(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 381 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 21.06.07 07796.6 (13) (1) T3 Int.Cl. C12Q 1/68 (06.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 26.09.12 Europejski Biuletyn Patentowy 12/39 EP 381 B1 (4) Tytuł wynalazku: Kompozycja DNA przeciwko FAP - antygenowi zrębowemu nowotworu i sposoby jej stosowania () Pierwszeństwo: 21.06.06 US 81316 P (43) Zgłoszenie ogłoszono: 18.03.09 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 09/12 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: 31.01.13 Wiadomości Urzędu Patentowego 13/01 (73) Uprawniony z patentu: THE SCRIPPS RESEARCH INSTITUTE, La Jolla, US (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP 381 T3 RALPH A. REISFELD, La Jolla, US MARKUS LOEFFLER, San Diego, US JÖRG A. KRÜGER, San Diego, US ANDREAS G. NIETHAMMER, La Jolla, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Marta Kawczyńska POLSERVICE KANCELARIA RZECZNIKÓW PATENTOWYCH SP. Z O.O. ul. Bluszczańska 73 00-712 Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

3 17/P31226PL00 Opis EP 2 03 81 B1 1 DZIEDZINA WYNALAZKU [0001] Wynalazek ten dotyczy kompozycji kwasu deoksyrybonukleinowego (DNA) kodujących odpowiednie cząsteczki skuteczne we wzbudzaniu odpowiedzi immunologicznej przeciwko komórkom fibroblastów zrębowych w nowotworach. Konkretniej, wynalazek ten dotyczy kompozycji DNA kodujących antygen zrębowy znany jako białko aktywujące fibroblasty (FAP, ang. fibroblast activation protein). Wynalazek ten dotyczy również sposobów stosowania kompozycji DNA do hamowania wzrostu nowotworu i przerzutów nowotworu oraz do zwiększania pobierania czynników chemioterapeutycznych przez komórki. 2 TŁO WYNALAZKU [0002] Staje się coraz bardziej oczywiste, że antygeny nowotworowe są wymykającymi się celami dla terapii nowotworowej. Można to wyjaśnić rozmaitymi właściwościami unikalnymi dla komórek nowotworowych, obejmującymi mutacje ich antygenów i nieodpowiednią prezentację antygenów na skutek obniżenia poziomu ekspresji antygenu MHC. Ponadto, defekty w przekazywaniu sygnałów związanych z apoptozą, jak również podwyższenie poziomu inhibitorów apoptozy, takich jak surwiwina, XIAP lub antyapoptotycznych przedstawicieli rodziny bcl-2 nie tylko nadają oporność

4 1 2 na zabijanie za pośrednictwem komórek T, ale również na indukujący apoptozę efekt czynników chemioterapeutycznych. [0003] Jest coraz więcej danych, że przedział zrębowy odgrywa kluczową rolę w nowotworzeniu i inwazji nowotworu. Pokazano, że komórki zrębowe stymulują transformację prawidłowych komórek nabłonkowych i wymianę czynników wzrostu, cytokin i związków chemotaktycznych w celu aktywacji sąsiadującej substancji pozakomórkowej oraz indukcji selekcji i ekspansji komórek nowotworowych. W jednym z badań odnotowano, że komórki nowotworowe wstrzyknięte myszom jako zawiesina nie dawały guzów nowotworowych, podczas gdy wstrzykniecie fragmentów litych guzów nowotworowych zawierających ich zrąb prowadziło do wzrostu guza nowotworowego (patrz Singh i wsp. J. Exp. Med. 1992; 17:139-146). Aktywowana substancja pozakomórkowa nadaje oporność na chemioterapię za pośrednictwem integryn β1, które przywierają do fibronektyny, prowadząc do aktywacji stymulowanej przez integrynę β1 kinazy tyrozynowej, która z kolei hamuje apoptozę indukowaną przez chemioterapię. To zjawisko opisano dla wrażliwych na doksorubicynę komórek szpiczaka, u których rozwinęła się oporność po przywarciu do fibronektyny. Ostatnie doniesienia wskazują, że poprzez modulowanie nowotworowych fibroblastów zrębowych lub przez dystrybucję nowotworowej sieci zrębowej można uzyskać odrzucenie nowotworu. Dodatkowo, istnieją doniesienia, że związane z nowotworem makrofagi i fibroblasty przyczyniają się do powstawania miejscowego środowiska immunosupresyjnego dzięki ich zdolności do

1 2 syntetyzowania białek, takich jak VEGF, TGF-β1 i IL-. VEGF działa jako inhibitor dojrzewania komórek dendrytycznych, a zatem prowadzi do powstania komórek T z tolerancją. VEGF jest również głównym czynnikiem uczestniczącym w angiogenezie w guzie nowotworowym. Aktywacja VEGF prowadzi do podniesienia poziomu surwiwiny i wielu innych białek hamujących apoptozę w nowotworowych komórkach śródbłonkowych, chroniąc ją przed apoptotycznymi efektami chemioterapii. Natomiast hamowanie TGF-β1 może prowadzić do likwidacji nowotworu i ochrony przed przerzutami. IL- hamuje dojrzewanie komórek dendrytycznych i hamuje w ten sposób przeciwnowotworowe odpowiedzi komórkowe, w których pośredniczą komórki Th1. Ten efekt przekierowuje komórki dendrytyczne w stronę w dużej mierze nieskutecznych humoralnych odpowiedzi immunologicznych. [0004] Fibroblasty są komórkami tkanki łącznej, które wydzielają substancję pozakomórkową bogatą w kolagen i inne makrocząsteczki. Fibroblasty w zrębie nowotworu (tj. tkance podtrzymującej nowotwór) syntetyzują białko aktywujące fibroblasty (FAP), białko transbłonowe typu II, które działa jak proteaza serynowa. FAP wykazuje wybiórczą nadekspresję w ponad 90% fibroblastów zrębowych związanych z rakami okrężnicy, sutka i płuc. Przejściową nadekspresję FAP można również zaobserwować w czasie gojenia się ran i w niektórych płodowych tkankach mezenchymalnych. Dodatkowo, istnieją doniesienia, że ten enzym przecina żelatynę i kolagen typu I oraz,że uczestniczy w remodelowaniu substancji pozakomórkowej. Zgodnie z doniesieniami, nadekspresja FAP prowadzi do promowania wzrostu nowotworu i

6 1 2 zwiększenia się potencjału przerzutowania, natomiast traktowanie przeciwciałami anty-fap hamuje wzrost nowotworu. Ponadto, ekspresja w zrębie nowotworu kolagenu typu I, który jest wytwarzany głównie przez fibroblasty, jest odwrotnie proporcjonalne do pobierania donowotworowego rozmaitych związków, obejmujących czynniki chemioterapeutyczne, co stanowi o udziale przedziału zrębowego w oporności na chemioterapię. [000] Szczepionki stosuje się do zapewniania długotrwałej ochrony przeciwko wielu stanom chorobowym poprzez bardzo ograniczone zastosowanie czynnika profilaktycznego, który stymuluje układ immunologiczny organizmu do niszczenia patogenów chorobowych zanim zdołają się one namnożyć się i wywołać efekt patologiczny. Rozmaite podejścia do szczepionek i szczepień są opisane w Bernard R. Glick i Jack J. Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA, Wydanie drugie, ASM Press str. 23-276 (1998). [0006] Szczepienie jest środkiem indukującym układ immunologiczny własnego organizmu do wyszukania i niszczenia czynnika zakaźnego zanim spowoduje on odpowiedź patologiczną. Typowo, szczepionki są bądź żywymi, bądź atenuowanymi czynnikami zakaźnymi (wirusem lub bakterią) albo zabitą postacią takiego czynnika. Szczepionka składająca się z żywych bakterii albo wirusa musi być niepatogenna. Typowo, hodowla bakteryjna albo wirusowa jest atenuowana (osłabiana) poprzez traktowanie fizyczne albo chemiczne. Mimo iż czynnik jest niewirulentny, może on nadal wzbudzać

7 1 2 odpowiedź immunologiczną u osobnika traktowanego szczepionką. [0007] Odpowiedź immunologiczna jest wzbudzana przez antygeny, które mogą być bądź konkretnymi makrocząsteczkami, bądź czynnikiem zakaźnym. Te antygeny są generalnie albo białkami, polisacharydami, lipidami albo glikolipidami, które są rozpoznawane jako obce przez limfocyty znane jako komórki B i komórki T. Ekspozycja obydwu typów limfocytów na antygen wzbudza odpowiedź - szybki podział komórek i różnicowanie, prowadząc do powstawania klonów eksponowanych limfocytów. Komórki B wytwarzają komórki plazmatyczne, które z kolei wytwarzają białka zwane przeciwciałami (Ab, ang. antibodies), które wiążą się wybiórczo z antygenami obecnymi na czynniku zakaźnym i w ten sposób naturalizują lub inaktywują patogen (odpowiedź humoralna). W niektórych przypadkach odpowiedź komórek B wymaga wspomagania przez pomocnicze komórki T CD4. [0008] Wyspecjalizowany klon komórek T, który tworzy się w odpowiedzi na ekspozycję na antygen, to cytotoksyczny limfocyt T (CTL), który jest zdolny do wiązania się z i eliminowania patogenów i tkanek, które prezentują antygen (odporność, w której pośredniczą komórki, albo komórkowa). W niektórych przypadkach, komórki prezentujące antygen (APC, ang. antigen presenting cell), takie jak komórki dendrytyczne, będą otaczały patogen lub inną obcą komórkę poprzez endocytozę. APC dokonuje następnie obróbki antygenów z komórek i prezentuje te antygeny w postaci kompleksu - cząsteczka zgodności tkankowej:peptyd receptorowi

8 1 2 komórek T (TCR, ang. T cell receptor) na CTL, stymulując w ten sposób odpowiedź immunologiczną. [0009] Odporność humoralna, charakteryzująca się tworzeniem swoistych przeciwciał, jest generalnie najbardziej skuteczna przeciw ostrym infekcjom bakteryjnym i powtórnym infekcjom wirusami, podczas gdy odporność za pośrednictwem komórek jest bardziej skuteczna przeciw infekcji wirusowej, przewlekłej wewnątrzkomórkowej infekcji bakteryjnej i infekcji grzybiczej. Wiadomo również, że odporność komórkowa chroni przeciwko pewnym nowotworom i jest odpowiedzialna za odrzucanie przeszczepów narządów. [00] Przeciwciała wobec antygenów z poprzednich infekcji pozostają wykrywalne we krwi przez bardzo długie okresy czasu, co daje możliwość ustalenia wcześniejszej ekspozycji na patogen. Podczas ponownej ekspozycji na ten sam patogen, układ immunologiczny skutecznie zapobiega ponownej infekcji poprzez eliminację czynnika patogennego zanim ten zdoła się namnożyć i wytworzyć odpowiedź patogenną. [0011] Taka sama odpowiedź immunologiczna, jaka byłaby wzbudzona przez patogen, może również czasem być wytwarzana przez czynnik niepatogenny, który prezentuje ten sam antygen jak patogen. W ten sposób, osobnik może być chroniony przed następującą później ekspozycją na patogen bez zwalczonej uprzednio infekcji. [0012] Jednakże nie wszystkie czynniki zakaźne można łatwo hodować i inaktywować, jak jest to wymagane przy wytwarzaniu szczepionki. Nowoczesne techniki rekombinowania DNA umożliwiły, w poszukiwaniu sposobów przezwyciężenia tego ograniczenia, wytworzenie nowych

9 1 2 szczepionek. Można wytworzyć czynniki zakaźne, które nie mają genów patogennych, pozwalając zatem na zastosowanie żywej, niewirulentnej postaci organizmu jako szczepionki. Możliwe jest również poddanie manipulacjom stosunkowo niepatogennego organizmu, takiego jak E. coli, tak aby prezentował antygeny z powierzchni komórki patogennego nosiciela. Układ immunologiczny osobnika szczepionego takim transformowanym nośnikiem daje się nabrać wytwarzając przeciwciała wobec patogenu. Białka antygenowe czynnika patogennego można poddać manipulacjom i wytworzyć w niepatogennych gatunkach, a białka antygenowe mogą być izolowane i oczyszczane w celu wytworzenia szczepionki podjednostkowej. Szczepionki podjednostkowe mają taką zaletę, że są stabilne, bezpieczne i chemicznie dobrze zdefiniowane, jednakże przeszkodę w ich wytwarzaniu mogą stanowić koszty. [0013] W ostatnich latach wyłoniło się nowe podejście do szczepionek, szeroko nazywane immunizacją genetyczną. W tym podejściu, kwas nukleinowy (polinukleotyd) kodujący antygen czynnika patogennego jest wstawiany w sposób umożliwiający działanie do komórek u osobnika, który ma być immunizowany. Traktowane komórki, korzystnie komórki prezentujące antygen (APC), takie jak komórki dendrytyczne, są transformowane i wytwarzają białka antygenowe patogenu. Te wytwarzane in vivo antygeny wzbudzają następnie pożądaną odpowiedź immunologiczną w gospodarzu. Materiałem genetycznym stosowanym w takich szczepionkach genetycznych może być bądź konstrukt DNA, bądź RNA. Często, polinukleotyd kodujący antygen jest

