Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych

Transkrypt

1 UNIWERSYTET GDAŃSKI WYDZIAŁ CHEMII Pracownia studencka Zakład Analizy Środowiska Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych Ćwiczenie nr 6 WYBRANE PROCEDURY DERYWATYZACJI ANALITÓW W CHROMATOGRAFII GAZOWEJ Pracownia dyplomowa (Chemia) Gdańsk, 2013

2 6. Pracownia dyplomowa (Chemia) Derywatyzacja w chromatografii gazowej 2 1. CZĘŚĆ TEORETYCZNA Próbki środowiskowe ze względu na złożoność matryc, różnorodność występujących związków czy zakres stężeń potencjalnych analitów są najczęściej bardzo skomplikowanym materiałem badawczym. Często, pomimo zastosowania różnych technik izolacji i wzbogacania, oznaczanie niektórych substancji w postaci niezmodyfikowanej jest niemożliwe. W takich przypadkach pomocna staje się derywatyzacja analitów (synteza pochodnych). Derywatyzacja polega na przeprowadzeniu analitów, w wyniku reakcji chemicznej, w odpowiednie pochodne o właściwościach umożliwiających ich oznaczenie. W wyniku reakcji derywatyzacji substancje, które są przedmiotem analizy uzyskują właściwości odpowiednie dla danej techniki analitycznej. W przypadku wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), celem procesu może być otrzymanie pochodnych, posiadających w swej strukturze np. chromofory, co umożliwia ich detekcję za pomocą klasycznego detektora UV-VIS. Pochodne w chromatografii gazowej są syntezowane zwykle w następujących celach: zwiększenia lub zmniejszenia lotności analitów zwiększenia stabilności termicznej analitów, aby zapobiec ich rozkładowi w trakcie procesu chromatograficznego zwiększenia czułości bądź specyficzności oznaczenia przez wprowadzenie odpowiednich grup funkcyjnych zmianę polarności analitów, przez zablokowanie grup funkcyjnych Odczynnik służący do przekształcania analitu w pochodną powinien reagować ze związkiem badanym ilościowo i szybko, nie dawać reakcji ubocznych, a jego nadmiar powinien być łatwo usuwany ze środowiska reakcji. Analit można przekształcić w odpowiednią pochodną przed wprowadzeniem go na kolumnę chromatograficzną (pre-column derivatisation), w komorze dozownika chromatografu lub przed detekcją (post-column derivatisation) (Rysunek 1). Częstym rozwiązaniem jest także łączenie techniki mikroekstakcji do fazy stałej (SPME) z procesem derywatyzacji analitów. Proces derywatyzacji związków organicznych w chromatografii gazowej obejmuje zazwyczaj związki posiadające w swojej strukturze polarne grupy funkcyjne (np. hydroksylową, karboksylową, itp.). Reakcja polega najczęściej na wymianie atomu wodoru związanego z heteroatomem na taką grupę funkcyjną, która nie tworzy wiązań wodorowych. W wyniku tego otrzymuje się związki o dużo większej lotności i mniejszej polarności, co wpływa korzystnie na

3 6. Pracownia dyplomowa (Chemia) Derywatyzacja w chromatografii gazowej 3 przebieg rozdzielenia w przypadku zastosowania chromatografii gazowej. Do grup funkcyjnych, które przekształca się w pochodne, należą także grupy ulegające enolizacji, takie jak aldehydy i ketony. W tym przypadku grupę karbonylową przekształca się w odpowiednie hydrazony lub oksymy. Rys. 1. Schematyczne przedstawienie podstawowych sposobów przekształcenia analitów w pochodne (Jacek Namieśnik, Wojciech Chrzanowski, Patrycja Szpinek Nowe horyzonty i wyzwania w analityce i monitoringu środowiskowym Centrum Doskonałości Analityki i Monitoringu Środowiskowego (CEERM), Gdańsk, 2003). W analityce związków organicznych stosuje się najczęściej następujące sposoby derywatyzacji: Sililowanie otrzymane pochodne charakteryzują się większą lotnością, stabilnością oraz mniejszą polarnością niż substancje wyjściowe; pochodne uzyskuje się głównie zastępując atomy wodoru w grupach funkcyjnych ( OH, SH, NH, COOH, NOH, SOH, POH, CONH2, NH2), grupą trimetylosililową (TMSi). Przykłady reagentów stosowanych w uzyskiwaniu pochodnych TMSi będą podane w dalszej części instrukcji. Acylowanie proces ten jest stosowany w celu zablokowania grup OH, SH, NH. Jako odczynniki derywatyzujące często stosuje się bezwodniki kwasowe, halogenki i imidki acylowe. Podczas procesu acylowania tworzą się produkty uboczne o charakterze kwasowym (np. HCl), usuwa się je lub neutralizuje prowadząc reakcje w rozpuszczalnikach zasadowych (pirydyna,

