnfr obejmujący strukturę określoną następującym wzorem: R1-[Cys19-Cys103]-R2, w którym [Cys19-Cys103] oznacza reszty od 19 do 103 w obciętym stnfr typu-i (którego schemat numeracji reszt aminokwasowych odpowiada kolejności reszt aminokwasowych na rysunku fig. 1 - SEQ ID NO:2, dla ułatwienia porównania), R1 oznacza grupę o wzorze NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC, zaś R2 oznacza, grupę o wzorze -FN-COOH lub jego warianty i pochodne, a w szczególności obejmującą obcięty stnfr wybrany z grupy, do której należą: stnfr 2.6D/C105 NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys1 9-Cys103]-FC-COOH, stnfr 2.6D/C106 NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH, stnfr-i 2.6D/N105 NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FN-COOH, stnfr-i 2.3D/d8 NH2-MYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH, stnfr-i 2.3D/d15 NH2-MSIS-[Cys19- -Cys103]-FNCSL-COOH oraz stnfr-i 2.3D/d18 NH2-M-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH, gdzie obcięty stnfr jest na końcu karboksylowym ewentualnie sprzężony z częścią lub całością stałej domeny ciężkiego lub lekkiego łańcucha ludzkiej immunoglobuliny, przy czym w proteinie TNFbp, wskazana wyżej sekwencja aminokwasów obciętego stnfr jest glikozylowana lub nieglikozylowana, i/lub wskazany obcięty stnfr jest sprzężony z rozpuszczalnym w wodzie polimerem, korzystnie z glikolem polietylenowym, albo d) wielowartościową proteinę wiążącą czynnik martwicy nowotworu (TNFbp) mającą budowę określoną wzorem ogólnym Ra-X-Rb, w którym: X zawiera linker, gdzie ów linker jest rozpuszczalnym w wodzie polimerem, zaś Ra i Rb są biologicznie aktywnymi cząsteczkami kowalentnie związanymi ze wskazanym rozpuszczalnym w wodzie polimerem, przy czym co najmniej jeden z podstawników Ra i Rb jest obciętym stnfr według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, gdzie korzystnie rozpuszczalnym w wodzie polimerem jest glikol polietylenowy, oraz terapeutycznie skuteczną ilość wskazanej substancji aktywnej miesza się farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem i/lub substancjami pomocniczymi. 30. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję aktywną oraz nośnik i/lub substancje pomocnicze, znamienna tym, ze jako substancję aktywną zawiera a) obcięty stnfr obejmujący strukturę określoną następującym wzorem: R1-[Cys19-Cys103]-R2, w którym [Cys19-Cys103] oznacza reszty od 19 do 103 w obciętym stnfr typu-i (którego schemat numeracji reszt aminokwasowych odpowiada kolejności reszt aminokwasowych na rysunku fig. 1 - SEQ ID NO:2, dla ułatwienia porównania),

189 309 7 R1 oznacza grupę o wzorze NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC, zaś R2 oznacza grupę o wzorze -FN-COOH lub jego warianty i pochodne, albo b) obcięty stnfr będący rekombinacyjnym produktem ekspresji prokariotycznej lub eukariotycznej komórki gospodarza zawierającej polinukleotyd posiadający sekwencję kodującą obcięty stnfr obejmujący strukturę określoną następującym wzorem: R1-[Cys19-Cys103]-R2, w którym [Cys19-Cys103] oznacza reszty od 19 do 103 w obciętym stnfr typu-i (którego schemat numeracji reszt aminokwasowych odpowiada kolejności reszt aminokwasowych na rysunku fig. 1 - SEQ ID NO:2, dla ułatwienia porównania), R1 oznacza grupę o wzorze NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC, zaś R2 oznacza grupę o wzorze -FN-COOH lub jego warianty i pochodne, bądź sekwencję do niej komplementarną, korzystnie mający sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy obejmującej sekwencje przedstawione na rysunku fig. 2, 3, 4, 5, 6 i 7, a także tę sekwencję o zdegenerowa nych obszarach kodujących, w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. 31. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję aktywną oraz nośnik i/lub substancje pomocnicze, znamienna tym, ze jako substancję aktywną zawiera a) wielowartościową proteinę wiążącą czynnik martwicy nowotworu (TNFbp), obejmującą co najmniej jeden obcięty stnfr obejmujący strukturę określoną następującym wzorem: R1-[Cys19-Cys103]-R2, w którym [Cys19-Cys103] oznacza reszty od 19 do 103 w obciętym stnfr typu-i (którego schemat numeracji reszt aminokwasowych odpowiada kolejności reszt aminokwasowych na rysunku fig. 1 - SEQ ID NO:2, dla ułatwienia porównania), R1 oznacza grupę o wzorze NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC, zaś R2 oznacza grupę o wzorze -FN-COOH lub jego warianty i pochodne, a w szczególności obejmującą obcięty stnfr wybrany z grupy, do której należą: stnfr 2.6D/C105 NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FC-COOH, stnfr 2.6D/C106 NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH, stnfr-i 2.6D/N105 NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FN-COOH, stnfr-i 2.3D/d8 NH2-MYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH, stnfr-i 2.3D/d15 NH2-MSIS-[Cys19 -Cys103]-FNCSL-COOH oraz stnfr-i 2.3D/d18 NH2-M-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH, gdzie obcięty stnfr jest na końcu karboksylowym ewentualnie sprzężony z częścią lub całością stałej domeny ciężkiego lub lekkiego łańcucha ludzkiej immunoglobuliny, przy czym w proteinie TNFbp, wskazana wyżej sekwencja aminokwasów obciętego stnfr jest glikozylowana lub nieglikozylowana, i/lub wskazany obcięty stnfr jest sprzężony z rozpuszczalnym w wodzie polimerem, korzystnie z glikolem polietylenowym, albo b) wielowartościową proteinę wiążącą czynnik martwicy nowotworu (TNFbp) mającą budowę określoną wzorem ogólnym R a-x-rb, w którym: X zawiera linker, gdzie ów linker jest rozpuszczalnym w wodzie polimerem, zaś R a i Rb są biologicznie aktywnymi cząsteczkami kowalentnie związanymi ze wskazanym rozpuszczalnym w wodzie polimerem, przy czym co najmniej jeden z podstawników Ra i Rb jest obciętym stnfr według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4 albo 5, gdzie korzystnie rozpuszczalnym w wodzie polimerem jest glikol polietylenowy, w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. 32. Kompozycja według zastrz. 30 albo 31, znamienna tym, że zawiera kompozycję zapewniającą przedłużone uwalnianie substancji aktywnej. 33. Kompozycja według zastrz. 30 albo 31, znamienna tym, że jest zliofilizowana.