1 2 wprowadzany łącznie z innymi promotorowymi sekwencjami polinukleotydowymi w celu wzmocnienia insercji, replikacji lub ekspresji genu. [0014] Szczepionki oparte na DNA kodującym geny antygenów można wprowadzać do komórek gospodarza osobnika przy zastosowaniu rozmaitych systemów dostarczania. Te systemy dostarczania obejmują prokariotyczne i wirusowe systemy dostarczania. Na przykład, jednym z podejść jest stosowanie wektora wirusowego, takiego jak wirus krowianki z wbudowanym nowym materiałem genetycznym, do zaszczepiania komórek gospodarza. Alternatywnie, materiał genetyczny może być wstawiony do wektora plazmidowego albo może być dostarczony bezpośrednio do komórek gospodarza jako nagi polinukleotyd, tj. po prostu jako oczyszczony DNA. Dodatkowo, DNA może być stabilnie transfekowany do atenuowanych bakterii, takich jak Salmonella typhimurium. Kiedy pacjent jest szczepiony doustnie transformowaną Salmonella, bakterie są transportowane do kępek Peyera w jelicie (tj. drugorzędowych tkanek limfoidalnych), które następnie stymulują odpowiedź immunologiczną. [001] Szczepionki DNA dają możliwość immunizacji przeciw stanom chorobowym, które nie są powodowane przez tradycyjne patogeny, takim jak choroby genetyczne i nowotwór. Typowo, genetyczna szczepionka nowotworowa wprowadza do APC gen, który koduje antygen tak, że transformowane APC wytwarzają antygeny wobec komórki nowotworowej konkretnego typu. Skuteczna ogólna szczepionka przeciw wielu typom nowotworów może zatem obejmować wiele indywidualnych szczepionek dla komórki

11 nowotworowej każdego typu, wobec której ma nastąpić immunizacja. [0016] Istnieje ciągła potrzeba ogólnie skutecznej kompozycji DNA, takiej jak szczepionka, do immunizacji przeciw różnym postaciom nowotworu. Niniejszy wynalazek spełnia to zapotrzebowanie. STRESZCZENIE WYNALAZKU 1 2 [0017] Kompozycja DNA skuteczna w hamowaniu wzrostu nowotworu i przerzutów nowotworu zawiera konstrukt DNA, który koduje co najmniej jeden epitop białka aktywującego fibroblasty (FAP), który może podlegać ekspresji w komórkach odpornościowych osobnika, któremu konstrukt DNA został podany. Konstrukt DNA włącza się do farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika. Kompozycja może kodować pojedynczy epitop FAP, polipeptyd zawierający dwa albo więcej epitopów FAP, całe białko FAP lub jego dowolną część, która będzie wzbudzać pożądaną odpowiedź immunologiczną przeciw komórkom zrębowym nowotworu. Korzystne jest, jeżeli konstrukt DNA koduje ludzkie FAP mające sekwencję reszt aminokwasowych składającą się z NR ID. SEKW.: 2 lub białko, które ma co najmniej 80% podobieństwa sekwencji z NR ID. SEKW.: 2 i które zawiera co najmniej jeden epitop FAP. [0018] Konstrukt DNA może być konstruktem nagiego DNA, korzystnie w postaci plazmidu. Takie konstrukty nagiego DNA można wprowadzić w liposomowym nośniku do dostarczania, polimerycznym nośniku do dostarczania, poprzez elektroporację, strzelbą genową i tym podobne,

12 1 2 jeśli jest to pożądane. W niektórych korzystnych wykonaniach, konstrukt DNA wprowadza się w wektorze - atenuowanym wirusie lub wektorze - atenuowanej bakterii. [0019] W korzystnym wykonaniu konstrukt DNA wprowadza się w wektorze - atenuowanej bakterii, takiej jak atenuowana Salmonella typhimurium, najkorzystniej podwójnie atenuowany (AroA -, dam - ) szczep Salmonella typhimurium. [00] Ewentualnie, kompozycja DNA może również zawierać konstrukt DNA kodujący odpornościowe białko efektorowe, takie jak cytokina. Korzystne cytokiny obejmują CCL21, IL-2 i CD40LT. [0021] Kompozycje DNA według niniejszego wynalazku mogą działać jako szczepionki, których celem jest antygen FAP nowotworowych fibroblastów zrębowych, który służy jako cel dla immunoterapii nowotworowej za pośrednictwem komórek T. Fibroblasty zrębowe są nietransformowanymi komórkami obecnymi w środowisku nowotworu, które podtrzymują wzrost nowotworu. Podejście z użyciem jako celu FAP, który ulega ekspresji w fibroblastach zrębowych ma szereg zalet w stosunku do terapii skierowanych wobec antygenów, które ulegają ekspresji jedynie w komórkach nowotworowych. Po pierwsze, fibroblasty zrębowe są genetycznie bardziej stabilne niż często mutująca heterogenna populacja komórek nowotworowych. Zatem ekspresja docelowego antygenu pozostaje bardziej stabilna i służy jako bardziej wiarygodny cel dla immunoterapii. Po drugie, na prezentację antygenu z fibroblastów zrębowych kompleksowi receptora komórek T nie ma niekorzystnego

13 1 2 wpływu obniżony poziom ekspresji antgenu MHC, co ma często miejsce w przypadku komórek nowotworowych. Po trzecie, komórki nowotworowe często stają się coraz bardziej oporne na zabijanie za pośrednictwem komórek T na skutek defektu w szlakach przekazywania sygnałów w apoptozie, zwiększenia poziomu białek przeciwapoptotycznych lub immunosupresyjnych efektów wobec CTL. Dodatkowo, wykorzystanie jako celu FAP, które jest specyficznie nadprodukowane w przedziale zrębowym w ponad 90% raków okrężnicy, sutka i płuc, umożliwia zastosowanie kompozycji farmaceutycznej do leczenia wielu różnych chorób nowotworowych, w przeciwieństwie do terapii obejmujących antygeny, które ulegają ekspresji jedynie w konkretnych typach nowotworów. [0022] W jednym z korzystnych wykonań, kompozycje DNA według niniejszego wynalazku przełamują tolerancję obwodowych komórek T wobec własnego antygenu FAP poprzez dostarczenie jego cdna jako doustnej kompozycji DNA przy zastosowaniu wektora do dostarczania - atenuowanej bakterii (np. atenuowanego szczepu Salmonella typhimurium) do komórek prezentujących antygen w drugorzędowym narządzie limfoidalnym, tj. kępkach Peyera w jelicie cienkim. W podejściu profilaktycznym, przeciwnowotworowa odpowiedź immunologiczna za pośrednictwem komórek T indukowana przez szczepienie kompozycją DNA według wynalazku hamowała wzrost nowotworu w dwóch różnych modelach nowotworów myszowatych (ang. murine), tj. opornym na wiele leków raku okrężnicy CT26 i opornym na wiele leków raku sutka D2F2. Niniejsze kompozycje DNA również

14 1 2 znacząco hamują rozsiewanie się ustabilizowanych przerzutów płucnych w terapeutycznym modelu raka okrężnicy CT26. [0023] Korzystna kompozycja DNA zawiera nośnik - atenuowaną Salmonella, która jest podwójnie atenuowanym szczepem S. typhimurium oznaczonym jako RE 88 i który zawiera mutacje dam - i AroA -, dostępnym z Remedyne Corporation (Santa Barbara, CA). Nośnik - atenuowana Salmonella zawiera DNA kodujący co najmniej jeden epitop FAP, który może ulegać ekspresji w komórkach odpornościowych. Sama bakteria nie wytwarza FAP, ale raczej dostarcza DNA FAP do komórek odpornościowych (np. makrofagów i komórek dendrytycznych), w których z kolei ulega ekspresji FAP. Takie kompozycje mogą przedłużyć efekty przeciwnowotworowe do miesięcy, a także dają znaczące podniesienie poziomu markerów aktywacji komórek T, komórek NK i komórek DC w modelach myszowatych. Ponadto, doświadczenia z usuwaniem komórek T in vivo wskazywały na udział jedynie komórek T CD8 + i brak udziału komórek T CD4 +. Efekty cytotoksyczne in vitro za pośrednictwem komórek T CD8 + były skierowane swoiście przeciw komórkom docelowym z nadekspresją antygenu FAP. Przykładowo, jako dowód w obmyślonym doświadczeniu, komórki T CD8 + z myszy szczepionych kompozycją według wynalazku indukowały in vitro lizę cytotoksyczną komórek nowotworowych poddanych manipulacjom tak, żeby uzyskać nadekspresję FAP, co wskazuje na swoistą odpowiedź immunologiczną wobec FAP. Zaskakująco, mimo iż można zaobserwować przejściową nadekspresję FAP również w czasie gojenia się ran, nie zaobserwowano negatywnego wpływu na gojenie się ran

1 1 2 spowodowanego szczepieniem kompozycjami DNA według wynalazku. [0024] Kompozycje DNA według niniejszego wynalazku mogą również zawierać konstrukty DNA, które kodują odpornościowe cząsteczki efektorowe jako adiuwanty dla kompozycji. Takie odpornościowe cząsteczki efektorowe obejmują na przykład IL-2, induktor proliferacji komórek T; CCL21, chemokinę, wobec której dojrzałe komórki dendrytyczne i naiwne komórki T wykazują chemotaksję; oraz CD40LT, znany induktor dojrzewania komórek dendrytycznych. Korzystne jest, jeżeli do plazmidu włączone są kwasy nukleinowe kodujące odpornościowe białko efektorowe. Konstrukty DNA dla FAP i odpornościowego białka efektorowego można włączyć do tego samego plazmidu albo do dwóch odrębnych plazmidów. Odpowiedź CTL indukowana przeciw nowotworowym fibroblastom zrębowym może hamować wzrost rozmaitych nowotworów i nie jest swoista wobec konkretnego typu nowotworu. [002] Niniejszy wynalazek dostarcza również sposobu hamowania wzrostu nowotworu i przerzutów nowotworu u ssaka, obejmującgo podawanie ssakowi kompozycji DNA według wynalazku w ilości wystarczającej dla wzbudzenia odpowiedzi immunologicznej wobec komórek zrębowych nowotworu, które prezentują antygen FAP. [0026] Inny aspekt niniejszego wynalazku to skuteczny skojarzony schemat terapeutyczny, który obejmuje podawanie czynnika chemioterapeutycznego w skojarzeniu z kompozycją DNA według wynalazku. W wykonaniu tego sposobu według niniejszego wynalazku różne czynniki chemioterapeutyczne, takie jak doksorubicyna,

16 1 2 paklitaksel i/lub cyklofosfamid, które nie powodują supresji szpiku kostnego, kiedy podaje się w maksymalnej tolerowanej dawce (MTD), podaje się pacjentowi w skojarzeniu z kompozycją DNA według wynalazku zawierającą konstrukt DNA, który koduje FAP albo jego immunogenną część. Skojarzenie kompozycji DNA z FAP według wynalazku z takimi lekami oferuje dodatkową zaletę, którą jest obniżenie poziomu ekspresji kolagenu typu I i w konsekwencji zwiększone pobieranie do nowotworu różnych czynników chemioterapeutycznych i innych związków. Kompozycje DNA według niniejszego wynalazku prowadzą do zwiększonego pobierania przez komórki nowotworowe rozmaitych cząsteczek, obejmujących, ale bez ograniczenia, przeciwnowotworowe czynniki chemioterapeutyczne. Przykładowo, barwnik fluoresceina o niskiej masie cząsteczkowej (376 Da), związek o dużej masie cząsteczkowej albumina z błękitem Evansa (68 00 Da) i przeciwnowotworowy czynnik chemioterapeutyczny - -fluorouracyl (-FU; 1 Da), wszystkie były pobierane przez komórki nowotworowe na znacznie wyższych poziomach u myszy traktowanych kompozycją DNA według wynalazku w porównaniu z myszami traktowanymi nieaktywną kompozycją kontrolną. Skojarzenie kompozycji DNA według wynalazku plus lek przeciwnowotworowy - doksorubicyna powodował całkowite odrzucenie rosnących ortotopowo raków sutka u 0% myszy leczonych niniejszą terapią skojarzoną. Całkowite odrzucenie nowotworów nie było obserwowane u myszy traktowanych samą kompozycją DNA albo samą doksorubicyną.