4 6. Pracownia dyplomowa (Chemia) Derywatyzacja w chromatografii gazowej 4 trimetyloamina, trietyloamina). Alkilowanie polega na tworzeniu pochodnych przez zastąpienie aktywnych atomu cząsteczki substratu grupą alkilową odczynnika alkilującego. Wprowadzenie grupy alkilowej do cząsteczki analitu powoduje niewielki wzrost masy cząsteczkowej przy zmniejszeniu polarności i związanym z tym zwiększeniem lotności, metoda ta pozwala na użycie prostego detektora FID, bądź też detektora ECD dzięki wykorzystaniu odczynników zawierających atomy halogenu. Najprostszą metodą alkilowania jest metylowanie (diazometan lub jego pochodne). W przypadku oznaczania związków metaloorganicznych z wykorzystaniem metody GLC, stosuje się odczynniki Grignarda. Metodą alkilowania coraz częściej stosowaną jest alkilowanie międzyfazowe (Phase Transfer Alkilation). W metodzie tej wykorzystuje się dwie niemieszające się fazy: organiczną i wodną. Analit rozpuszczony jest w fazie wodnej, a reagent derywatyzujący w fazie organicznej. Po dodaniu soli tetraalkiloamoniowej tworzy się para jonowa, rozpuszczalna w fazie organicznej, znajdujący się w tej fazie odczynnik derywatyzujący reaguje z utworzoną parą jonową. Jak już wspomniano, derywatyzację analitów przeprowadza się najczęściej dla związków o charakterze polarnym i jonowym. Przedstawicielem takich substancji jest pochodna kwasu naftalenooctowego naproksen (Rysunek 2). Ma on działanie przeciwbólowe, przeciwzapalne i przeciwgorączkowe i jest zaliczany do grupy niesteroidowych leków przeciwzapalnych. Stosowany jest przy uśmierzaniu bólu, leczeniu stanów zapalnych takich jak: zapalenia tkanek miękkich, zapalenia mięśni, bóle menstruacyjne, reumatyzm, osteoporoza czy artretyzm. Udowodniono, że podobnie jak wiele innych farmaceutyków, wraz ze ściekami (szczególnie szpitalnymi) trafia do konwencjonalnych oczyszczalni ścieków, i nie jest z nich całkowicie usuwany w klasycznych procesach oczyszczania wód. Wraz ze ściekami oczyszczonymi przedostaje się do odbiorników wodnych zachowując właściwości substancji czynnej biologicznie i ma potencjalną zdolność do akumulacji w środowisku lub w tkankach organizmów żywych. Rys. 2. Struktura chemiczna naproksenu (wzór sumaryczny C 14 H 14 O 3, masa cząsteczkowa M = 230,259 g/mol).

5 6. Pracownia dyplomowa (Chemia) Derywatyzacja w chromatografii gazowej 5 2. WYKONANIE ĆWICZENIA 2.1. Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest nabycie umiejętności przeprowadzania analitu o charakterze polarnym (naproksenu) w postać lotnej pochodnej z wykorzystaniem różnych odczynników do derywatyzacji. Uzyskane pochodne będą analizowane za pomocą chromatografii gazowej w celu określenia wpływu struktury pochodnych na ich lotność oraz oceny wydajności procesu derywatyzacji. Dodatkowo, przeprowadzone zostaną pomiary z wykorzystaniem chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią mas (GC-MS) w celu potwierdzenia struktur uzyskanych pochodnych oraz zapoznania się ze schematami ich fragmentacji Wykonanie ćwiczenia Warunki analizy chromatograficznej Chromatograf Trace 2000 Series GC z detektorem FID Kolumna chromatograficzna RTX-1 30 m, 0,18 mm średnica wewnętrzna, 0,32 mm średnica wewnętrzna, 0,25 μm grubość fazy stacjonarnej Program temperaturowy: C, narost 10 C/min Temperatura dozownika: 300 C Temperatura detektora: 300 C Dzielnik przepływu: 1:10 Gaz nośny: argon, stały przepływ 1 ml/min Powietrze: 350 kpa, wodór: 35 kpa Analiza chromatograficzna 2-metyloantracenu Wykonać analizę chromatograficzną 1-2 μl roztworu 2-metyloantracenu w warunkach opisanych w rozdziale Przeprowadzenie analitu w postać pochodnej trimetylosililowej za pomocą mieszaniny 99% BSTFA i 1% TMCS 50 μl roztworu naproksenu i 100 μl roztworu 2-metyloantracenu przenieść do zakręcanej