8 189 309 34. Zastosowanie a) obciętego stnfr obejmującego strukturę określoną następującym wzorem: R 1-[Cys19-Cys103]-R2, w którym [Cys19-Cys103] oznacza reszty od 19 do 103 w obciętym stnfr typu-i (którego schemat numeracji reszt aminokwasowych odpowiada kolejności reszt aminokwasowych na rysunku fig. 1 - SEQ ID NO:2, dla ułatwienia porównania), R1 oznacza grupę o wzorze NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC, zaś R2 oznacza grupę o wzorze -FN-COOH lub jego wariantów i pochodnych, albo b) obciętego stnfr będącego rekombinacyjnym produktem ekspresji prokariotycznej lub eukariotycznej komórki gospodarza zawierającej polinukleotyd posiadający sekwencję kodującą obcięty stnfr obejmujący strukturę określoną następującym wzorem: R1-[Cys19-Cys103]-R2, w którym [Cys19-Cys103] oznacza reszty od 19 do 103 w obciętym stnfr typu-i (którego schemat numeracji reszt aminokwasowych odpowiada kolejności reszt aminokwasowych na rysunku fig. 1 - SEQ ID NO:2, dla ułatwienia porównania), R1 oznacza grupę o wzorze NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC, zaś R2 oznacza grupę o wzorze -FN-COOH lub jego warianty i pochodne, bądź sekwencję do niej komplementarną, korzystnie mający sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy obejmującej sekwencje przedstawione na rysunku fig. 2, 3, 4, 5, 6 i 7, a także tę sekwencję o zdegenerowanych obszarach kodujących, bądź c) wielowartościowej proteiny wiążącej czynnik martwicy nowotworu (TNFbp), obejmującej co najmniej jeden obcięty stnfr obejmujący strukturę określoną następującym wzorem: R1-[Cys19-Cys103]-R2, w którym [Cys19-Cys103] oznacza reszty od 19 do 103 w obciętym stnfr typu-i (którego schemat numeracji reszt aminokwasowych odpowiada kolejności reszt aminokwasowych na rysunku fig. 1 - SEQ ID NO:2, dla ułatwienia porównania), R1 oznacza grupę o wzorze NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC, zaś R2 oznacza grupę o wzorze -FN-COOH lub jego warianty i pochodne, a w szczególności obejmującej obcięty stnfr wybrany z grupy, do której należą: stnfr 2.6D/C105 NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FC-COOH, stnfr 2.6D/C106 NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH, stnfr-i 2.6D/N105 NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FN-COOH, stnfr-i 2.3D/d8 NH2-MYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH, stnfr-i 2.3D/d15 NH2-MSIS-[Cys19 -Cys103]-FNCSL-COOH oraz stnfr-i 2.3D/d18 NH2-M-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH, gdzie obcięty stnfr jest na końcu karboksylowym ewentualnie sprzężony z częścią lub całością stałej domeny ciężkiego lub lekkiego łańcucha ludzkiej immunoglobuliny, przy czym w proteinie TNFbp, wskazana wyżej sekwencja aminokwasów obciętego stnfr jest glikozylowana lub nieglikozylowana, i/lub wskazany obcięty stnfr jest sprzęż ony z rozpuszczalnym w wodzie polimerem, korzystnie z glikolem polietylenowym, albo d) wielowartościowej proteiny wiążącej czynnik martwicy nowotworu (TNFbp) mającej budowę określoną wzorem ogólnym R a-x-rb, w którym: X zawiera linker, gdzie ów linker jest rozpuszczalnym w wodzie polimerem, zaś Ra i Rb są biologicznie aktywnymi cząsteczkami kowalentnie związanymi ze wskazanym rozpuszczalnym w wodzie polimerem, przy czym co najmniej jeden z podstawników Ra i Rb jest obciętym stnfr według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, gdzie korzystnie rozpuszczalnym w wodzie polimerem jest glikol polietylenowy,

189 309 9 do wytwarzania środka leczniczego do leczenia chorób mediowanych przez czynnik martwicy nowotworu - TNF. 35. Zastosowanie a) obciętego stnfr obejmującego strukturę określoną następującym wzorem: R1-[Cys19-Cys103]-R2, w którym [Cys19-Cys103] oznacza reszty od 19 do 103 w obciętym stnfr typu-i (którego schemat numeracji reszt aminokwasowych odpowiada kolejności reszt aminokwasowych na rysunku fig. 1 - SEQ ID NO:2, dla ułatwienia porównania), R1 oznacza grupę o wzorze NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC, zaś R2 oznacza grupę o wzorze -FN-COOH lub jego wariantów i pochodnych, albo b) obciętego stnfr będącego rekombinacyjnym produktem ekspresji prokariotycznej lub eukariotycznej komórki gospodarza zawierającej polinukleotyd posiadający sekwencję kodującą obcięty stnfr obejmujący strukturę określoną następującym wzorem: R1-[Cys19-Cys103]-R2, w którym [Cys19-Cys103] oznacza reszty od 19 do 103 w obciętym stnfr typu-i (którego schemat numeracji reszt aminokwasowych