17 1 2 [0027] Korzystny sposób dostarcza środków do zwiększania pobierania czynnika chemioterapeutycznego u ssaka. Sposób obejmuje podawanie ssakowi kompozycji DNA według wynalazku w ilości wystarczającej do wzbudzenia odpowiedzi immunologicznej przeciwko komórkom u ssaka, które prezentują antygen FAP, a następnie podawanie ssakowi skutecznej ilości czynnika chemioterapeutycznego. [0028] Inne korzystne wykonanie sposobu to sposób hamowania wzrostu nowotworu albo przerzutów nowotworu u ssaka, obejmujący etapy podawania ssakowi kompozycji DNA według wynalazku w ilości wystarczającej do wzbudzenia odpowiedzi immunologicznej przeciwko komórkom u ssaka, które prezentują antygen FAP, a następnie podawanie ssakowi skutecznej ilości przeciwnowotworowego czynnika chemioterapeutycznego. [0029] Korzystne jest, jeżeli ssakami leczonymi sposobami według niniejszego wynalazku są ludzie. [00] W wykonaniu sposobu według niniejszego wynalazku, kompozycje DNA można podawać dojelitowo, np. poprzez podawanie doustne, lub pozajelitowo, np. poprzez wstrzyknięcie lub wlew dożylny. Korzystne jest, jeżeli kompozycje podaje się doustnie. Kompozycje mogą być zapakowane w szczelnych pojemnikach i zaopatrzone w etykietę z informacją przydatną dla klinicysty do skutecznego podawania kompozycji. [0031] Kompozycje DNA według niniejszego wynalazku są przydatne do leczenia i profilaktyki wielu stanów chorobowych. Na przykład pacjent cierpiący na raka okrężnicy i odbytnicy, raka sutka, raka płuc i tym

18 podobnych może odnieść korzyść ze szczepienia kompozycjami według niniejszego wynalazku. 1 2 KRÓTKI OPIS RYSUNKÓW [0032] Fig. 1 to charakteryzacja konstruktu DNA dla FAP myszowatych i opornych na chemioterapię nowotworowych linii komórkowych. Panel A przedstawia plazmid z cdna kodującym całe FAP myszowatych, wstawione do miejsca EcoRI wektora pcdna3.1/v-his-topo (pfap). Panel B pokazuje ekspresję białka FAP wykazaną poprzez analizę Western po przejściowej transfekcji komórek CT26. Panel C pokazuje komórki raka okrężnicy CT26 i sutka D2F2 traktowane różnymi czynnikami chemioterapeutycznymi we wskazanych stężeniach. Po 48 godzinach inkubacji, apoptozę jądrową badano poprzez barwienie barwnikiem Hoechst-33342. Kreski wskazują średnią plus odchylenie standardowe dla 3 testów. Fig. 2a do Fig. 2c przedstawiają wpływ opartych na FAP kompozycji DNA na wzrost nowotworu. Warunki dla trybu profilaktycznego: dni po ostatnim z 3 szczepień w odstępach 1-tygodniowych, przeprowadzonych jak opisano w Materiałach i Metodach, myszy BALB/c (n=8) prowokowano poprzez podskórne (s.c., ang. subcutaneous) wstrzyknięcie letalnej dawki 3x 4 komórek CT26 (Fig. 2a) lub ortotopowo, (o.t.) z zastosowaniem letalnej dawki 3x komórek D2F2 (Fig. 2b). Przedstawiony jest średni wzrost guza nowotworowego dla 8 myszy, średnia +/- SE, P<0,01. Warunki dla trybu terapeutycznego: myszom BALB/c (n=8)

19 1 2 najpierw wstrzyknięto dożylnie (i.v., ang. intravenously) komórek CT26, a następnie traktowano po 3 i dniach po ustabilizowaniu się przerzutów płucnych. Po 18 dniach, płuca wycięto i zważono (prawidłowa masa płuc wynosiła około 0,2 g), zbadano pod kątem przerzutów i zbadano poprzez ocenę wizualną. Procent powierzchni płuc pokryty przez zlane przerzuty oceniono jak następuje: 0 = 0%, 1 = <%, 2 = -0%, 3 = >0%, P<0,01. (Fig. 2c). Fig. 3 przedstawia cytotoksyczność indukowaną przez komórki T CD8 +. (A) Przedstawiony jest wpływ na długość życia usuwania za pośrednictwem przeciwciała w czasie fazy efektorowej u traktowanych myszy (* oznacza istotność statystyczną w porównaniu z grupą kontrolną, p<0,01). (B) Komórki T CD8 + oczyszczono ze śledzion traktowanych myszy, stymulowano napromieniowanymi promieniowaniem docelowymi komórkami nowotworowymi, a następnie inkubowano przez 48 godzin z komórkami CT26 transfekowanymi pgfp lub pgfp/pfap. Apoptozę jądrową badano poprzez barwienie barwnikiem Hoechst-33342 jak następuje: Apoptoza jądrowa stadium 0: brak apoptozy; stadium 1: kondensacja chromatyny na dużą skalę; stadium 2a: fragmentacja chromatyny; stadium 2b: ciałka apoptotyczne. (C, D) Splenocyty z myszy immunizowanych pfap i pustym wektorem (n=3) stymulowano przez dni fibroblastami A31 transfekowanymi pfap, następnie poddano testowi uwalniania 1 Cr. (D) Komórki efektorowe i docelowe inkubowano jednocześnie z przeciwciałami anty-mhc klasy I (Średnia +SD, * oznacza istotność statystyczną w porównaniu z pustym wektorem, p<0,0). (E) Analiza poprzez FACS zawiesin pojedynczych komórek

1 2 z myszy traktowanych nowotworami CT26 (n=2), barwionych przeciwciałami anty-cd3 + PerCP-Cy. i anty-cd8 + FITC. Przedstawione jest jedno z dwóch doświadczeń. (F) Reprezentatywne skrawki nowotworów CT26 z myszy traktowanych pfap i pustym wektorem, barwionych przeciwciałami anty-cd8 FITC i barwnikiem jądrowym DAPI. Fig. 4 pokazuje ekspresję FAP/kolagenu typu I i donowotworowego pobierania fluoresceiny/albuminy/-fu. (A) Analiza immunohistochemiczna ekspresji FAP (górny panel) i kolagenu typu I (dolny panel) u myszy traktowanych s.c. nowotworami CT26. (B) filtry immunologiczne dla FAP i kolagenu typu I u myszy traktowanych s.c. nowotworami CT26. (C, D, E) Wykresy słupkowe wskazują średnie + SE dla pomiarów gęstości optycznej lub scyntylacji homogenatów z myszy BALB/c (n=4) traktowanych s.c. nowotworami CT26, po wstrzyknięciu i.p. fluoresceiny, wstrzyknięciu i.v. albuminy z błękitem Evansa lub wstrzyknięciu i.v. 14 C- -fluorouracylu. Odpowiednio, P<0,0, P<0,01 i P<0,0. Fig. ilustruje efekty przeciw przerzutowaniu bio- i chemioterapii skojarzonej oraz efekty uboczne. (A) Warunki dla trybu profilaktycznego: dni po ostatnim z 3 szczepień w odstępach 1-tygodniowych, szczepionką kontrolną, PBS albo szczepionką według niniejszego wynalazku, myszy BALB/c (n=8, średnia ± SE) prowokowano o.t. z zastosowaniem 3x komórek D2F2. Po, i 1 dniach, wskazane myszy traktowano doksorubicyną. (B) Warunki dla trybu terapeutycznego: dni po wstrzyknięciu i.v. komórek nowotworowych D2F2 myszy BALB/c mice (n=8) były traktowane co tydzień

21 1 2 szczepionką pfap albo szczepionką kontrolną. Jeden dzień po każdej immunizacji myszy traktowano doksorubicyną i.v. jak wskazano (* oznacza znaczącą istotność statystyczną w porównaniu z grupą kontrolną, p<0,0001, ** oznacza istotność statystyczną w porównaniu z grupą kontrolną, kontrolną/doks., pfap i pfap/doks., p<0,0001). Fig. 6 (A) Wewnątrznowotworowe stężenie doksorubicyny: Traktowane myszy BALB/c (n=4) prowokowano s.c. przy zastosowaniu x komórek D2F2 i po 16 dniach określono stężenie doksorubicyny w połączonych w pulę lizatach nowotworów poprzez LC-MS (reprezentatywne dla dwóch doświadczeń, średnia + SD. P<0,001). (B) Koliste rany o średnicy 3 mm wykonano na górnej części grzbietu traktowanych myszy (n=4) i mierzono średni czas aż do całkowitego zamknięcia się rany (średnia + SD). Fig. 7 pokazuje sekwencję nukleotydową (NR ID. SEKW.: 1) kwasu nukleinowego kodującego ludzkie FAP. Fig. 8 ilustruje sekwencję reszt aminokwasowych ludzkiego FAP (NR ID. SEKW.: 2). Fig. 9 pokazuje sekwencję nukleotydową (NR ID. SEKW.: 3) kwasu nukleinowego kodującego FAP myszowatych. Fig. pokazuje sekwencję reszt aminokwasowych FAP myszowatych (NR ID. SEKW.: 4). Fig. 11 pokazuje sekwencję nukleotydową (NR ID. SEKW.: ) kwasu nukleinowego kodującego ludzką IL-2. Fig. 12 pokazuje sekwencję reszt aminokwasowych ludzkiej IL-2 (NR ID. SEKW.: 6).

22 1 2 Fig. 13 pokazuje sekwencję nukleotydową (NR ID. SEKW.: 7) kwasu nukleinowego kodującego IL-2 myszowatych. Fig. 14 pokazuje sekwencję reszt aminokwasowych IL-2 myszowatych (NR ID. SEKW.: 8). Fig. 1 pokazuje sekwencję nukleotydową (NR ID. SEKW.: 9) kwasu nukleinowego kodującego ludzką CCL21. Fig. 16 pokazuje sekwencję reszt aminokwasowych ludzkiej CCL21 (NR ID. SEKW.: ). Fig. 17 pokazuje sekwencję nukleotydową (NR ID. SEKW.: 11) kwasu nukleinowego kodującego CCL21b myszowatych. Fig. 18 pokazuje sekwencję reszt aminokwasowych CCL21b myszowatych (NR ID. SEKW.: 12). Fig. 19 ilustruje podobieństwo sekwencji aminokwasowej między ludzką CCL21 i CCL21b myszowatych. Fig. sekwencję nukleotydową (NR ID. SEKW.: 13) kwasu nukleinowego kodującego CCL21a myszowatych. Fig. 21 pokazuje sekwencję reszt aminokwasowych CCL21a myszowatych (NR ID. SEKW.: 14). Fig. 22 pokazuje sekwencję nukleotydową (NR ID. SEKW.: 1) kwasu nukleinowego kodującego ludzki CD40L. Fig. 23 pokazuje sekwencję reszt aminokwasowych ludzkiego CD40L (NR ID. SEKW.: 16). SZCZEGÓŁOWY OPIS KORZYSTNYCH WYKONAŃ [0033] Niniejszy wynalazek dostarcza kompozycji DNA skutecznej w hamowaniu wzrostu nowotworu lub przerzutów nowotworu, której celem jest antygen zrębowy nowotworu, znany jako białko aktywujące fibroblasty (FAP).

23 1 2 Kompozycja DNA zawiera konstrukt DNA, który koduje co najmniej jeden epitop FAP, który może ulegać ekspresji w komórkach odpornościowych i który jest zawarty w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku. Konstrukt DNA może kodować pojedynczy epitop FAP, polipeptyd zawierający dwa albo więcej epitopów FAP, całe białko FAP lub jego dowolną część, która będzie wzbudzać pożądaną odpowiedź immunologiczną przeciwko komórkom, w których FAP ulega ekspresji, takim jak komórki zrębowe nowotworu. Odpowiedź immunologiczna wzbudzona przez kompozycje według wynalazku prowadzi do zahamowania wzrostu nowotworu i przerzutów nowotworu. [0034] Stosowany tu i w dołączonych zastrzeżeniach termin konstrukt DNA odnosi się do struktury DNA, która koduje białko albo polipeptyd będący przedmiotem zainteresowania, taki jak epitop FAP, białko FAP, IL-2, CCL21 i tym podobne. Konstrukt DNA obejmuje dowolny DNA, który może podlegać transkrypcji w komórkach docelowych, w tym liniowy DNA i plazmidowy DNA, jak również DNA, który został włączony do materiału genetycznego komórki albo wirusa. Korzystne jest, jeżeli konstrukt DNA, to taki DNA, który został włączony do wirusowego albo bakteryjnego wektora do dostarczania, np. wektora - atenuowanego wirusa lub bakterii, które nie są patogenne. Kiedy osobnik jest leczony kompozycją według wynalazku, DNA kodujący FAP jest dostarczany do komórek odpornościowych (np. makrofagów i komórek dendrytycznych), które następnie wytwarzają białko FAP. Wirusowe albo bakteryjne nośniki DNA dla FAP same nie wytwarzają FAP.