6 6. Pracownia dyplomowa (Chemia) Derywatyzacja w chromatografii gazowej 6 butelki o pojemności 2 ml i odparować w strumieniu azotu do sucha. Dodać 100 μl roztworu odczynnika 99% BSTFA + 1% TMCS i ogrzewać w temp. 60 C przez 30 min. Po ostudzeniu wykonać analizę GC w warunkach opisanych w rozdziale Przeprowadzenie analitu w postać pochodnej trimetylosililowej za pomocą MSTFA 50 μl roztworu naproksenu i 100 μl roztworu 2-metyloantracenu przenieść do zakręcanej butelki o pojemności 2 ml i odparować w strumieniu azotu do sucha. Dodać 100 μl roztworu odczynnika MSTFA i ogrzewać w temp. 60 C przez 30 min. Po ostudzeniu wykonać analizę GC w warunkach opisanych w rozdziale Przeprowadzenie analitu w postać pochodnej tert-butylodimetylosililowej za pomocą MTBSTFA 50 μl roztworu naproksenu i 100 μl roztworu 2-metyloantracenu przenieść do zakręcanej butelki o pojemności 2 ml i odparować w strumieniu azotu do sucha. Dodać 100 μl roztworu odczynnika MTBSTFA i ogrzewać w temp. 60 C przez 30 min. Po ostudzeniu wykonać analizę GC w warunkach opisanych w rozdziale Przeprowadzenie analitu w postać pochodnej metylowej za pomocą TMSD 50 μl roztworu naproksenu i 100 μl roztworu 2-metyloantracenu przenieść do zakręcanej butelki o pojemności 2 ml i odparować w strumieniu azotu do sucha. Dodać 200 μl metanolu oraz 30 μl odczynnika TMSD. Uzyskaną próbkę starannie wymieszać, po czym ogrzewać w temp. 60 C przez 30 min. Po ostudzeniu wykonać analizę GC w warunkach opisanych w rozdziale UWAGA!!! BSTFA, MSTFA i MTBSTFA są odczynnikami gwałtownie reagującymi z wodą oraz alkoholami. Należy unikać obecności wody i alkoholi. Proszę dokładnie przepłukać strzykawki użyte do pobierania odczynników za pomocą dichlorometanu, następnie metanolu! Analiza GC-MS uzyskanych pochodnych Analiza GC uzyskanych pochodnych naproksenu zostanie wykonana z wykorzystaniem zestawu GC-MS Shimadzu QP-2010SE (jonizacja próbki wiązką elektronów o energii 70

7 6. Pracownia dyplomowa (Chemia) Derywatyzacja w chromatografii gazowej 7 ev). Szczegóły analiz zostaną podane przez prowadzącego zajęcia. 3. OPRACOWANIE WYNIKÓW W sprawozdaniu należy dokładnie opisać część doświadczalną, zinterpretować widma mas uzyskanych pochodnych oraz obliczyć wydajność procesu derywatyzacji korzystając ze wzoru: RRF= A S C IS A IS C S gdzie: RRF względny współczynnik odpowiedzi, AS pole powierzchni sygnału chromatograficznego analitu, CIS stężenie wzorca wewnętrznego - 2-metyloantracenu w próbce, AIS pole powierzchni sygnału chromatograficznego wzorca wewnętrznego 2-metyloantracenu, CS stężenie analitu naproksenu w próbce. Następnie należy porównać wydajności procesu derywatyzacji naproksenu za pomocą różnych odczynników i przedyskutować uzyskane wyniki. Jednocześnie, należy przeanalizować różnice w czasach retencji uzyskanych pochodnych i wskazać możliwe źródła tych różnic. 4. SZKŁO I ODCZYNNIKI roztwór naproksenu w metanolu roztwór 2-metyloantracenu w dichlorometanie dichlorometan do mycia strzykawki odczynnik 99% BSTFA (N,O-bis(trimetylosilylo)trifluoroacetamid) +1% TMCS (trimetylochlorosilan) odczynnik MSTFA (N-trimetylosilylo-N-metylo-trifluoroacetamid) odczynnik MTBSTFA (N-tert-butylodimetylosililo-N-metylo-trifluoroacetamid) odczynnik TMSD ((trimetylosilylo)diazometan) metanol butelki o pojemności 2 ml z nakrętkami 4 szt. strzykawka do GC 10 μl 1 szt. strzykawka 100 μl 4 szt. pipety Pasteura bloczek grzejny Struktury stosowanych reagentów, a także schematyczne równania reakcji, są przedstawione na Rysunku 3.

8 6. Pracownia dyplomowa (Chemia) Derywatyzacja w chromatografii gazowej 8 Rys. 3. Struktury stosowanych reagentów, a także schematyczne równania reakcji syntezy pochodnych sililowych.