odpowiada kolejności reszt aminokwasowych na rysunku fig. 1 - SEQ ID NO:2, dla ułatwienia porównania), R1 oznacza grupę o wzorze NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC, zaś R2 oznacza grupę o wzorze -FN-COOH lub jego warianty i pochodne, bądź sekwencję do niej komplementarną, korzystnie mający sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy obejmującej sekwencje przedstawione na rysunku fig. 2, 3, 4, 5, 6 i 7, a także tę sekwencję o zdegenerowa nych obszarach kodujących, bądź c) wielowartościowej proteiny wiążącej czynnik martwicy nowotworu (TNFbp), obejmującej co najmniej jeden obcięty stnfr obejmujący strukturę określoną następującym wzorem: R1-[Cys19-Cys103]-R2, w którym [Cys19-Cys103] oznacza reszty od 19 do 103 w obciętym stnfr typu-i (którego schemat numeracji reszt aminokwasowych odpowiada kolejności reszt aminokwasowych na rysunku fig. 1 - SEQ ID NO:2, dla ułatwienia porównania), R1 oznacza grupę o wzorze NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC, zaś R2 oznacza grupę o wzorze -FN-COOH lub jego warianty i pochodne, a w szczególności obejmującej obcięty stnfr wybrany z grupy, do której należą: stnfr 2.6D/C105 NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FC-COOH, stnfr 2.6D/C106 NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH, stnfr-i 2.6D/N105 NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FN-COOH, stnfr-i 2.3D/d8 NH2-MYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH, stnfr-i 2.3D/d15 NH2- MSIS-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH oraz stnfr-i 2.3D/d18 NH2-M-[Cys19-Cys103]- -FNCSL-COOH, gdzie obcięty stnfr jest na końcu karboksylowym ewentualnie sprzężony z częścią lub całością stałej domeny ciężkiego lub lekkiego łańcucha ludzkiej immunoglobuliny, przy czym w proteinie TNFbp, wskazana wyżej sekwencja aminokwasów obciętego stnfr jest glikozylowana lub nieglikozylowana, i/lub wskazany obcięty stnfr jest sprzężony z rozpuszczalnym w wodzie polimerem, korzystnie z glikolem polietylenowym, albo d) wielowartościowej proteiny wiążącej czynnik martwicy nowotworu (TNFbp) mającej budowę określoną wzorem ogólnym Ra-X-Rb, w którym: X zawiera linker, gdzie ów linker jest rozpuszczalnym w wodzie polimerem, zaś

10 189 309 Ra i Rb są biologicznie aktywnymi cząsteczkami kowalentnie związanymi ze wskazanym rozpuszczalnym w wodzie polimerem, przy czym co najmniej jeden z podstawników Ra i Rb jest obciętym stnfr według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, gdzie korzystnie rozpuszczalnym w wodzie polimerem jest glikol polietylenowy, albo e) kompozycji farmaceutycznej zawierającej substancję aktywną określoną w punkcie a) albo b), albo c), albo d), ewentualnie zawierającej kompozycję zapewniającą przedłużone uwalnianie substancji aktywnej lub mającej formę liofilizowaną do wytwarzania środka leczniczego do leczenia cukrzycy, przeczulicy bólowej, choroby zapalnej jelit, urazu niedokrwiennego, urazu związanego z reperfuzją lub choroby reumatycznej. 36. Zastosowanie według zastrz. 35, znamienne tym, ze choroba reumatyczna jest wybrana z grupy obejmującej reumatoidalne zapalenie stawów, zapalenie kości i stawów, młodzieńcze (reumatoidalne) zapalenie stawów, zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa, zapalenie skórno-mięśniowe, łuszczycowe zapalenie stawów, twardzina skóry, syndrom Sjö grena oraz zapalenie naczyń. 37. Zastosowanie według zastrz. 34 albo 35, albo 36, znamienne tym, że wytwarzany środek ma postać odpowiednią do podawania dożylnego, domięśniowego, śródskórnego, podskórnego, dostawowego lub przez infuzję. 38. Zastosowanie według zastrz. 34 albo 35, albo 36, znamienne tym, że wytwarzany środek ma postać odpowiednią do stosowania ze środkiem przeciwzapalnym. 39. Zastosowanie według zastrz. 38, znamienne tym, że środek przeciwzapalny jest wybrany z grupy obejmującej niesteroidowe leki przeciwzapalne (N SA ID s), kortykosteroidy, powolnie działające leki przeciwreumatyczne ( S A A R D s) lub leki modyfikujące chorobę (DM ). 40. Zastosowanie według zastrz. 38, znamienne tym, że środkiem przeciwzapalnym jest inhibitor interleukiny-1 (IL-1) wybrany z grupy obejmującej antagonistę receptora IL-1 (IL-1ra) oraz rozpuszczalny receptor IL-1. 41. Zastosowanie według zastrz. 38, znamienne tym, ze środkiem przeciwzapalnym jest metotreksat. 42. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 30 albo 31, znamienna tym, że dodatkowo zawiera środek przeciwzapalny. 43. