Techniki immunochemiczne opierają się na specyficznych oddziaływaniach między antygenami a przeciwciałami
Oznaczanie immunochemiczne RIA - ( ang. Radio Immuno Assay) techniki radioimmunologiczne EIA - (ang. Enzyme Immuno Assay) techniki immunoenzymatyczne ELISA - (ang. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) test immunoenzymosorbcyjny Immunoblotting (Western blotting) Immunostrącanie Chromatografia immunopowinowactwa
Metody immunochemiczne
ELISA
TYPY TESTU ELISA Bezpośredni Pośrednie
Schemat reakcji ELISA wykonywanych na ćwiczeniach
Immunoblotting
Techniki chromatograficzne (rozdzielcze) - chromatografia gazowa (GC) - - nisko- i wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa (HPLC) - - elektroforeza kapilarna (CE) -
Metody chromatograficzne (rozdzielcze) w oznaczaniu hormonów roślinnych (GC, HPLC)
Hormony roślinne
Typowy schemat przygotowania próbki do analizy GC i LC
Zastosowanie metod chromatograficznych w analizie materiału biologicznego Każdy układ biologiczny jest mieszaniną substancji chemicznych. Analiza poszczególnych składników takiego układu wymaga często ich wcześniejszego rozdzielenia. Termin chromatografia oznacza efekt rozdziału (separacji) składników mieszaniny, obserwowany podczas ich przepływu z fazą ruchomą wzdłuż powierzchni fazy nieruchomej (stacjonarnej). Cząsteczki składników mieszaniny, które słabo oddziałują z fazą nieruchomą, są szybciej unoszone przez płynącą fazę ruchomą, zaś cząsteczki przyciągane mocniej poruszają się wolniej. Fazą stacjonarną może być ciało stałe, ciecz na stałym nośniku lub żel, a fazą ruchomą może być gaz lub ciecz. kolumna chromatograficzna
Przykładowe rodzaje metod chromatograficznych Ekstrakcja z fazy stałej (SPE) Chromatografia cienkowarstwowa (TLC) Chromatografia gazowa (GC) Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) Elektroforeza kapilarna (CE)
Przykładowe rodzaje metod chromatograficznych: Ekstrakcja z fazy stałej (SPE) Chromatografia cienkowarstwowa (TLC) Chromatografia gazowa (GC) Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) Elektroforeza kapilarna (CE) Każdy proces chromatograficzny składa się z trzech etapów: dozowanie próbki rozdział składników detekcja rozdzielonych składników detektor
Wysokosprawna (wysokociśnieniowa) chromatografia cieczowa (HPLC)
HPLC
Zestaw do wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej Od prawej: komputer sterujący aparatem i rejestrujący dane, pompa z zaworem dozującym, kolumna wewnątrz termostatu i różnego rodzaju detektory rozdzielanych substancji, np. UV-vis, fluorescencyjny, MS-MS.
Przykładowy chromatogram uzyskany metodą HPLC (detektor fluorescencyjny)
HPLC - rozdział składników Kolumny chromatograficzne
HPLC dozowanie próbki
HPLC - detekcja składników
HPLC - detekcja składników
Chromatografia gazowa - GC
Chromatografia gazowa - GC
RESET Chromatografia gazowa - GC H Gas Carrier Hydrogen Air
Chromatogram GC składników soku z pomarańczy
Wpływ warunków termicznych na rozdział w GC Warunki rozdziału: (a) izotermiczny w 45 o C (b) izotermiczny w 145 o C (c) programowany w 30 o C do 180 o C
Kolumna GC dozowanie próbki
Kolumny kapilarne stosowane w chromatografii gazowej
Przekroje kolumn do GC w powiększeniu
Fazy stacjonarne w kolumnach kapilarnych Najbardziej znanym typem faz stacjonarnych są polisiloksany. Każdy atom krzemu w łańcuchu zawiera dwie grupy funkcyjne. Typ i ilość grup decyduje o właściwościach fazy stacjonarnej, a tym samym kolumny. Poli(dimetylosiloksan) Poli(35% - difenylo- 65% dimetylosiloksan)
GC - detekcja składników - FID
GC - detekcja składników - ECD Względna czułość detektora wychwytu elektronów (ECD) w stosunku do różnych związków organiznych Węglowodory 1 Etery, estry 10 Alifatyczne alkohole, ketony, aminy, związki mono Cl, i mono F 100 Związki mono Br, di Cl, I, di F 1000 Anhydrydy i związki tri Cl 10000 Związki mono I, di Br, poli Cl i poli F 100000 Związki di I, tri Br, i poli F 1000000
Flow Flow GC - detekcja składników - TCD Uniwersalny detektor cieplno-przewodnościowy (TCD) Drut oporowy wewnątrz detektora jest chłodzony przez przepływający gaz nośny Kiedy w gazie nośnym pojawia się inna substancja, właściwości chłodzące gazu nośnego się zmieniają. Generuje to powstawanie sygnału w detektorze
Techniki łączone
Zastosowanie instrumentalnych technik analitycznych do detekcji w chromatografii gazowej i HPLC (techniki łączone) Chromatograf Spektrometr mas Spektrometr podczerwieni Spektrometr absorpcji atomowej Jądrowy rezonans magnetyczny - HPLC-MS, GC-MS - HPLC-IR, GC-IR - HPLC-AAS, GC-AAS - HPLC-NMR, GC-NMR Techniki instrumentalne nie tylko wykrywają obecność substancji, ale również dokonują jej analizy, przez co potwierdzają autentyczność mierzonej substancji w danym szczycie sygnału.