24 1 2 [003] Kompozycje DNA według niniejszego wynalazku stymulują tworzenie się CTL, które są aktywne przeciwko komórkom, które prezentują antygen FAP, takich jak komórki zrębowe nowotworu (np. fibroblasty zrębowe). Takie komórki zrębowe nowotworu są wybiórczym celem dla CTL, które są wytwarzanie w odpowiedzi na immunizację przez kompozycje DNA według wynalazku. Kompozycje według wynalazku mogą również zmniejszać nowotworową, zrębową ekspresję kolagenu typu I, co kolei zwiększa pobieranie czynników chemioterapeutycznych. [0036] Stosowany tu termin odporność odnosi się do długoterminowej ochrony immunologicznej przeciw komórkom wykazującym ekspresję antygenu. Termin immunizacja odnosi się do ekspozycji na antygen, która prowadzi do odporności wobec komórek wykazujących ekspresję antygenu u leczonego osobnika. [0037] Termin białko FAP odnosi się do ludzkiego FAP lub polipeptydu, który ma co najmniej 80% identyczności sekwencji z ludzkim FAP i który zawiera co najmniej jeden epitop ludzkiego FAP. Termin DNA dla FAP odnosi się do DNA kodującego ludzkie FAP lub kodującego polipeptydy, które mają co najmniej 80% identyczności sekwencji z ludzkim FAP i które zawierają co najmniej jeden epitop ludzkiego FAP. [0038] Korzystne jest, jeżeli konstrukt DNA przydatny w kompozycjach DNA według niniejszego wynalazku zawiera kwas nukleinowy, który koduje polipeptyd zawierający jeden albo więcej epitopów FAP, i który jest przyłączony w sposób umożliwiający działanie do elementów regulatorowych potrzebnych do ekspresji genu w komórkach odpornościowych. Korzystne jest, jeżeli

2 1 2 konstrukt DNA koduje białko FAP pełnej długości albo polipeptyd mający wysoki stopień podobieństwa sekwencji do niego, wynoszący co najmniej 80% i który zawiera co najmniej jeden epitop FAP. Przydatne konstrukty DNA korzystnie zawierają elementy regulatorowe niezbędne do ekspresji nukleotydów w komórkach odpornościowych. Takie elementy obejmują na przykład promotor, kodon inicjacyjny, kodon stop i sygnał poliadenylacji. Dodatkowo, do ekspresji sekwencji, która koduje immunogenne docelowe białko, często wymagane są wzmacniacze. Jak wiadomo w tej dziedzinie, korzystne jest, jeżeli te elementy są przyłączone w sposób umożliwiający działanie do sekwencji, która koduje pożądane białko. Korzystne jest, jeżeli elementy regulatorowe są wybrane tak, aby mogły działać w gatunku, któremu mają być podawane. Korzystne jest, jeżeli konstrukt DNA jest w postaci plazmidu albo jest włączony do wektora wirusowego albo bakteryjnego. Konstrukt DNA kodujący białko FAP wyjściowo może być włączony do wektora bakteryjnego poprzez transfekcję, przy zastosowaniu metod dobrze znanych w tej dziedzinie. Następnie transformowane bakterie można hodować w celu dostarczenia gotowych hodowli wyjściowych, które zawierają DNA dla FAP w obrębie materiału genetycznego bakterii. Hodowle takich transformowanych bakterii dostarczają gotowego źródła kompozycji DNA według niniejszego wynalazku. [0039] Korzystne jest, jeżeli kodony inicjujące i kodony stop są zawarte jako część sekwencji nukleotydowej, która koduje FAP w kompozycji DNA według

26 1 2 niniejszego wynalazku. Kodony inicjujące i terminacyjne muszą być w ramce z sekwencją kodującą. [0040] Korzystne jest, jeżeli promotory i sygnały poliadenylacji zawarte w kompozycji według niniejszego wynalazku są wybrane tak, aby działały w komórkach osobnika, który ma być immunizowany. [0041] Przykłady promotorów przydatnych w kompozycjach według niniejszego wynalazku, a w szczególności przy wytwarzaniu genetycznych szczepionkowych kompozycji DNA dla ludzi obejmują, ale bez ograniczenia, promotor z małpiego wirusa 40 (SV40), promotor z mysiego wirusa raka sutka (MMTV)), promotor z ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV) taki jak promotor z długich końcowych powtórzeń (LTR) HIV, wirusa Moloneya, cytomegalowirusa (CMV), taki jak natychmiastowy wczesny promotor CMV, wirusa Epsteina Barra (EBV), wirusa mięsaka Rousa (RSV), jak również promotory z genów ludzkich, takich jak ludzkiej aktyny, ludzkiej miozyny, ludzkiej hemoglobiny, ludzkiej mięśniowej kreatyny i ludzkiej metalotioneiny. [0042] Przykłady sygnałów poliadenylacji przydatnych w kompozycjach DNA według niniejszego wynalazku, a w szczególności przy wytwarzaniu kompozycji DNA dla ludzi obejmują, ale bez ograniczenia, sygnały poliadenylacji z SV40 i sygnały poliadenylacji z LTR. [0043] Poza elementami regulatorowymi wymaganymi do ekspresji DNA, w cząsteczce DNA mogą być zawarte również inne elementy. Takie dodatkowe elementy obejmują wzmacniacze. Wzmacniaczem może być wzmacniacz dla ludzkiej aktyny, ludzkiej miozyny, ludzkiej

27 1 2 hemoglobiny, ludzkiej mięśniowej kreatyny oraz wzmacniacze wirusowe, takie jak te z CMV, RSV i EBV. [0044] Sekwencje regulatorowe i kodony są generalnie zależne od gatunku, a zatem w celu zmaksymalizowania wytwarzania białka, korzystne jest, jeżeli sekwencje regulatorowe i kodony są wybrane tak, aby były skuteczne w gatunkach, które mają być immunizowane. Specjalista w tej dziedzinie może wytworzyć konstrukty DNA, które działają w danym gatunku. [004] Konstrukty DNA przydatne w niniejszych kompozycjach mogą być nagim DNA, jak zdefiniowano w Restifo i wsp. Gene Therapy 00; 7:89-92, którego odpowiednie ujawnienie jest tu włączone jako odniesienie. Korzystne jest, jeżeli konstrukt DNA jest w postaci plazmidu albo DNA włączonego do materiału genetycznego atenuowanego wirusa albo atenuowanej bakterii. Przydatne przenośniki lub nośniki do dostarczania obejmują biodegradowalne mikrokapsułki, kompleksy immunostymulujące, (ISCOM, ang. immunostimulating complexes) i liposomy do nagich konstruktów DNA oraz rozmaite fizjologicznie dopuszczalne bufory do poddanych zabiegom inżynierii genetycznej atenuowanych żywych wirusów lub bakterii. [0046] Przykłady odpowiednich atenuowanych żywych wektorów bakteryjnych, które można transformować w celu zawarcia w nich konstruktu DNA dla FAP obejmują Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, gatunki Shigella, gatunki Bacillus, gatunki Lactobacillus, Bacille Calmette-Guerin (BCG), Escherichia coli, Vibrio cholerae, gatunki Campylobacter, gatunki Listeria lub dowolny inny odpowiedni wektor bakteryjny, jak to jest

28 1 2 znane w tej dziedzinie. Korzystne jest, jeżeli wektorem jest atenuowany żywy wektor - Salmonella typhimurium, w szczególności wówczas, kiedy kompozycja jest przeznaczona do podawania doustnego. Korzystna atenuowana żywa Salmonella typhimurium obejmuje szczepy AroA takie jak SL77, lub podwójnie atenuowane szczepy AroA -, dam, takie jak RE88. Szczególnie korzystnym wektorem jest podwójnie atenuowana Salmonella typhimurium AroA -, dam -. [0047] Sposoby transformowania żywych wektorów bakteryjnych egzogennymi konstruktami DNA są dobrze opisane w tej dziedzinie. Patrz na przykład, Joseph Sambrook i David W. Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, wydanie 3., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (01) (Sambrook and Russell). Po transformacji, egzogenny materiał genetyczny jest włączany do materiału genetycznego bakterii, tak, że kiedy bakteria rozmnaża się, egzogenny DNA ulega replikacji razem z natywnym DNA organizmu. A zatem, kiedy bakteria zostanie transformowana, normalne procesy reprodukcji organizmu dostarczają gotowego źródła egzogennego DNA. [0048] Korzystne wektory wirusowe obejmują bakteriofagi, wirusa opryszczki, adenowirusa, wirusa adeno-satelitarnego, wirusa Sindbis, wirusa Polio, wirusa krowianki i wirusa ospy drobiu. Sposoby transformowania wektora wirusowego egzogennym konstruktem DNA są również dobrze opisane w tej dziedzinie. Patrz, Sambrook i Russell, jak wyżej. [0049] Przydatne przenośniki nośniki liposomowe są jednowarstwowymi albo wielowarstwowymi pęcherzykami,

29 1 2 mającymi część błonową utworzoną z materiału lipofilowego i wewnętrzną część wodną. Część wodna jest stosowana w niniejszym wynalazku, aby zawrzeć w niej materiał polinukleotydowy, który ma być dostarczony do komórki docelowej. Generalnie korzystne jest, aby materiały tworzące liposomy miały grupę kationową, taką jak czwartorzędowa grupa amonowa i jedną albo więcej grup lipofilowych, takich jak nasycone albo nienasycone grupy alkilowe mające około 6 do około atomów węgla. Jedna z grup odpowiednich materiałów jest opisana w europejskiej publikacji patentowej nr 0187702 i dalej dyskutowana w patencie USA nr 6,228,844 dla Wolff i wsp., których odpowiednie ujawnienia są tu włączone jako odniesienie. Wiele innych odpowiednich lipidowych związków kationowych tworzących liposomy jest opisanych w piśmiennictwie. Patrz, np., L. Stamatatos i wsp., Biochemistry 1988; 27:3917-392; oraz H. Eibl i wsp., Biophysical Chemistry 1979; :261-271. Alternatywnie, można zastosować mikrokulki, takie jak biodegradowalne mikrokulki polilaktydo-koglikolidowe. Konstrukt kwasu nukleinowego jest zamykany wewnątrz lub w inny sposób skompleksowany z liposomem albo mikrokulką w celu dostarczenia kwasu nukleinowego do tkanki, co jest znane w tej dziedzinie. [000] Inne przydatne nośniki obejmują mikrokulki polimerowe zawierające biodegradowalne materiały poli(orto estrowe), jak opisano w Wang i wsp., Nat. Mater., 04; 3(3):190-6. Epub 04 Luty 1, czego odpowiednie ujawnienia są tu włączone jako odniesienie. [001] Korzystne jest, jeżeli kompozycje dla niniejszego wynalazku zawierają konstrukty DNA, które

1 2 kodują ludzkie FAP albo jego działający homolog. Korzystne jest, jeżeli działające homologi FAP mają co najmniej około 80% podobieństwa sekwencji reszt aminokwasowych do ludzkiego FAP, korzystniej, co najmniej 90%, najkorzystniej co najmniej około 9% podobieństwa sekwencji do ludzkiego FAP. [002] GenBank to baza danych dla sekwencji genetycznych w Narodowych Instytutach Zdrowia (ang. National Institutes of Health (NIH)), która jest zaopatrzoną w komentarze kolekcją wszystkich dostępnych publicznie sekwencji DNA. GenBank jest częścią międzynarodowej współpracy dotyczącej baz danych dla sekwencji nukleotydowych (International Nucleotide Sequence Database Collaboration), wspólnego przedsięwzięcia DNA DataBank of Japan (DDBJ), European Molecular Biology Laboratory (EMBL) i GenBank w National Center for Biotechnology Information. [003] Sekwencja kwasu nukleinowego cdna kodującego ludzkie FAP, NR ID. SEKW.: 1 (Fig. 7), została opublikowana w GenBank, nr dostępu BC026, czego odpowiednie ujawnienie jest tu włączone jako odniesienie. Odpowiednia sekwencja reszt aminokwasowych ludzkiego FAP to NR ID. SEKW.: 2 (Fig. 8). [004] Sekwencja kwasu nukleinowego DNA kodującego FAP myszowatych, NR ID. SEKW.: 3 (Fig. 9), została opublikowana w GenBank, nr dostępu BC019190, czego odpowiednie ujawnienie jest tu włączone jako odniesienie. Odpowiednia sekwencja reszt aminokwasowych FAP myszowatych to NR ID. SEKW.: 4 (Fig. ). [00] Na skutek istniejącej degeneracji kodu genetycznego przy wykonywaniu wynalazku można

31 1 2 zastosować inne sekwencje DNA, które kodują sekwencję aminokwasową ludzkiego FAP. Takie sekwencje DNA obejmują również te, które są zdolne do hybrydyzowania z ludzkim FAP. [006] Sekwencje DNA, które kodują ludzkie FAP, które można stosować zgodnie z wynalazkiem, obejmują kwasy nukleinowe mające delecje, addycje lub podstawienia różnych reszt aminokwasowych na te z NR ID. SEKW.: 1, czego rezultatem jest sekwencja, która koduje taki sam produkt genu FAP. Cząsteczki DNA kodujące równoważne czynnościowo homologi ludzkiego FAP można również zastosować w kompozycjach DNA według niniejszego wynalazku. [007] Produkt genowy kodowany przez kwas nukleinowy może również zawierać delecje, addycje lub podstawienia reszt aminokwasowych w obrębie sekwencji reszt aminokwasowych FAP, czego rezultatem jest cicha zmiana, z uzyskaniem zatem działającego równoważnika FAP. Takie podstawienia aminokwasowe mogą być dokonane na podstawie podobieństwa polarności, ładunku, rozpuszczalności, hydrofobowości, hydrofilowości i/lub natury amfipatycznej uczestniczących w tym reszt. Na przykład, aminokwasy naładowane ujemnie obejmują kwas asparaginowy i kwas glutaminowy; aminokwasy naładowane dodatnio obejmują lizynę i argininę; aminokwasy z polarnymi grupami główek bez ładunku, mające podobne wartości hydrofilowości, obejmują następujące: leucynę, izoleucynę, walinę; glicynę, alaninę; asparaginę, glutaminę; serynę, treoninę; fenyloalaninę, tyrozynę. Tak jak się to tu stosuje, działający równoważnik FAP odnosi się białka, które zawiera jeden albo większą

32 1 2 liczbę epitopów, które, kiedy są rozpoznawane przez komórki T, umożliwiają tym samym komórkom T rozpoznawanie epitopów FAP prezentowanych na komórkach z ekspresją FAP. W korzystnych wykonaniach, działający równoważnik FAP ma sekwencję reszt aminokwasowych, która ma co najmniej około 80% podobieństwa sekwencji do sekwencji reszt aminokwasowych ludzkiego FAP (NR ID. SEKW.: 2), np., co najmniej około 90% podobieństwa sekwencji lub co najmniej około 9% podobieństwa sekwencji z ludzkim FAP. [008] Konstrukty DNA kodujące FAP można poddać modyfikacjom, zmienić sekwencję kodującą FAP (względem cdna dla natywnego FAP, NR ID. SEKW.: 1) w rozmaitych celach, obejmujących, ale bez ograniczenia, zmiany, które modyfikują obróbkę i ekspresję produktu genowego FAP. Na przykład można wprowadzić mutacje w DNA, stosując techniki, które są dobrze znane w tej dziedzinie, np. ukierunkowaną mutagenezę, w celu wstawienia nowych miejsc restrykcyjnych, aby zmienić wzory glikozylacji, fosforylacji, itd. [009] W jednym z korzystnych wykonań, kompozycja DNA według wynalazku zawiera konstrukt DNA kodujący FAP i konstrukt DNA kodujący, w sposób umożliwiający działanie, co najmniej jedno białko efektorowe, przy czym obydwa białka mogą podlegać ekspresji w komórkach odpornościowych. Stosowane tu i w dołączonych zastrzeżeniach wyrażenie odpornościowe białko efektorowe oznacza białko, które uczestniczy w regulacji szlaku układu immunologicznego. Korzystne jest, jeżeli odpornościowym białkiem efektorowym jest cytokina.