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 42, znamienna tym, ze środek przeciwzapalny jest wybrany z grupy obejmującej niesteroidowe leki przeciwzapalne (NSAIDs), kortykosteroidy, powolnie działające leki przeciwreumatyczne ( S A A R D s) lub leki modyfikujące chorobę (DM ). 44. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 43, znamienna tym, że środkiem przeciwzapalnym jest metotreksat. 45. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 42, znamienna tym, ze środkiem przeciwzapalnym jest inhibitor interleukiny-1 (IL-1) wybrany z grupy obejmującej antagonistę receptora IL-1 (IL-1ra) oraz rozpuszczalny receptor IL-1. 46. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 45, znamienna tym, że IL-1ra zawiera sekwencję ludzkiego IL-1ra. * * * Przedmiotem wynalazku jest obcięty rozpuszczalny receptor czynnika martwicy nowotworu (stnfr), wielowartościowa proteina wiążąca czynnik martwicy nowotworu (TNFbp), polinukleotyd posiadający sekwencję kodującą stnfr, wektor oraz komórka gospodarza zawierające taki polinukleotyd, sposób wytwarzania stnfr, kompozycja farmaceutyczna, sposób jej wytwarzania oraz zastosowanie stnfr do wytwarzania środka leczniczego. Wynalazek związany jest ze zwalczaniem stanów zapalnych. Stan zapalny jest reakcją obronną organizmu na urazy takie, jak wywołane przez uszkodzenie mechaniczne, infekcję Iub stymulację antygenem. Reakcja zapalna może być wyrażana patologicznie, gdy zapalenie jest wywołane przez nieodpowiedni bodziec taki, jak autoanty-

189 309 11 gen, jest wyrażana w sposób wyolbrzymiony Iub trwa długo po usunięciu czynników urazowych. Taka reakcja zapalna może obejmować wytwarzanie pewnych cytokin. O ile etiologia stanu zapalnego jest jak dotąd słabo rozumiana, znaczącą porcję informacji uzyskano ostatnio odnośnie molekularnych aspektów zapalenia. Badania te doprowadziły do identyfikacji pewnych cytokin, o których uważa się, że odgrywają znaczną rolę w pośredniczeniu zapaleniu. Cytokiny są zewnątrzkomórkowymi proteinami modyfikującymi zachowanie komórek, szczególnie tych komórek, które znajdują się w bezpośrednim obszarze syntezy i uwalniania cytokin. Czynniki martwicy nowotworu (TNFs) są klasą cytokin wytwarzanych przez liczne typy komórek, w tym monocyty i makrofagi. Dotychczas opisano przynajmniej dwa TNFs, mianowicie TNF alfa (TNF-α) i TNF beta (TNF-β Iub limfotoksyna) i każdy z nich jest aktywny jako cząsteczka trimeryczna. Uważa się, że TNF inicjuje sygnalizację komórkową za pośrednictwem receptorów sieciujących (Engelmann i wsp. (1990), J Biol Chem., 265: 14497-14504). Szereg dowodów wskazuje na to, że TNF-α i TNF-β są głównymi cytokinami zapalnymi. Te znane TNFs wywierają ważny wpływ fizjologiczny na szereg różnych komórek docelowych związanych z reakcjami zapalnymi na szereg bodźców takich, jak infekcja i uraz. Proteiny te powodują, że zarówno fibroblasty jak i komórki synowialne wydzielają utajoną kolagenazę i prostagladynę E2 i powodują, ze komórki osteocytowe stymulują resorpcję kości. Proteiny te zwiększają właściwości adhezyjne powierzchni komórek śródbłonkowych w stosunku do neutrofili. Powodują one również, że komórki śródbłonkowe wydzielają aktywność koagulującą oraz zmniejszają ich zdolność do lizy klotów. Ponadto przekierunkowu ją aktywność adypocytów z przechowywania lipidów przez inhibitowanie ekspresji enzymu lipazy lipoproteinowej. TNFs powodują także, że hepatocyty syntezują klasę protein znaną jako reagenty ostrej fazy, które działają na podwzgórze jako pirogeny, tj. substancje gorączkotwórcze (Selby i wsp., (1988), Lancet, 1(8583):483: Starnes, Jr. i wsp. (1988), J Clin Invest, 82:1321; Oliff i wsp. (1987), Cell, 50: 555; i Waage i wsp. (1987), Lancet, 1(8529):355) Ponadto, wyniki badań przedklinicznych na różnych predykcyjnych modelach zwierzęcych zapalenia, włączając w to reumatoidalne zapalenie stawów, sugerują że inhibitowanie TNF może mieć znaczny wpływ na postęp choroby i jej ostrość (Dayer i wsp. (1994), European Cytokine Network, 5(6):563-571 i Feldmann i wsp., (1995), Annals O f The New York Academy O f Sciences, 66:272-278). Ponadto ostatnie wstępne badania kliniczne na ludziach w reumatoidalnym zapaleniu stawów z inhibitorami TNF wykazały obiecujące rezultaty (Rankin i wsp. (1995), British Journal O f Rheumatology, 3(4): 4334-4342; Elliott i wsp. (1995), Lancet, 344:1105-1110; Tak i wsp. (1996), Arthritis and Rheumatism, 39:1077-1081; oraz Paleolog i wsp. (1996), Arthritis and Rheumatism, 39:1082-1091). Inhibitory