Chromatografia gazowa sprzężona ze spektometrią mas
Chromatografia gazowa sprzężona ze spektometrią mas - Detektor wykonuje co sekundę widmo masowe (skan) wycieku z kolumny. - Analizowane są jony o masach większych niż jony gazu nośnego. - Każda substancja ma charakterystyczne dla siebie widmo mas.
Chromatografia gazowa sprzężona ze spektometrią mas Zasada działania spektrometru masowego
Spektometria mas
Widmo masowe pochodnej metylowej (B) i metylowo-sililowej (A) kwasu indolilo-3- octowego (IAA) oraz (po prawej) - najintensywniejsze jony danego widma. A jak zinterpretować obecność w widmie jonów o m/z = 189 i 261?
Interpretacja obecności w widmie jonów o m/z = 189 i 261 Masa cz. IAA = 175 Reszta Me = 15 Reszta TMS = 73 Masa cz. H = 1 IAA + TMS + Me 2H = 261 IAA + Me - H = 189
Widmo masowe metylowo-sililowej pochodnej GA20
Dodatkowe zalety detektora ze spektrometrem mas Oznaczanie IAA w próbce ekstraktu z pożywki pohodowlanej bakterii wykonane techniką MS-Full scan i MS-SIR
Wytwarzanie lotnych pochodnych (derywatyzacja)
Wytwarzanie lotnych pochodnych związków organicznych Aby możliwa była analiza GC substancji organicznych należy przeprowadzić je w stan gazowy. Jednakże ogromna większość z tych substancji to ciała stałe o wysokiej temperaturze wrzenia. Nielotność tych substancji wywołana jest złożonością budowy (wysoka masa cząsteczkowa) i w dużej mierze obecnością w cząsteczkach polarnych grup funkcyjnych: COOH, NH 2, SH 2, OH. Zablokowanie tych grup wydatnie obniża temperaturę wrzenia i zwiększa trwałość związków organicznych. Metody blokowania grup funkcyjnych: - pochodne TMS (sililowe) 6 CH OH 2 6 O 5 4 OH HO 3 2 OH Glukoza 1 OH + 5 Cl Si CH 3 CH 3 CH 3 Trimetylochlorosilan (TMS-Cl) 4 (CH 3 ) 3 -Si-O CH 2 O-Si(CH 3 ) 3 O 5 O-Si(CH 3 ) 1 3 + 5HCl 3 2 O-Si(CH 3 ) 3 O-Si(CH 3 ) 3
+ - uzyskiwanie pochodnych sililowych - uzyskiwanie pochodnych acetylowych (acylowych) Bezwodnik kwasu octowego +
- pochodne (estry) alkilowe RCOOH + R 2 OH RCOOR 2 RCOOH + CH 2 N 2 RCOOCH 3 + N 2 reakcja z diazometanem O R C OH + CH 3 OH + H 2 SO 4 Kwasy tłuszczowe (nielotne) O CH 2 O C R Reflux O R C O CH 3 Lotna pochodna O CH O C R O CH 2 O C R Tłuszcze CH 3 ONa O + CH 3 OH 3 R C O CH 3 Lotna pochodna (biopaliwo!)