33 1 2 [0060] Cytokiny to wytwarzane przez komórki białka i polipeptydy, które mogą wpływać na zachowania innych komórek, takie jak proliferacja komórek, różnicowanie komórek, regulacja odpowiedzi immunologicznych, hematopoeza i odpowiedzi zapalne. Cytokiny zostały sklasyfikowane do kilku rodzin, obejmujących chemokiny, hematopoetyny, immunoglobuliny, czynniki martwicy nowotworów i rozmaite niesklasyfikowane cząsteczki. Patrz ogólnie, Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Wydanie poprawione, Oxford University Press, 00; oraz C. A. Janeway, P. Travers, M. Walport and M. Schlomchik, Immunobiology, wydanie piąte, Garland Publishing, 01 (tu dalej Janeway i Travers ). Zwięzła klasyfikacja cytokin jest przedstawiona w Janeway i Travers, Dodatek III, strony 677-679, której odpowiednie ujawnienia są tu włączone jako odniesienie. [0061] Hematopoetyny obejmują na przykład erytropoetynę, interleukinę-2 (IL-2, 133-aminokwasowe białko wytwarzane przez komórki T i uczestniczące w proliferacji komórek T), IL-3, IL-4, IL-, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-13, IL-1 (114-aminokwasowe białko IL- 2-podobne, które stymuluje wzrost śródbłonka jelitowego, komórek T i komórek NK), czynnik stymulujący kolonie granulocytów (G-CSF, ang. granulocyte colony-stimulating factor), czynnik stymulujący kolonie granulocytów i makrofagów (GM-CSF, ang. granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), onkostatyna M (OSM) i białaczkowy czynnik inhibitorowy (LIF, ang. leukemia inhibitory factor).

34 [0062] Interferony obejmują, na przykład, IFN-α, IFN-β 1 2 i IFN- (143-aminokwasowe homodimeryczne białko wytwarzane przez komórki T i komórki NK, które uczestniczy w aktywacji makrofagów, zwiększonej ekspresji cząsteczek MHC i składników obróbki antygenu, zmianie klas IG i supresji T H 2). [0063] Immunoglobuliny obejmują, na przykład, B7.1 (CD80) i B7.2 (CD86), które obydwie kostymulują odpowiedzi komórek T. [0064] Rodzina czynnika martwicy nowotworów (TNF, ang. tumor necrosis factor) obejmuje, na przykład, TNF-α, TNF-β (limfotoksynę), limfotoksynę-β (LT-β), ligandy CD40, ligand Fas, ligand CD27, ligand CD, ligand 4-1BB, Trail oraz ligand OPG. [006] Role biologiczne liganda CD40 (CD40L), a w szczególności jego oddziaływanie z CD40 ulegającym ekspresji na komórkach prezentujących antygen podczas kostymulacji przy aktywacji komórek T, są dobrze znane w tej dziedzinie. CD40 to glikoproteina o masie 48 kda ulegająca ekspresji na powierzchni wszystkich dojrzałych komórek B, w większości złośliwych nowotworów z dojrzałych komórek B i niektórych wczesnych stadiach ostrych białaczek limfocytowych z udziałem komórek B, ale nie ulega ekspresji na komórkach plazmatycznych, Clark, Tissue Antigens 1990, 3:33-36. CD40L, białko błonowe typu II o wielkości około 3 kda, ulega ekspresji na powierzchni komórek T po rozpoznaniu antygenu. Przedstawiciele rodziny TNF są najbardziej aktywni biologicznie przy ekspresji jako homotrimery. CD40L nie jest wyjątkiem pod tym względem i może ulegać ekspresji jako homotrimer (CD40LT)

3 1 2 poprzez modyfikację 33-aminokwasowego motywu suwaka leucynowego połączonego z końcem N całej domeny zewnątrzkomórkowej tego liganda. Według doniesień Gurunathan i wsp., J. Immunol. 1998, 161:463, DNA dla CD40LT zwiększa odpowiedzi immunologiczne, takie jak indukcja IFN- i aktywność cytolityczna komórek T, kiedy myszy były traktowane DNA kodującym wysoko immunogenny modelowy antygen β-galaktozydazy. [0066] CD40LT jest ważnym czynnikiem aktywacji komórek T niezbędnym do indukcji skutecznej odporności ochronnej przeciwko własnym antygenom nowotworowym. Kiedy naładowane antygenem kompleksy MHC klasy I są pobierane przez komórki dendrytyczne (DC, ang. dendritic cells) i prezentowane naiwnym komórkom T, pierwszy sygnał antygenowy jest dostarczany poprzez receptory komórek T (TCR, ang. T cell receptors), a następnie podnoszony jest poziom CD40LT. Na powierzchni komórek T, CD40LT indukuje następnie aktywność kostymulującą wobec DC poprzez oddziaływania CD40- CD40LT. Po stymulacji, te APC mogą następnie wytwarzać kostymulujące cząsteczki B7.1 (CD80) i B7.2 (CD86), które przekazują drugi sygnał kostymulujący do komórek T poprzez oddziaływanie z CD28, co jest zdarzeniem, które prowadzi do pełnej aktywacji komórek T w celu jednoczesnego wytwarzania cytokin prozapalnych, INF- i IL12, i pełnienia funkcji efektorowych. [0067] Różne cytokiny, które nie są przypisane do konkretnej rodziny, obejmują, na przykład, czynnik wzrostu nowotworów β (TGF-β, ang. tumor growth factorβ), IL-1α, IL-1β, IL-1 RA, IL-, IL-12 (czynnik stymulujący komórki naturalnych zabójców; heterodimer

36 1 2 mający łańcuch 197-aminokwasowy i łańcuch 6- aminokwasowy, który uczestniczy w aktywacji komórek NK oraz indukcji różnicowania komórek T do komórek T H 1- podobnych), makrofagowy czynnik inhibitorowy (MIF, ang. macrophage inhibitory factor), IL-16, IL-17 (czynnik indukujący wytwarzanie cytokin, który indukuje wytwarzanie cytokin w nabłonkach, śródbłonkach i fibroblastach) oraz IL-18. [0068] Chemokiny to rodzina cytokin, które są stosunkowo małymi białkami i polipeptydami chemotaktycznymi, które stymulują migrację i aktywację różnych komórek, na przykład migrację leukocytów (np. fagocytów i limfocytów). Chemokiny odgrywają rolę w zapaleniu i innych odpowiedziach immunologicznych. Chemokiny zostały sklasyfikowane do wielu rodzin, obejmujących chemokiny C, chemokiny CC, chemokiny CXC, i chemokiny CX 3 C. Nazwy odnoszą się do liczby i odstępu między resztami cysteinowymi (C) w cząsteczkach; chemokiny C mają jedną cysteinę, chemokiny CC mają dwie następujące po sobie cysteiny, CXC mają dwie cysteiny oddzielone jedną resztą aminokwasową, a chemokiny CX 3 C mają dwie cysteiny oddzielone trzema resztami aminokwasowymi. Chemokiny oddziałują z wieloma receptorami chemokin obecnymi na powierzchniach komórek. Patrz Janeway i Travers, Dodatek IV, strona 680, co jest tu włączone jako odniesienie. [0069] Dodatkowo, chemokiny mogą mieć aktywność immunomodulującą i postuluje się ich udział w odpowiedzi immunologicznej wobec nowotworu. Przykładowo, istnieją doniesienia, że 6Ckina/SLC myszowatych, mysi analog ludzkiej chemokiny

37 1 2 drugorzędowej tkanki limfoidalnej (SLC, ang. secondary lymphoid tissue chemokine), obecnie powszechnie nazywana CCL21, indukuje odpowiedź przeciwnowotworową w nowotworowej linii komórkowej raka okrężnicy C26. Patrz Vicari i wsp. J. Immunol. 00; 16(4):1992-00. Ludzka CCL21 i jej odpowiednik u myszowatych, 6Ckina/SLC, są sklasyfikowane jako chemokiny CC, które oddziałują z receptorem chemokiny CCR7. Vicari i wsp. donieśli również, że 6Ckina/SLC myszowatych (muccl21) jest ligandem dla receptora chemokiny CXCR3. Ludzka CCL21, muccl21 myszowatych i różne inne hemokiny są zaangażowane w regulację różnych komórek układu immunologicznego, takich jak komórki dendrytyczne, komórki T i komórki naturalnych zabójców (NK, ang. natural killer). [0070] Mig i IP- to chemokiny CXC, które oddziałują z receptorem CXCR3, który jest związany z aktywowanymi komórkami T. Limfotaktyna jest chemokiną C, która oddziałuje z receptorem XCR1 związanym z komórkami T i komórkami NK. Fraktalkina to chemokina CX 3 C, która oddziałuje z receptorem CX 3 CR1, który jest związany z komórkami T, monocytami i neutrofilami. [0071] Szczególnie korzystne odpornościowe białka efektorowe, które mogą być kodowane przez kompozycje DNA według niniejszego wynalazku obejmują cytokiny IL-2 (hematopoetyna), CCL21 (chemokina), jak również ligandy CD40, takie jak trimer liganda CD40 (CD40LT), cytokina z rodziny TNF. [0072] Sekwencje DNA i białkowe dla ludzkiej IL-2 zostały opublikowane w GenBank, nr dostępu BC070338, czego ujawnienia są tu włączone jako odniesienie.

38 1 2 Sekwencje DNA i białkowe dla IL-2 myszowatych zostały opublikowane w GenBank, nr dostępu NM 008366, czego ujawnienia są tu włączone jako odniesienie. [0073] Sekwencja kwasu nukleinowego kodująca ludzką IL-2 jest przedstawiona na Fig. 11 (NR ID. SEKW.: ), a odpowiadająca jej sekwencja reszt aminokwasowych (NR ID. SEKW.: 6) jest przedstawiona na Fig. 12. Sekwencja kwasu nukleinowego kodująca IL-2 myszowatych jest przedstawiona na Fig. 13 (NR ID. SEKW.: 7), a odpowiadająca jej sekwencja reszt aminokwasowych (NR ID. SEKW.: 8) jest przedstawiona na Fig. 14. [0074] Sekwencje DNA i białkowe dla ludzkiej CCL21 zostały opublikowane w GenBank, nr dostępu AB002409, czego ujawnienia są tu włączone jako odniesienie. Sekwencje DNA i białkowe wariantu a CCL21 myszowatych zostały opublikowane w GenBank, nr dostępu NM01133, czego ujawnienia są tu włączone jako odniesienie. Sekwencje DNA i białkowe wariantu b CCL21 myszowatych zostały opublikowane w GenBank, nr dostępu NM011124, czego ujawnienia są tu włączone jako odniesienie. [007] Sekwencja kwasu nukleinowego kodująca ludzką CCL21 jest przedstawiona na Fig. 1 (NR ID. SEKW.: 9), a odpowiadająca jej sekwencja reszt aminokwasowych (NR ID. SEKW.: ) jest dostarczona na Fig. 16. Sekwencja kwasu nukleinowego kodująca CCL21 myszowatych (wariant CCL21b) jest przedstawiona na Fig. 17 (NR ID. SEKW.: 11), a odpowiadająca jej sekwencja reszt aminokwasowych (NR ID. SEKW.: 12) jest dostarczona na Fig. 18. [0076] Podobieństwo sekwencji białkowej między ludzką CCL21 i jej odpowiednikiem myszowatych (CCL21b myszowatych) jest przedstawiona na Fig. 19. Jest około