proteinowe TNF ujawniono w stanie techniki. Dokument EP 308 378 podaje, ze proteina pochodząca z moczu chorych z gorączką ma aktywność inhibitującątnf. Wpływ tej proteiny wynika przypuszczalnie z mechanizmu konkurencji na poziomie receptorów. Dokument EP 308 378 ujawnia proteinę wystarczająco czystą aby mogła być zcharakteryzowana poprzez jej N-koniec. Źródło to jednak nie podaje jakiejkolwiek sekwencji DNA ani inhibitora TNF wytworzonego rekombinacyjnie. Inhibitory TNF wytworzone rekombinacyjnie są również znane w stanie techniki. Przykładowo, dokumenty EP 393 438 i EP 422 339 opisują sekwencje aminokwasów i kwasów nukleinowych dojrzałego, rekombinacyjnego ludzkiego inhibitora TNF o 30 kda (określanego również jako receptor p55 oraz jako stnfr-i) oraz dojrzałego, rekombinacyjnego ludzkiego inhibitora o 40 kda (określanego również jako receptor p75 oraz jako stnfr-ii), jak również ich zmodyfikowanych form, przykładowo fragmentów, funkcjonalnych pochodnych i odmian. Dokumenty EP 393 438 i EP 422 399 ujawniają także sposoby wyodrębnienia genów odpowiedzialnych za kodowanie inhibitorów, klonowania genów w odpowiednich wektorach i typach komórek, oraz ekspresji genu w celu wytworzenia inhibitorów. Wykazano, ze dojrzały rekombinacyjny ludzki inhibitor TNF o 30 kda i dojrzały rekombinacyjny ludzki inhibitor TNF o 40 kda jest zdolny do inhibitowania TNF (EP 393 438, EP 422 339, publikacja PCT nr WO 92/16221 i publikacja PCT nr WO 95/34326). stnfr-i i stnfr-ii są członami superrodziny receptorów TNF i czynnika wzrostu nerwów, która obejmuje receptor czynnika wzrostu nerwu (NGF), antygen CD40 komórki B,

12 189 309 4-1BB, antygen MRC 0X40 szczurzej komórki T, antygen Fas, i antygeny CD27 i CD30 (Smith i wsp., (1990), Science, 248:1019-1023). Najbardziej utrwaloną cechą spośród tej grupy powierzchniowych receptorów komórki jest zewnątrzkomórkowy obszar wiązania ligandu bogaty w cysteinę, który można podzielić na cztery powtarzające się motywy o około 40 aminokwasach i który zawiera 4-6 reszt cysternowych w pozycjach, które są dobrze zachowane. (Smith i wsp., (1990), jak wyżej). Dokument EP 393 438 mówi dalej o A51 inhibitora TNF o 40 kda i A53 inhibitora TNF o 40 kda, które są obciętymi wersjami rekombinacyjnej proteiny inhibitora TNF o 40 kda o pełnej długości, w których odpowiednio 51 Iub 53 reszty aminokwasowe na karboksylowym końcu dojrzałej proteiny zostały usunięte. Zgodnie z tym specjalista w tej dziedzinie techniki może ocenić, że czwarta domena inhibitora TNF o 30 kda, jak również inhibitora o 40 kda nie jest niezbędna dla inhibitowania TNF. W istocie, różne grupy potwierdziły takie stanowisko. Wytworzono pochodne inhibitorów TNF o 30 kda i 40 kda z delecją domen i pochodne te bez czwartej domeny zachowują pełną aktywność wiązania TNF, podczas gdy pochodne odpowiednio bez pierwszej, drugiej Iub trzeciej domeny - nie zachowują aktywności wiązania TNF. (Corcoran i wsp. (1994), Eur. J. Biochem., 223:831-840: Chih-Hsueh i wsp. (1995), The Journal o f Biological Chemistry, 270[6):2874-2878; i Scallon i wsp. (1995), Cytokine, 7(8) :759-770). Wskutek stosunkowo niskiego inhibitowania cytotoksyczności wykazywanego przez inhibitor TNF o 30 kda i inhibitor TNF o 40 kda (Butler i wsp. (1994), Cytokine, 6(6):616-623), różne grupy wytworzyły dimery protein inhibitora TNF (Butler i wsp. (1994), jak wyżej; i Martin i wsp. (1995), Exp. Neurol., 131:221-228). Jednakże dimery mogą wywoływać reakcję przeciwciała (Martin i wsp. (1995), jak wyżej; oraz Fisher i wsp. (1996), The New England Journal o f Medicine, 334(26): 1697-1702). Celem wynalazku jest dostarczenie funkcjonalnie aktywnych obciętych stnfrs. Ten oraz inne cele obecnego wynalazku będą widoczne z poniższego opisu. Wynalazek obejmuje obcięty rozpuszczalny receptor czynnika martwicy nowotworu (obcięty stnfr) obejmujący strukturę określoną następującym wzorem: R1-[Cys19-Cys103]-R2, w którym [Cys19-Cys103] oznacza reszty od 19 do 103 w obciętym stnfr typu-i (którego schemat numeracji reszt aminokwasowych odpowiada kolejności reszt aminokwasowych na rysunku fig. 1 - SEQ ID NO:2, dla ułatwienia porównania), R1 oznacza grupę o wzorze NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC, zaś R2 oznacza grupę o wzorze -FN-COOH oraz jego warianty i pochodne. Korzystnie, obcięty stnfr według wynalazku jest wybrany z grupy obejmującej: stnfr 2.6D/C105 NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FC-COOH, stnfr 2.6D/C106 NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH, stnfr-i 2.6D/N105 NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FN-COOH, stnfr-i 2.3D/d8 NH2-MYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH, stnfr-i 2.3D/d15 NH2-MSIS-[Cys19 -Cys103]-FNCSL-COOH oraz stnfr-i 2.3D/d18 NH2-M-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH. Korzystnie, wyżej określony obcięty stnfr jest na końcu karboksylowym sprzężony z częścią Iub całością stałej domeny ciężkiego Iub lekkiego łańcucha ludzkiej immunoglobuliny. Korzystnie, wskazana sekwencja aminokwasów obciętego stnfr nie jest glikozylowana. Alternatywnie, wskazana sekwencja aminokwasów obciętego stnfr jest glikozylowana. Korzystnie, obcięty stnfr według wynalazku jest sprzężony z rozpuszczalnym w wodzie polimerem. Korzystnym rozpuszczalnym w wodzie polimerem jest glikol polietylenowy. Wynalazkiem objęta jest również wielowartościowa proteina wiążąca czynnik martwicy nowotworu (TNFbp), cechująca się tym, że obejmuje co najmniej jeden obcięty stnfr określony wyżej.

189 309 13 Korzystnie, TNFbp według wynalazku zawiera dimer obciętego stnfr, sprzężonego na końcu karboksylowym z częścią Iub całością stałej domeny ciężkiego lub lekkiego łańcucha ludzkiej immunoglobuliny. Korzystnie, TNFbp według wynalazku ma budowę określoną wzorem ogólnym Ra-X- Rb, w którym: X zawiera linker, gdzie ów linker jest rozpuszczalnym w wodzie polimerem, zaś Ra i Rb są biologicznie aktywnymi cząsteczkami kowalentnie związanymi ze wskazanym rozpuszczalnym w wodzie polimerem, gdzie co najmniej jeden z podstawników Ra i Rb jest wyżej określonym obciętym stnfr. Korzystnie, w TNFbp według wynalazku rozpuszczalnym w wodzie polimerem stanowiącym część linkera jest glikol polietylenowy. Korzystnie, w TNFbp według wynalazku obcięty stnfr ma budowę określoną wzorem ogólnym Ra-X-Rb, w którym: X zawiera linker, gdzie ów linker jest PEG-20.000-bis-winylosulfonem, zaś Ra i Rb - każdy oznacza NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FC-COOH (określany także jako stnfr-i 2.6D/C105) albo wzorem ogólnym Ra-X- Rb, w którym: X zawiera linker, gdzie ów linker jest PEG-20.000-bis-winylosulfonem, zaś Ra i Rb - każdy oznacza NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL- COOH (określany także jako stnfr-i 2.6D/C106). Wynalazek obejmuje także polinukleotyd posiadający sekwencję kodującą obcięty stnfr określony wyżej lub sekwencję komplementarną względem niej. Korzystnie, polinukleotyd według wynalazku ma sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy obejmującej sekwencje przedstawione na rysunku fig. 2, 3, 4, 5, 6 i 7, a także te sekwencję o zdegenerowanych obszarach kodujących. Wynalazek obejmuje także wektor zawierający polinukleotyd określony wyżej, operacyjnie przyłączony do sekwencji kontrolującej ekspresję. Wynalazkiem objęta jest również prokariotyczna lub eukariotyczna komórka gospodarza zawierająca polinukleotyd określony wyżej albo wektor zawierający taki polinukleotyd. Zgodnie z wynalazkiem sposób wytwarzania obciętego stnfr, polega na tym, ze obejmuje prowadzenie hodowli komórki gospodarza określonej wyżej, utrzymywanie komórek gospodarza w warunkach pozwalających na ekspresję obciętego stnfr przez te komórki gospodarza oraz ewentualnie wyodrębnienie wytworzonego obciętego stnfr. W sposobie według wynalazku, jako komórkę gospodarza stosuje się komórkę E coli. Korzystnie, jako komórki gospodarza stosuje się E. coli. Korzystnie w sposobie wytwarzania obciętego stnfr, według wynalazku wyodrębnia się następujące etapy: a) etap prowadzenia hodowli prokariotycznej lub eukariotycznej komórki gospodarza określonej wyżej, b) etap utrzymywania komórek gospodarza w warunkach pozwalających na ekspresję obciętego stnfr przez te komórki gospodarza oraz c) ewentualnie etap wyodrębnienia wytworzonego obciętego stnfr. Wynalazek dotyczy także obciętego stnfr będącego rekombinacyjnym produktem ekspresji prokariotycznej lub eukariotycznej komórki gospodarza zdefiniowanej wyżej. Wynalazek obejmuje także sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej zawierającej substancję aktywną oraz nośnik i ewentualne substancje pomocnicze, polegający na tym, ze jako substancję aktywną stosuje się obcięty stnfr określony wyżej i/lub wielowartościową proteinę wiążącą TNF (TNFbp) określoną wyżej i terapeutycznie skuteczną ilość wskazanej substancji aktywnej miesza się z jednym lub z więcej niż jednym farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.