Analizy jakościowa i ilościowa w GC i HPLC
Podstawy analizy jakościowej i ilościowej w GC i HPLC Czas, w którym substancja przechodzi przez kolumnę nazywany jest czasem retencji (t R ). Czas retencji przypisany jest pikowi odpowiadającemu danej substancji. Jest to więc podstawowy parametr identyfikujący substancję w analizie GC i HPLC.
Response Response Podstawy analizy jakościowej i ilościowej w GC i HPLC Analiza jakościowa Identyfikacja substancji na podstawie czasu retencji Chromatogram mieszaniny węglowodorów Oktan 1.6 min = t R Heksan Dekan GC Retention Time on Carbowax-20 (min) Badana próbka substancja może być heksanem Wykryta 1.6 min = t R Retention Time on Carbowax-20 (min)
Odpowiedź detektora 1 mg/litr 2 mg/litr 3 mg/litr Powierzchnia piku Podstawy analizy jakościowej i ilościowej w GC i HPLC Analiza ilościowa - wyznaczanie stężenia substancji na podstawie krzywej wzorcowej 10 8 6 4 2 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 Stężenie próby (mg/litr) - Wyznaczanie stężenia substancji na podstawie wzorca wewnętrznego - Wyznaczanie stężenia substancji na podstawie znakowanego wzorca wewnętrznego (w GC-MS)
Technika rozcieńczenia izotopowego w GC-MS Specyficzna odmiana techniki dodatku wzorca. Specyficzność ta polega na tym, iż w tym przypadku dodawaną substancją jest znana ilość związku, który różni się od analitu jedynie składem izotopowym W trakcie analizy ilościowej wyznaczane są stosunki sygnałów dla odpowiednich jonów masowych (co najmniej dwóch) uzyskanych w trakcie analizy próbki rzeczywistej, próbki wzorca oraz próbki rzeczywistej z dodatkiem wzorca Do określenia zawartości analitu w badanej próbce potrzebna jest jedynie znajomość ilości izotopowo znaczonego analitu dodanego do próbki
Metoda rozcieńczenia izotopowego Jas 370 100 12.10 wzorzec wewnętrzny SIR of 5 Channels EI+ 227.00 2.56e6 % 0 Jas 370 100 % 12.13 analit 12.25 12.57 SIR of 5 Channels EI+ 224.00 2.34e6 c an =pow an /pow wz x c wz x wsp 0 Jas 370 100 12.10 12.13 12.60 SIR of 5 Channels EI+ TIC 8.61e6 12.25 % 0 12.05 12.10 12.15 12.20 12.25 12.30 12.35 12.40 12.45 12.50 12.55 12.60 12.44 Time Chromatogram JA-Me, d3-ja-me, H2JA-Me z użyciem techniki SIM. A analiza jonu o m/z 227 Th; B analiza jonu o m/z 224 Th; C analiza sumy jonów o m/z 151,153,224,226 i 227 Th.
Metoda rozcieńczenia izotopowego 1 ng d3jm 1ul (550 V, rep 6) Jas 179 761 (11.271) Cm (758:764-(664:699+883:922)) 151 100 SIR of 5 Channels EI+ 6.11e5 224 % 153 226 0 Jas 181 734 (11.226) Cm (729:737-(626:646+801:864)) 151 100 SIR of 5 Channels EI+ 7.89e4 227 % 153 226 0 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 Porównanie intensywności wybranych jonów (m/z 151, 153, 224, 226, 227) estru metylowego kwasu jasmonowego (JA-Me) (A) oraz standardu wewnętrznego d3ja-me (B)
Zastosowania techniki GC/MS Analiza składu mieszanin poreakcyjnych Analiza produktów naturalnych (np. olejki zapachowe) Badania reakcji chemicznych w fazie gazowej Identyfikacja zanieczyszczeń w lekach, kosmetykach, artykułach pożywczych itp. Analizy antydopingowe Analizy kryminalistyczne (np. identyfikacja producentów narkotyków) Analizy zanieczyszczeń środowiska
Tematy ćwiczeń Zadanie 1. Wykrywanie wirusa pelargonii PFBV metodą immunoenzymatyczną Zadanie 2. Oznaczanie zawartości witaminy C w sokach z warzyw i owoców metodą HPLC i fluorymetryczną Zadanie 3. Analiza jakościowa auksyn metodą GC-MS
Specyficzne metody spektroskopowe Fotoakustyczna metoda oznaczania etylenu