39 1 2 73% identyczności sekwencji reszt aminokwasowych między ludzką CCL21 (NR ID. SEKW.: ) i CCL21b myszowatych (NR ID. SEKW.: 12). [0077] Sekwencja kwasu nukleinowego kodująca wariant CCL21a CCL21 myszowatych jest przedstawiona na Fig. (NR ID. SEKW.: 13), a odpowiadająca jej sekwencja reszt aminokwasowych (NR ID. SEKW.: 14) jest przedstawiona na Fig. 21. [0078] Ludzki ligand CD40 (CD40L) to 261-aminokwasowe białko, które występuje w swojej najbardziej aktywnej postaci jako trimer (CD40LT). Sekwencja DNA kodująca ludzką CD40L (znaną również jako CD14) została opublikowana w GenBank, nr dostępu NM 000074, czego ujawnienie jest tu włączone jako odniesienie (Fig. 22, NR ID. SEKW.: 1). Odpowiadająca jej sekwencja białkowa CD40L jest pokazana na Fig. 23 (NR ID. SEKW.: 16). [0079] Aspekty sposobów według niniejszego wynalazku obejmują podawanie ssakowi kompozycji DNA zawierającej konstrukt DNA kodujący FAP, który może ulegać ekspresji w komórkach odpornościowych ssaka. Korzystne jest, jeżeli tym ssakiem jest człowiek. Kompozycje można podawać doustnie, domięśniowo, donosowo, dootrzewnowo, podskórnie, doskórnie lub miejscowo, w zależności od konkretnej postaci dawkowania, w której kompozycja jest przygotowana. Korzystne jest, jeżeli kompozycja jest przygotowana do podawania doustnego, na przykład jako roztwór, zawiesina, emulsja, kapsułka, tabletka i tym podobne. [0080] Kompozycję DNA według wynalazku można wykorzystywać do zapewnienia długoterminowego hamowania wzrostu nowotworu i/lub przerzutów nowotworu u pacjenta

40 1 2 leczonego kompozycją. W korzystnym wykonaniu, kompozycję DNA podaje się w skojarzeniu z przeciwnowotworowym czynnikiem chemioterapeutycznym. Kompozycję DNA można podawać razem z czynnikiem chemioterapeutycznym w skojarzonej postaci dawkowania albo kompozycję i czynnik chemioterapeutyczny można podać w oddzielnych postaciach dawkowania i w odmiennych odstępach między dawkami dostosowując się do farmakologii czynnika chemioterapeutycznego, który ma być podawany. [0081] Czynniki chemioterapeutyczne przydatne w skojarzeniu z kompozycjami DNA według niniejszego wynalazku obejmują czynniki przeciwnowotworowe, takie jak doksorubicyna, paklitaksol, cyklofosfamid, etopozyd, -fluorouracyl, metotreksat i tym podobne. [0082] Korzystne jest, jeżeli kompozycje DNA według niniejszego wynalazku są preparowane z dopuszczalnymi farmaceutycznie nośnikami lub zaróbkami, takimi jak woda, sól fizjologiczna, dekstroza, glicerol i tym podobne oraz ich kombinacje, aby pomóc w preparowaniu i podawaniu kompozycji. Kompozycje mogą również zawierać substancje wspomagające, takie jak czynniki zwilżające, czynniki emulgujące, bufory, i inne substancje pomocnicze, które są dobrze znane w dziedzinie farmacji. [0083] Korzystne jest, jeżeli kompozycje według niniejszego wynalazku podaje się doustnie ssakowi, takiemu jak człowiek, jako roztwór albo zawiesina w dopuszczalnym farmaceutycznie nośniku przy stężeniu DNA w zakresie od około 1 do około mikrogramów na mililitr, opierając się na masie DNA, który koduje FAP.

41 1 2 Szczególnie korzystną postacią dawkowania dla kompozycji według wynalazku jest zawiesina atenuowanych bakterii transfekowanych FAP w odpowiednim roztworze buforowym, którą można preparować do podawania doustnego. Odpowiednie dawkowanie kompozycji będzie zależało od osobnika, który ma być leczony, aktywności kompozycji, a częściowo od oceny lekarza podającego albo zapisującego kompozycję. [0084] Dawkowanie, które ma być podawane ssakowi i tryb podawania, jeśli będzie stosowane więcej niż jedno podanie, będzie różnić się od ssaka do ssaka i w zależności od postaci dawkowania. Skuteczne wielkości dawek i schematy podawania można określić empirycznie poprzez badania kliniczne dawka-odpowiedź, jak jest dobrze znane w tej dziedzinie. Dawkowanie i schemat dawkowania wybiera się tak, aby dostarczyć dostateczny poziom ekspresji FAP w komórkach odpornościowych dla wzbudzenia odpowiedzi immunologicznej u ssaka przeciwko komórkom, które prezentują antygen FAP. Korzystne jest, jeżeli dawkowanie kompozycji podawanej osobnikowi ssakowi wzbudza ekspresję dostatecznej ilości antygenu FAP w komórkach odpornościowych ssaka do podtrzymania odpowiedzi immunologicznej przeciwko komórkom prezentującym antygen FAP, która będzie trwać przez okres co najmniej jednego miesiąca, np. co najmniej 6 miesięcy albo co najmniej jednego roku. [008] Kompozycje według niniejszego wynalazku mogą być zapakowane w odpowiednio wyjałowionych pojemnikach, takich jak ampułki, butelki lub fiolki, bądź w postaci wielodawkowej, bądź jednodawkowej. Korzystne jest, jeżeli pojemniki są hermetycznie zamknięte po

42 1 wypełnieniu kompozycją DNA według wynalazku. Korzystne jest, jeżeli kompozycje są zapakowane w pojemniku mającym przytwierdzoną etykietę, która to etykieta podaje dane o kompozycji, zawiera informację w formie zalecanej przez agencję rządową, taką jak United States Food and Drug Administration oznaczającą zatwierdzenie kompozycji przy stosowaniu się do odpowiednich przepisów prawnych, informację o dawkowaniu i tym podobne. Korzystne jest, jeżeli etykieta zawiera informację o kompozycji, która jest przydatna dla profesjonalnego przedstawiciela opieki medycznej podającego kompozycje pacjentowi. Korzystne jest także, jeżeli opakowanie zawiera drukowane materiały informacyjne związane z podawaniem kompozycji, instrukcjami, wskazaniami i innymi niezbędnymi ostrzeżeniami. [0086] Następujące przykłady są dostarczone w celu dalszego zilustrowania właściwości i wykonań niniejszego wynalazku i nie mają oznaczać jego ograniczania. Materiały, metody i przykłady. 2 [0087] Zwierzęta, szczepy bakteryjne i linie komórkowe. Samice myszy BALB/c w wieku 6-8 tygodni otrzymano z Scripps Research Institute (TSRI) Rodent Breeding Facility. Wszystkie doświadczenia ze zwierzętami przeprowadzono zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki i stosowania zwierząt laboratoryjnych (Guide for the Care and Use of Laboratory Animals) National Institutes of Health i

43 1 2 były zatwierdzone przez Komitet opieki nad zwierzętami (TSRI Animal Care Committee). Podwójnie atenuowany szczep Salmonella typhimurium RE88 (AroA - dam - ) był dostarczony przez Remedyne Corporation (Santa Barbara, Kalifornia). Komórki raka sutka D2F2 myszowatych otrzymano od dr Wei-Zen Wei, Karmanos Cancer Center, Detroit, MI, a komórki raka okrężnicy CT26 otrzymano z ATCC (Manassas, Virginia), a następnie hodowano przez kilka miesięcy w celu otrzymania subklonów opornych na chemioterapeutyki. [0088] Mysie komórki nowotworowe CT26 i D2F2 hodowano w obecności bądź 1% DMSO, etopozydu, -fluorouracylu, doksorubicyny, winblastyny lub paklitakselu (Sigma, St. Louis, Missouri) we wskazanych stężeniach. Po 48 godzinach, apoptotyczne jądra liczono po inkubacji ze swoistym wobec DNA barwnikiem Hoechst-33342 (2 µm; Molecular Probes, Eugene, Oregon). [0089] Dwa klony, odpowiednio, komórek raka okrężnicy CT26 i komórek raka sutka D2F2, nabyły oporność na chemioterapeutyki (patrz Fig. 1, Panel C). Po dodaniu pięciu różnych indukujących apoptozę czynników chemioterapeutycznych do klonu komórek raka okrężnicy CT26 (Fig. 1, Panel C), jedynie winblastyna była zdolna do indukowania niewielkiego efektu apoptotycznego, jednakże tylko przy bardzo wysokim stężeniu wynoszącym µm. Wyjściowa rodzicielska linia komórkowa CT26 (ATCC # CLR-2326) miała IC 0 dla -fluorouracylu (-FU) wynoszącą około 1,8 µm, natomiast -FU nie był zdolny do indukowania apoptozy jądrowej nawet w stężeniu tak wysokim jak 0 µm w opornym klonie CT26. W opornych komórkach raka sutka D2F2, jedynie doksorubicyna w

44 najwyższym stężeniu 1 µm była zdolna do indukowania jądrowej apoptozy, co określono poprzez barwienie barwnikiem Hoechst-33342. Te wyniki pokazują, że obydwie te nowotworowe linie komórkowe są oporne na wiele leków. [0090] Analiza statystyczna. Istotność statystyczną różnych obserwacji między grupami eksperymentalnymi i kontrolami określono przy zastosowaniu testu t Studenta. Istotność wyników dla przerzutów określono przy zastosowaniu testu U Mann Whitney. Istotność danych dla przeżywalności określono przy zastosowaniu testu log-rank. Obserwacje uznawano za istotne, jeżeli wartości P były <0,0. 1 Przykład 1. Wytwarzanie kompozycji DNA 1 kodującej FAP myszowatych. 2 [0091] cdna (NR ID. SEKW.: 3, Fig. 9; dostarczony przez dr J. D. Cheng) kodujący FAP myszowatych (NR ID. SEKW.: 4, Fig. ), subklonowano do miejsca restrykcyjnego EcoRI wektora pcdna3.1/v-his-topo (Invitrogen, San Diego, California) w celu uzyskania eukariotycznego wektora ekspresyjnego pcdna3.1-fap (pfap) (patrz Fig. 1, Panel A). Prawidłową ekspresję białka FAP o wielkości 9 kda z wektora wykazano poprzez analizę Western lizatów komórkowych z przejściowo transfekowanych komórek nowotworowych raka okrężnicy CT26, które same nie wykazują ekspresji FAP (Fig. 1, Panel B). Było tak też w przypadku przejściowo transfekowanych komórek nowotworowych raka sutka D2F2. Dla przejściowych transfekcji, komórki CT26 i D2F2 były

4 1 2 poddane elektroporacji, jak opisano uprzednio (patrz Loeffer i wsp., FASEB, J. 01, 1: 78-767, włączone tu jako odniesienie). Ekspresję białka FAP wykazano poprzez analizę Western z zastosowaniem poliklonalnego króliczego przeciwciała anty-fap myszowatych (dostarczonego przez dr J. D. Cheng). [0092] Kompozycję DNA 1 przygotowano jak następuje: wektor pcdna3.1-fap (około 2 µg pdna) poddano elektroporacji do świeżo przygotowanej podwójnie atenuowanej Salmonella typhimurium (szczep RE88) przy zastosowaniu elektroporatora Bio-Rad Pulser przy 2 kv, 960 µf i 0 Omów, zgodnie z procedurami rekomendowanymi przez producenta. Atenuowaną Salmonella typhimurium zawierającą wektor selekcjonowano na płytkach zawierających ampicylinę. Kolonie pobierano następnego dnia i hodowano przez noc w bulionie Luria- Bertani (LB) ( gramów tryptonu, gramów ekstraktu drożdżowego i gramów chlorku sodu w 1 l dejonizowanej wody; EM Science, Gibbstown, NJ) z dodaną ampicyliną. Bakterie izolowano i płukano buforowanym fosforanem fizjologicznym roztworem soli. Przepłukane bakterie zawieszano następnie w pożywce PBS w stężeniu około 9 rekombinowanej Salmonella na mililitr PBS, z wytworzeniem roztworu kompozycji DNA 1 zawierającej konstrukt DNA, który koduje, w sposób umożliwiający ekspresję, FAP myszowatych, włączony do wektora - atenuowanej Salmonella typhimurium (AroA - dam - ). Kompozycję przechowywano w szczelnie zamkniętych ampułkach do czasu użycia. Przygotowano również szczepionkę kontrolną składającą się z Salmonella transformowanej samym wektorem pcdna3.1 (bez DNA FAP)

46 zgodnie z tą samą procedurą. Plazmidowy DNA przechowywano przed transformowaniem Salmonella w około -80 C. [0093] Po skonstruowaniu eukariotycznego wektora ekspresyjnego pcdna3.1/v-his-topo-fap (pfap) jak opisano powyżej (Fig. 1, Panel A), prawidłową ekspresję białka FAP o wielkości 88 kda wykazano poprzez analizę Western lizatów komórkowych z obydwu, przejściowo transfekowanych komórek raka okrężnicy CT26 i komórek raka sutka D2F2, które same nie wykazują ekspresji FAP (Fig. 1, Panel B). 1 2 Przykład 2. Wytwarzanie kompozycji DNA 2 kodującej FAP myszowatych, IL-2 myszowatych i CCL21 myszowatych. [0094] cdna kodujący IL-2 myszowatych(dna NR ID. SEKW.: ), z ATCC, # dostępu 39892, Manassas, Virginia i CCL21a myszowatych (DNA NR ID. SEKW.: 7) z Invitrogen, San Diego, California, subklonowano do wektora pfap myszowatych z Przykładu 1, przy zastosowaniu tej samej ogólnej procedury opisanej w Przykładzie 1. Salmonella typhimurium RE88 transformowano otrzymanym w rezultacie wektorem (pfap/il-2/ccl21) przy zastosowaniu procedury opisanej w Przykładzie 1, z uzyskaniem roztworu kompozycji DNA 2 zawierającej konstrukt DNA, który koduje, w sposób umożliwiający ekspresję, FAP myszowatych, IL-2 myszowatych i CCL21a myszowatych włączone do wektora - atenuowanej Salmonella typhimurium.