14 189 309 Kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję aktywną i nośnik oraz ewentualne substancje pomocnicze, według wynalazku cechuje się tym, ze jako substancję aktywną zawiera obcięty stnfr określony wyżej, w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. Alternatywnie, kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję aktywną i nośnik oraz ewentualne substancje pomocnicze, według wynalazku cechuje się tym, że jako substancję aktywną zawiera wielowartościową proteinę wiążącą TNF (TNFbp) określoną wyżej, w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. Korzystnie, kompozycja według wynalazku zawiera kompozycję zapewniającą przedłużone uwalnianie substancji aktywnej. Korzystnie również kompozycja według wynalazku jest zliofilizowana. Wynalazek obejmuje także zastosowanie obciętego stnfr określonego wyżej albo wielowartościowej proteiny wiążącej TNF (TNFbp) określonej wyżej do wytwarzania środka leczniczego do leczenia chorób mediowanych przez czynnik martwicy nowotworu - TNF. Zgodnie z wynalazkiem obcięty stnfr określony wyżej, albo wielowartościowa proteina wiążąca TNF (TNFbp) określona wyżej, albo też kompozycja farmaceutyczna określona wyżej znajdują zastosowanie do wytwarzania środka leczniczego do leczenia cukrzycy, prze czulicy bólowej, choroby zapalnej jelit, urazu niedokrwiennego, urazu związanego zreperfuz ją lub choroby reumatycznej. Choroba reumatyczna jest przy tym wybrana z grupy obejmującej reumatoidalne zapalenie stawów, zapalenie kości i stawów, młodzieńcze (reumatoidalne) zapalenie stawów, zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa, zapalenie skórnomięśniowe, łuszczycowe zapalenie stawów, twardzina skóry, syndrom Sjögrena oraz zapalenie naczyń. Zgodnie z zastosowaniem według wynalazku wytwarzany środek leczniczy ma postać odpowiednią do podawania dożylnego, domięśniowego, śródskórnego, podskórnego, dostawowego lub przez infuzję. Korzystnie, wytwarzany środek ma postać odpowiednią do podawania przed, po lub równocześnie z podawaniem środka przeciwzapalnego. W zastosowaniu według wynalazku środek przeciwzapalny jest wybrany z grupy obejmującej niesteroidowe leki przeciwzapalne (NSAIDs), kortykosteroidy, powolnie działające leki przeciwreumatyczne (SAARDs) Iub leki modyfikujące chorobę (DM). Środkiem przeciwzapalnym może być również inhibitor interleukiny-1 (IL-1) wybrany z grupy obejmującej antagonistę receptora IL-1 (IL-1ra) oraz rozpuszczalny receptor IL-1. Korzystnym środkiem przeciwzapalnym jest metotreksat. Zgodnie z wynalazkiem, kompozycja farmaceutyczna może dodatkowo zawierać środek przeciwzapalny. Korzystnie, środek przeciwzapalny jest wybrany z grupy obejmującej niesteroidowe leki przeciwzapalne (NSAIDs), kortykosteroidy, powolnie działające leki przeciwreumatyczne (SAARDs) lub leki modyfikujące chorobę (DM), zwłaszcza metotreksat. Środkiem przeciwzapalnym może być również inhibitor interleukiny-1 (IL-1) wybrany z grupy obejmującej antagonistę receptora IL-1 (IL-1ra) oraz rozpuszczalny receptor IL-1. Korzystnie IL-1ra zawiera sekwencję ludzkiego IL-1ra. Obecny wynalazek dotyczy funkcjonalnie aktywnych obciętych form stnfr-i, które w niniejszym opisie określane są jako obcięty stnfr lub obcięte stnfrs. Obcięte stn- FRs są zmodyfikowanymi formami stnfr-i, które nie zawierają czwartej domeny (reszty aminokwasowe Thr127-Asn161 w stnfr-i); części trzeciej domeny (reszty aminokwasowe Asn111-Cys126 w stnfr-i) oraz ewentualnie nie zawierają części pierwszej domeny (reszty aminokwasowe Asp1-Cys19 w stnfr-i). Te nowe inhibitory TNF (przykładowo TNF-α i/lub TNF-β) mają ogólną stosowalność. Obcięte stnfrs według wynalazku obejmują proteiny określone wzorem R 1-[Cys19 -Cys103]-R2. Proteiny te są obciętymi formami stnfr-i. Przez określenie R1-[Cys19-Cys103]-R2 rozumie się jedną lub więcej protein w których [Cys19-Cys103] oznacza reszty od 19 do 103 w stnfr-i; schemat numeracji reszt aminokwasowych jest podany na rysunku fig. 1 (SEQ ID NO:2) dla ułatwienia porównania, gdzie R1 i R2 mają wyżej określone znaczenie. W jednym aspekcie obecnego wynalazku obcięte stnfrs mogą być wytworzone w postaci form glikozylowanych lub nieglikozylowanych. Obcięte stnfrs wytwarza się

189 309 15 rekombinacyjnymi technikami inżynierii genetycznej. W alternatywnym wykonaniu obcięte stnfrs syntezuje się metodami chemicznymi lub metodami mieszanymi: rekombinacyjnymi i chemicznymi. W innym aspekcie obecnego wynalazku obcięte stnfrs można derywatyzować przez przyłączenie obciętych stnfrs do polimeru rozpuszczalnego w wodzie. Przykładowo, obcięte stnfrs można sprzęgać z jedną lub większą ilością cząsteczek glikolu polietylenowego aby polepszyć farmakokinetyczne właściwości przez zwiększenie pozornego ciężaru cząsteczkowego tej cząsteczki. Jeszcze inny aspekt obecnego wynalazku obejmuje różne polinukleotydy kodujące obcięte stnfrs. Odpowiednie sekwencje kwasów nukleinowych obejmują przykładowo te specyficznie przedstawione na załączonych rysunkach, jak również sekwencje degenerowane i występujące w naturze ich odmiany alelowe. Takie sekwencje kwasów nukleinowych można stosować w ekspresji obciętych stnfrs w eukariotycznych lub prokari otycznych komórkach gospodarza, przy czym produkty ekspresji lub ich pochodne charakteryzują się zdolnością modulowania aktywności TNF. Dalszy aspekt obecnego wynalazku obejmuje wektory zawierające polinukleotydy kodujące obcięte stnfrs operacyjnie połączone z sekwencjami kontrolnymi amplifikacji i/lub ekspresji. Zarówno prokariotyczne jak i eukariotyczne komórki gospodarza mogą być trwale transformowane lub transfekowane takimi wektorami dla ekspresji obciętych stnfrs. Obecny wynalazek obejmuje ponadto rekombinacyjne wytwarzanie obciętych stnfrs, przy czym komórki gospodarza zawierające takie polinukleotydy hoduje się w odpowiedniej pożywce do hodowli, a obcięte stnfrs będące wynikiem ekspresji w tych komórkach są, ewentualnie, wyodrębniane z komórek gospodarza i/lub z pożywki do hodowli. Inny aspekt obecnego wynalazku obejmuje kompozycje farmaceutyczne zawierające obcięte stnfrs lub ich pochodne. Typowo obcięte stnfrs lub ich pochodne można przeprowadzać w preparat w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnymi zarobkami. Można użyć szereg innych substancji pomocniczych które ułatwiają wytwarzanie, przechowywanie, posługiwanie się, dostarczanie oraz i/lub skuteczność obciętych stnfrs Iub ich pochodnych. Środki lecznicze wytwarzane zgodnie z zastosowaniem według wynalazku służą do modulowania aktywności TNF w szczególności choroby, w których pośredniczy TNF (przykładowo choroby z pośrednictwem TNF-α i/lub TNF-β) można leczyć przez podawanie pacjentowi terapeutycznie skutecznych ilości obciętych stnfrs lub ich pochodnych. Polinukleotydy kodujące obcięte stnfr-y można również stosować w terapii komórkowej lub w terapii genowej. Obcięte stnfrs według wynalazku nadają się szczególnie do wytwarzania ilości proteiny na dużą skalę. Na przykład stnfr-i ma miejsce deamidowania w obrębie sekwencji aminokwasowej od 111 do 126 (aminokwasy Asn11 -Gly126). Można się spodziewać, że nieobecność tego miejsca zwiększy trwałość biochemiczną oczyszczonej proteiny zmniejszając możliwe produkty degradacji i prowadząc do protein bardziej trwałych przy przechowywaniu. Obcięte stnfrs mają mniej mostków dwusiarczkowych niż poprzednio ujawnione proteiny inhibitorów TNF. Przykładowo stnfr-i ma dwa mostki dwusiarczkowe w obrębie sekwencji aminokwasowej od 1 1 1 do 126 i trzy mostki dwusiarczkowe w obrębie sekwencji aminokwasowej od 127 do 161. Zmniejszona liczba mostków dwusiarczkowych jest ważna z tego względu, że większe ilości tych połączeń mogą skomplikować proces powtórnego fałdowania proteiny. Nieoczekiwanie, obcięte stnfrs mają mniej miejsc dla epitopów antygenowych niż inne, poprzednio ujawnione proteiny inhibitorów TNF (przykładowo skrócona forma stnfr- I mająca pierwsze trzy domeny, ma neo-epitopy spowodowane przez wyeksponowanie pewnych reszt; patrz przykład III), co prowadzi do stosunkowo zmniejszonej antygenności i nie daje znaczącego zmniejszenia w szybkości usuwania z krwioobiegu przy powtarzanym podawaniu. Można się spodziewać, że zmniejszona immunogenność obciętych stnfrs jest odpowiednia dla leczenia chorób z pośrednictwem TNF, w tym w szczególności przewlekłych chorób zapalnych. Dalsze aspekty i korzyści z tego wynalazku będą widoczne dla biegłych w sztuce po zapoznaniu się z poniższym opisem, który podaje szczegóły praktyki obecnego wynalazku.