47 Przykład 3. Ocena kompozycji DNA według wynalazku w modelach raka okrężnicy i sutka myszowatych. 1 2 [009] Immunizacja doustna, prowokacja komórkami nowotworowymi i leczenie doksorubicyną. Do eksperymentów w trybie profilaktycznym, myszy BALB/c (n=8) traktowano trzy razy w około 1-tygodniowych odstępach poprzez zgłębnik doustny około 0 µl PBS zawierającego około 9 S. typhimurium (AroA - dam - ) transformowaną wektorami plazmidowymi kodującymi FAP myszowatych (kompozycja DNA 1 z Przykładu 1), FAP myszowatych, IL-2 i CCL21 (kompozycja DNA 2 z Przykładu 2) lub kontrolną szczepionką z Przykładu 1, z wykorzystaniem metod opisanych w Niethammer i wsp., Nat. Med, 02, 8: 1369-137. Zwierzęta prowokowano około dni później poprzez wstrzyknięcie podskórne (s.c.) około 3x 4 komórek raka okrężnicy CT26 w przednią część lewego boku lub wstrzyknięcie ortotopowe (o.t.) 3x komórek raka sutka D2F2, w lewą poduszeczkę tłuszczową drugiego z najniższych sutków. [0096] Objętość guza nowotworowego (w mm 3 ) obliczono poprzez pomiar guza w 2 wymiarach (tj. długości i szerokości, w milimetrach) i obliczanie objętości jako połowę długości razy kwadrat szerokości. W trybie terapeutycznym, początkowe zaszczepienie komórkami nowotworowymi było poprzez dożylne wstrzyknięcie (i.v.) około 1x komórek raka okrężnicy CT26 a następnie po około 3 i dniach szczepiono doustną szczepionką kontrolną lub aktywnymi kompozycjami DNA. Po około 18 dniach, płuca ważono (prawidłowa masa płuc wynosiła około 0,2 g) i przerzuty nowotworowe do płuc badano i

48 1 2 oceniano poprzez ocenę wizualną, badając procent powierzchni płuca objętej przez zlane przerzuty w następujący sposób: wynik 0 przy 0% pokrycia, wynik 1 przy mniej niż około % pokrycia, wynik 2 przy około -0% pokrycia, wynik 3 przy więcej niż około 0% objętej powierzchni płuc. Leczenie prowadzono doksorubicyną w grupach myszy stosując około mg/kg doksorubicyny (Sigma) podawanej dożylnie, i 1 dni po prowokacji nowotworem. [0097] W celu usunięcia komórek T CD4 + i CD8 + lub subpulacji komórek NK, przeciwciała (00 µg) skierowane przeciwko bądź CD4 (klon GK 1.), bądź CD8 (klon 2.43), obydwa z National Cell Culture Center (Minneapolis, Minnesota) lub przeciwciało anty-asialo GM1 (BioProducts Wako, Richmond, Virginia) wstrzykiwano i.p. co 7 dni, zaczynając jeden dzień przed prowokacją komórkami nowotworowymi. [0098] Cytotoksyczność komórek T CD8 +. Około dni po ostatnim z trzech traktowań w odstępach 1-tygodniowych, zebrano splenocyty od różnych traktowanych grup myszy BALB/c (n=4). Stosując mikrokulki-cd8a (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Niemcy), oczyszczono komórki CD8 + zgodnie z protokołem producenta. Komórki te następnie stymulowano w trakcie -dniowej jednoczesnej hodowli z napromieniowanymi promieniowaniem (00 Gy, 4 minut) komórkami CT26 transfekowanymi przejściowo bądź pcdna3.1/zeo (pusty wektor z Przykładu 1), bądź pcdna3.1/zeo- FAP (wektor pfap z Przykładu 1). Następnie, komórki T CD8 + hodowano jednocześnie z komórkami nowotworowymi CT26 (E:T = 0:1), które były transfekowane przejściowo bądź

49 1 2 białkiem zielonej fluorescencji (GFP) (PEGFP, Clontech, Palo Alto, Kalifornia) jako kontrola, bądź GFP plus plazmid pfap kodujący FAP myszowatych. Po około 48 godzinach, oceniano jądrową apoptozę, jak to opisano powyżej, przy zastosowaniu swoistego wobec DNA barwnika Hoechst 33342 (2 µm). [0099] W celu przeprowadzenia testu uwalniania 1 Cr, myszy Balb/c (n=3) traktowano czterokrotnie w odstępach tygodniowych. Splenocyty zbierano 13 dni po ostatnim traktowaniu i inkubowano przez dni z napromieniowanymi promieniowaniem (około 00 Gy, 4 minut) fibroblastami A31 (ATCC, Manassas, Virginia), które zostały zainfekowane pfap przy zastosowaniu retrowirusa. Następnie stymulowane splenocyty inkubowano przez około 4 godziny przy zastosowaniu wyznakowanego A31-pFap i obliczono procent lizy. Komórki inkubowano również wspólnie z przeciwciałami anty-mhc klasy I (BD Biosciences, Rockville, Maryland) w stężeniu około µg/ml. [00] Immunohistochemia. Krioskrawki (około 8 µm grubości) utrwalano w acetonie i napięto. Po inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym (bądź poliklonalnym króliczym przeciwciałem przeciwko FAP myszowatych (dostarczonym przez dr J.D. Cheng), bądź poliklonalnym króliczym przeciwciałem przeciwko kolagenowi typu I myszowatych (Chemicon, Temecula, Kalifornia), skrawki barwiono immunologicznie zgodnie z protokołem producenta (zestaw DAKO LSAB+ Kit, peroksydaza, DAKO, Carpinteria, Kalifornia). [01] Do mikroskopii konfokalnej utrwalone krioskrawki barwiono przy zastosowaniu przeciwciała

0 1 2 przeciwko CD8 myszowatych, biotynylowanego przeciwciała drugorzędowego przeciwko szczurzej Ig, streptawidyna wyznakowana FITC (BD Bioscience, Rockville, Maryland) i barwiono jednocześnie DAPI (Sigma, St. Louis, Missouri). Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny (LSCM, ang. laser scanning confocal microscope) zastosowano do uzyskania obrazów, które zostały poddane obróbce przy użyciu oprogramowania Zeiss Image Examiner (Carl Zeiss). Do analizy FACS, nacieki komórek T u myszy Balb/c (n=6) traktowano trzy razy w odstępach tygodniowych bądź pfap, bądź pustym wektorem. Jeden tydzień po ostatnim traktowaniu zwierzęta prowokowano s.c. około 3x komórek nowotworowych CT26. Guzy nowotworowe zbierano po 3 tygodniach i otrzymano zawiesiny pojedynczych komórek przez inkubację skrawków tkanki nowotworowej przez 4 minut w pożywce uzupełnionej kolagenazą typu I (12 U/ml, Gibco, Gaithersburg, Maryland). Po przefiltrowaniu, komórki od dwóch myszy połączono w pulę, barwiono anty-cd3 + PerCp- Cy. i anty-cd8 + FITC (BD Biosciences, Rockville, Maryland) i analizowano za pomocą FACS. [02] Donowotworowe pobieranie fluoresceiny, albuminy z błękitem Evansa i 14 C--fluorouracylu. Po trzech ostatnich traktowaniach z 1-tygodniowymi odstępami bądź szczepionką kontrolną (Przykład 1), bądź kompozycją DNA 1 (Przykład 1), bądź kompozycją DNA 2 (Przykład 2), myszy prowokowano dni później poprzez podskórne wstrzyknięcie około 3x 4 komórek CT26 komórki w przednią część lewego boku. Około 19 dni później, myszom podano w zastrzykach dootrzewnowych (i.p.) bądź 1% fluoresceinę sodową (Sigma) w ilości około 12 µl/g

1 1 2 masy ciała, dożylny zastrzyk z około 0 µl albuminy z błękitem Evansa (Sigma), bądź dożylny zastrzyk z około 2, µci 14 C--fluorouracylu (Sigma). Po około, odpowiednio, minutach, minutach lub 1 godzinie, myszy uśmiercano w celu określenia absorpcji lub scyntylacji nadsączy z homogenatatów guzów nowotworowych, odpowiednio, przy 490 nm, 612 nm lub w liczniku. [03] W celu określenia donowotworowego pobierania doksorubicyny myszy Balb/c (n=4) prowokowano s.c. około x komórek D2F2, w prawy bok. Doksorubicynę wstrzykiwano dożylnie 16 dni później, ( mg/kg) i guzy nowotworowe zbierano 4 minut później. Próbki były mierzone względem wewnętrznego standardu daunorubicyny przy użyciu kolumny Eclipse XCB-C8 w LC-MS serii 10 (Agilent, Foster City, Kalifornia). [04] Ocena potencjalnych efektów ubocznych. W celu ustalenia, czy są jakieś szkodliwe efekty na gojenie się ran, myszy chirurgicznie raniono. Wykonywano okrągłą ranę o średnicy około 3 mm przy użyciu dziurkacza do skóry (Miltex Inc Bethpage, Nowy Jork), w górnej części grzbietu myszy BALB/c (n=4) około dni po ostatnim z 3 traktowań w odstępach 1-tygodniowych. Mierzono czas potrzebny do zamknięcia się ran. Pomimo tego, że w czasie gojenia się rany następuje nadekspresja FAP, kompozycje według niniejszego wynalazku nie przeszkadzają w procesie gojenia się ran. Po zrobieniu okrągłych ran o średnicy około 3 mm na grzbietach traktowanych myszy BALB/c (n=4), nie zaobserwowano istotnych różnic w gojeniu się ran między myszami traktowanymi i nietraktowanymi. Do analizy

2 1 2 histologicznej rany wykonano na myszach traktowanych 7, 14, 21 dni przed badaniem. Biopsje skóry, a także 26 narządów i tkanek, zostały zbadane przez patologa myszy. [0] Traktowanie profilaktyczne kompozycją DNA opartą na FAP hamuje wzrost pierwotnego guza nowotworowego. Dziesięć dni po ostatnim z trzech traktowań w odstępach 1-tygodniowych bądź szczepionką kontrolną (Przykład 1), bądź kompozycją DNA 1 (Przykład 1), bądź kompozycją DNA 2 (Przykład 2), różne grupy myszy BALB/c (n=8) prowokowano albo podskórnie komórkami raka okrężnicy CT26 albo ortotopowo komórkami raka sutka D2F2, jak opisano powyżej. Kompozycje DNA według wynalazku hamowały wzrost pierwotnego guza nowotworowego opornych na wiele leków komórek CT26 (Fig. 2a), jak również opornych komórek D2F2 (Fig. 2b). Kompozycja DNA 2, który koduje kombinację FAP, CCL21 i IL-2, była prawie tak samo skuteczna w hamowaniu wzrostu pierwotnego guza nowotworowego (Fig. 2a). [06] Kompozycja DNA według wynalazku zmniejsza rozwój ustalonych przerzutów w trybie terapeutycznym. Myszy BALB/c traktowane kompozycją DNA 1 z Przykładu 1 trzy i dziesięć dni po początkowym zaszczepieniu dożylnym około 1x komórek raka okrężnicy CT26 wykazywały w rezultacie znaczne zmniejszenie doświadczalnych przerzutów płucnych w porównaniu do myszy traktowanych szczepionką kontrolną z Przykładu 1. Natomiast myszy w grupie kontrolnej wykazywały rozległe przerzuty i zaczynały umierać 18 dni po wszczepieniu komórek nowotworowych (Fig. 2c). Podobnie, kombinacja

3 1 2 pfap z samym pccl21 była również prawie tak samo skuteczna (Fig. 2b). [07] Komórki T CD8 + zapewniają skuteczną przeciwnowotworową odpowiedź immunologiczną. Myszy traktowano trzykrotnie i.v. w 1-tygodniowych odstępach kompozycją DNA 1 (przykład 1) i prowokowano około 1x komórek CT26. Myszy pozbawiano następnie ich odpowiednich komórek efektorowych w fazie efektorowej przy zastosowaniu przeciwciał przeciwko komórkom T CD4 + lub CD8 +, jak również przeciwko komórkom NK (Fig. 3, panel A). Usunięcie komórek CD4 + i NK nie zmniejsza skuteczności traktowania pfap, wskazując na ważną rolę komórek T CD8 + w odpowiedzi immunologicznej. [08] W celu dokonania oceny, w jakim stopniu traktowanie kompozycjami DNA dla FAP według wynalazku jest w stanie przełamać tolerancję obwodowych komórek T przeciwko własnemu antygenowi FAP, oczyszczono komórki T CD8 + ze zwierząt traktowanych bakteriami transfekowanymi pfap lub pustym wektorem. Komórki te stymulowano następnie napromieniowanymi promieniowaniem docelowymi komórkami nowotworowymi i inkubowano z żywymi docelowymi komórkami nowotworowymi, które były przejściowo transfekowane bądź GFP jako kontrola, bądź GFP/pFap. Jak pokazano na Fig. 3, panel B, tylko komórki T CD8 + oczyszczone z myszy traktowanych pfap były zdolne do indukowania apoptozy jądrowej, co oceniono poprzez barwienie komórek docelowych transfekowanych pfap przy zastosowaniu barwnika Hoechst-33342. [09] Splenocyty traktowanych myszy użyto również do konwencjonalnego testu uwalniania 1 Cr. W tym celu,

4 1 2 splenocyty myszy traktowanych kompozycją 1 i szczepionką kontrolną inkubowano przez dni z napromieniowanymi promieniowaniem fibroblastami A31, które infekowano pfap przy użyciu retrowirusa. Stymulowane splenocyty inkubowano następnie przez 4 godziny z wyznakowanymi komórkami A31-pFap i obliczono procent lizy. Splenocyty myszy traktowanych kompozycją 1 były zdolne do lizy znacznie większej liczby fibroblastów niż te z kontrolami - pustymi wektorami przy stosunku komórek docelowych do efektorowych wynoszącym 1:0 i 1:2 (Fig. 3, panel C). Jednoczesna inkubacja z przeciwciałami anty-mhc klasy I eliminowała ten efekt (Fig. 3, panel D). [01] W dodatkowej ocenie, myszy traktowano trzykrotnie bądź kompozycją 1, bądź szczepionką kontrolną, a następnie prowokowano około 3x 4 komórek nowotworowych CT26 w celu zbadania naciekania komórek T CD8 + do guzów nowotworowych myszy traktowanych pfap. Po trzech tygodniach, pobrano guzy nowotworowe i zawiesiny pojedynczych komórek barwiono pod kątem komórek CD3 + i CD8 + i analizowano przy zastosowaniu FACS. Myszy traktowane kompozycją 1 wykazały znaczny wzrost ilości komórek CD3 + i CD8 + w tkance nowotworowej w porównaniu z kontrolą - pustym wektorem (Fig. 3, panel E). [0111] Skrawki guzów nowotworowych barwiono także anty-cd8 z FITC oraz barwnikiem jądrowym - DAPI. Podczas mikroskopi konfokalnej, guzy myszy traktowanych kompozycją 1 wykazywały bardziej wyraźne naciekanie komórek CD8 + niż myszy traktowane szczepionką kontrolną z Przykładu 1 (Fig. 3, panel F). Wszystkie te obserwacje razem wykazują, że kompozycja DNA według

1 2 wynalazku, której celem jest FAP, może przezwyciężyć tolerancję obwodowych komórek T przeciwko własnemu antygenowi FAP. [0112] Zahamowanie ekspresji kolagenu typu I zwiększa donowotworowe pobieranie barwnika. Fibroblasty są głównym źródłem kolagenu typu I i opisywano, że ekspresja tej cząsteczki koreluje odwrotnie proporcjonalnie z donowotworowym pobieraniem związków o różnych masach cząsteczkowych. W celu dokonania oceny, czy ten sam mechanizm stosuje się do kompozycji DNA według wynalazku, skrawki guzów nowotworowych traktowanych myszy barwiono przeciwciałami przeciw FAP (Fig. 4, panel A, zdjęcia górne) lub wobec kolagenu typu I (Fig. 4, panel A, zdjęcia dolne). Spadek ekspresji FAP, jak również kolagenu typu I, wykryto w grupach myszy traktowanych kompozycją 1 w porównaniu do myszy traktowanych jedynie szczepionką kontrolną (Przykład 1). Odpowiadające sobie wycinki Western dla tych ekstraktów guzów nowotworowych, barwione tymi samymi przeciwciałami, wykazały około 82,63 +/- 2,4% spadek ekspresji FAP (Fig. 4, Panel B, zdjęcie górne) i około 76,36 +/- 2,01% spadek ekspresji kolagenu typu I (Fig. 4, Panel B, zdjęcie dolne). [0113] Myszom wstrzykiwano następnie trzy związki różniące się rozmiarem i strukturą, tj. fluoresceinę (376 Da) (Fig. 4, panel C), albuminę z błękitem Evansa (6800 Da) (Fig. 4, panel D) lub czynnik chemioterapeutyczny, -fluorouracyl (1 Da) (Fig. 4, panel E), jak to opisano powyżej. Guzy nowotworowe myszy traktowanych kompozycją DNA 1 z pfap włączały

6 1 2 znacznie więcej (p<0,0) tych odpowiednich cząsteczek niż te myszy, którym podawano szczepionkę kontrolną. [0114] Skojarzenie kompozycji DNA i chemioterapii prowadzi do odrzucenia nowotworu. Opracowano protokół terapeutyczny leczenia skojarzonego przy zastosowaniu kompozycji DNA według wynalazku z lekiem chemioterapeutycznym - doksorubicyną, na który komórki D2F2 są częściowo wrażliwe (Fig. 1, panel C). Myszy BALB/c (n=8) traktowano szczepionką kontrolną z Przykładu 1 lub kompozycją 1 z Przykładu 1. Traktowane myszy prowokowano następnie ortotopowo komórkami raka sutka D2F2. Te dwie grupy myszy, traktowano następnie doksorubicyną lub PBS jako kontrolą, i 1 dni po prowokacji nowotworem. Jak przedstawiono na Fig., panel A, pojedyncze traktowanie bądź immunoterapią (kompozycja 1), bądź chemioterapią, było w stanie tylko zahamować, ale nie wyeliminować wzrost guza nowotworowego. W przeciwieństwie do tego, grupa myszy traktowanych kompozycją 1 i doksorubicyną w skojarzeniu nie tylko wykazywały wyraźne zahamowanie wzrostu guza nowotworowego, ale także całkowite odrzucenie nowotworu u 4 z 8 myszy (Fig., panel A). [011] W innym podejściu, w terapii skojarzonej w trybie terapeutycznym, myszy BALB/c (n=8) prowokowano i.v. komórkami nowotworowymi D2F2. Po dniach, gdy powstały przerzuty, myszy traktowano co tydzień kompozycją 1. Jeden dzień po każdym traktowaniu myszom wstrzyknięto i.v. doksorubicynę. W wyniku tego leczenia skojarzonego długość życia tych myszy zwiększyła się ponad 3-krotnie w stosunku do myszy kontrolnych, które

7 1 2 były traktowane samą doksorubicyną lub kompozycją 1 i umierały już po około 3-4 dniach (Fig., panel B). [0116] Kompozycja DNA dla FAP według wynalazku zwiększa donowotworowe pobieranie doksorubicyny. W celu określenia stężenia doksorubicyny w tkance nowotworowej, myszy (n=4) traktowano trzykrotnie w odstępach 1-tygodniowych kompozycją 1, prowokowano 7 dni później x komórek nowotworowych D2F2, a 16 dni później wstrzykiwano dożylnie doksorubicynę. Określono donowotworowe stężenie leku przy zastosowaniu chromatografii cieczowej/spektrometrii mas (LC-MS). Tkanki myszy traktowanych kompozycją 1 wykazały znaczny wzrost pobierania doksorubicyny w nowotworowych (Fig. 6, panel A) w porównaniu do kontroli. Wyniki te są zgodne z obserwowaną infiltracją chemiczną nowotworów u myszy traktowanych fluoresceiną, albuminą i - fluorouracylem (Fig. 4, panele C-D). [0117] Szczepionka DNA przeciwko FAP nie wpływa niekorzystnie na gojenie się ran lub nie uszkadza zdrowej tkanki. Ponieważ nadekspresja FAP następuje w czasie gojenia się ran, badano efekty kompozycji DNA według niniejszego wynalazku na gojenie się ran. Na grzbietach traktowanych myszy BALB/c (n = 4) zrobiono okrągłe rany o średnicy 3 mm. Ku zaskoczeniu, nie zaobserwowano znaczącej różnicy w gojeniu się ran pomiędzy myszami traktowanymi i nietraktowanymi (Fig. 6, panel B). Histologiczna ocena przez patologa myszy tych ran po różnym czasie nie wykazała nieprawidłowości jakościowych w procesie gojenia się ran. Aby wykluczyć jakiekolwiek reakcje autoimmunologiczne indukowane przez kompozycje DNA według wynalazku, przeprowadzono

8 kompleksowe badanie histologiczne następujących tkanek i narządów: skóry, mózgu, rdzenia kręgowego, mięśnia, kości, błony maziowej, serca, aorty, tętnic płucnych, grasicy, śledziony, węzłów chłonnych, szpiku kostnego, przytarczyc, nadnerczy, nerki, macicy, pochwy, gruczołu łechtaczki, języka, wątroby, płuc, trzustki, żołądka, jelita cienkiego i okrężnicy. Nie zaobserwowano wyraźnych różnic w porównaniu z myszami kontrolnymi.

9 [0118] <1> REISFELD, Ralph A. LOEFFLER, Markus KRÜGER, Jörg A. NIETHAMMER, Andreas G. <1> KOMPOZYCJE DNA PRZECIW ANTYGENOWI ZRĘBOWEMU NOWOTWORU FAP I SPOSOBY ICH STOSOWANIA <1> TSRI 91.1 PCT <> US 60/81,316 <11> 06-06-21 <160> 16 <170> FastSEQ dla Windows Wersja 4.0 <2> 1 <211> 2648 <212> DNA <213> homo sapiens 1 <400> 1

60 <2> 2 <211> 760 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 2

61 <2> 3 <211> 261 <212> DNA <213> mus musculus

62 <400> 3 <2> 4 <211> 761 <212> PRT <213> mus musculus <400> 4

63

64 <2> <211> 814 <212> DNA <213> homo sapiens <400> <2> 6 <211> 13 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 6

6 <2> 7 <211> 939 <212> DNA <213> mus musculus <400> 7 <2> 8 <211> 160 <212> PRT <213> mus musculus <400> 8

66 <2> 9 <211> 82 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 9 <2> <211> 134 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 <2> 11 <211> 61 <212> DNA <213> mus musculus

67 <400> 11 <2> 12 <211> 133 <212> PRT <213> mus musculus <400> 12 <2> 13 <211> 878 <212> DNA <213> mus musculus <400> 13 1 <2> 14 <211> 134 <212> PRT <213> mus musculus

68 <400> 14 <2> 1 <211> 1816 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 1 <2> 16 <211> 261 <212> PRT <213> homo sapiens

<400> 16 69

70 Zastrzeżenia patentowe 1 2 1. Kompozycja skuteczna we wzbudzaniu odpowiedzi immunologicznej przeciwko komórkom zrębowym nowotworu, które wykazują ekspresję białka aktywującego fibroblasty (FAP), zawierająca konstrukt DNA, który koduje FAP i jest włączony do wektora bakteryjnego - atenuowanej Salmonella typhimurium, który to konstrukt DNA może ulegać ekspresji w komórkach odpornościowych i jest włączony do farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika. 2. Kompozycja według zastrz. 1, w której konstrukt DNA koduje ludzkie FAP (NR ID. SEKW.: 2). 3. Kompozycja według zastrz. 1, w której konstrukt DNA jest zasadniczo oczyszczonym DNA mającym sekwencję polinukleotydową składającą się z NR ID. SEKW.: 1 lub sekwencję polinukleotydową, która ma z nią co najmniej 80% podobieństwa sekwencji. 4. Kompozycja według zastrz. 1, która to kompozycja zawiera ponadto konstrukt DNA, kodujący odpornościowe białko efektorowe, które może ulegać ekspresji w komórkach odpornościowych.. Kompozycja według zastrz. 4, w której odpornościowym białkiem efektorowym jest cytokina. 6. Kompozycja według zastrz., w której cytokiną jest CCL21, IL-2 albo CD40LT. 7. Kompozycja według dowolnego z zastrz. od 1 do 6, do zastosowania w hamowaniu wzrostu nowotworu albo przerzutów nowotworu. THE SCRIPPS RESEARCH INSTITUTE Pełnomocnik:

71

72

73

74

7

76

77 (NR ID. SEKW.: 1) DNA dla ludzkiego FAP Fig. 7

78 (NR ID. SEKW.: 2) Ludzkie FAP Fig. 8

79 (NR ID. SEKW.: 3) DNA dla FAP myszowatych Fig. 9

80 (NR ID. SEKW.: 4) FAP myszowatych Fig.

81 (NR ID. SEKW.: ) DNA dla ludzkiej IL-2 Fig. 11

82 (NR ID. SEKW.: 6) Ludzka IL-2 Fig. 12

83 (NR ID. SEKW.: 7) DNA dla IL-2 myszowatych Fig. 13

84 (NR ID. SEKW.: 8) IL-2 myszowatych Fig. 14

8 (NR ID. SEKW.: 9) DNA dla ludzkiej CCL21 Fig. 1

86 (NR ID. SEKW.: ) Ludzka CCL21 Fig. 16

87 (NR ID. SEKW.: 11) DNA dla CCL21b myszowatych Fig. 17

88 (NR ID. SEKW.: 12) CCL21b myszowatych Fig. 18

89

90 (NR ID. SEKW.: 13) DNA dla CCL21a myszowatych Fig.

91 (NR ID. SEKW.: 14) CCL21a myszowatych Fig. 21

92 (NR ID. SEKW.: 1) DNA dla ludzkiego CD40L Fig. 22