JONY METASTABILNE I FRAGMENTACJA POD WPŁYWEM ENERGII ZDERZEŃ

SPEKTRMETRIA MAS W CHEMII RGANICZNEJ, ANALITYCZNEJ I BICHEMII WYKŁADY 7 i 8 Jony metastabilne i fragmentacja pod wpływem energii zderzeń GC/MS HPLC/MS Instytut Chemii rganicznej PAN, Warszawa JNY METASTABILNE I FRAGMENTACJA PD WPŁYWEM ENERGII ZDERZEŃ

Widmo EI kwasu octowego Jony fragmentacyjne 1 43 45 Intensywność względna 5 15 C H 3 18 C M = 6 29 31 H Jon molekularny 6 5 1 15 2 25 3 35 4 45 5 55 6 65 7 m/z Terminologia procesów fragmentacji M + P + + N jon macierzysty (parent ion lub precursor ion) jon potomny (daughter ion lub product ion) fragment obojętny (neutral fragment) Energia jonów fragmentacyjnych M + P + + N E M = E P + E N E P =E M M M P M (jeśli pominąć energię uwalnianą w reakcji fragmentacji

Rodzaje pomiarów MS/MS Widmo jonów potomnych Widmo jonów macierzystych Q1 Product Ion Scan Q3 Q1 Precursor Ion Scan Q3 m 1 m 2 m 1 m 1 m 2 m 1 Wybór jonu macierzystego Skanowanie jonów potomnych Skanowanie jonów macierzystych Wybór jonu potomnego Widmo jonów tracących fragment obojętny o stałej masie Q1 m 1 m 2 Neutral Loss Scan Skanowanie Q1 i Q3 ze stałą różnicą masy m Q3 m 1 - m m 2 - m Śledzenie wybranych reakcji fragmentacji Multiple Reaction Monitoring (MRM) m 1 m 2 (m 3, m 4...) Wybór jonu macierzystego Wybór jonu potomnego (lub kilku jonów potomnych) Rozkład energii populacji jonów molekularnych w źródle jonów EI P(E) Fragmentacja w źródle jonów M + Czas przebywania jonu w źródle: 1 1-6 s Czas przelotu jonu przez spektrometr AMD 64: M= 1 u 2.4 1-4 s EI (Energia jonizacji) Jony metastabilne M= 4 u 1 1-3 s E

Metody badania fragmentacji w spektrometrze o podwójnym ogniskowaniu i geometrii BE Szczelina wejściowa Analizator magnetyczny Drugi obszar wolny od pola (II FFR) Komory zderzeń...... Widma jonów potomnych MIKES (Mass-analyzed Ion Kinetic Energy Spectrum) Analizator elektryczny...... Pierwszy obszar wolny od pola (I FFR) Szczelina wyjściowa Źródło jonów Widma jonów potomnych B/E=const. Widma jonów macierzystych B 2 /E = const. Widma jonów tracących fragment obojętny o stałej masie Powielacz elektronów Widmo EI 1-metylo-4-nitrobenzosultamu 1 117.2 228.2 9 8 147.1 N S 2 Intensity (%age) 7 6 5 4 51.1 65.3 77.2 91.2 N 2 M = 228 3 39.1 164.2 2 1 14.2 133.2 198.3 212.3 4 6 8 1 12 14 16 18 2 22 24 Low Resolution M/z

Widma jonów potomnych MIKE i CA-MIKE dla jonu 228 1 9 8 117.2 147.1 EI 228.2 Intensity (Volts).7.6.5.4.3.2 Intensity (%age) 7 6 5 4 3 2 1 39.1 65.3 91.2 14.2 164.2 198.3 4 6 8 1 12 14 16 18 2 22 24 Low Resolution M/z 164 MIKE dla jonu 228 211 227.9.1 76.5 9.4 116.9 147 6 8 1 12 14 16 18 2 22 Low Resolution M/z Intensity (Volts).55.5.45.4.35.3.25.2.15.1 5 64.5 76.3 9.6 14.3 116.9 133.1 6 8 1 12 14 16 18 2 22 Low Resolution M/z 146.9 163.9 CA-MIKE dla jonu 228 18.8 21.8 227.9 Widma jonów potomnych B/E i CA-B/E dla jonu 228 1 9 8 117.2 147.1 EI 228.2 1.2 1. Intensity (%age) 7 6 5 4 3 39.1 65.3 91.2 164.2 164.1 B/E dla jonu 228 227.9 Intensity (Volts).8.6.4.2 2 1 14.2 198.3 4 6 8 1 12 14 16 18 2 22 24 Low Resolution M/z 147.1 183 211 Intensity (Volts) 1.4 1.2 1..8.6.4.2 6 8 1 12 14 16 18 2 22 Low Resolution M/z 65.2 76.1 91.2 14.2 17.1 117.1 121.1 133.2136.2 146.2 6 8 1 12 14 16 18 2 22 Low Resolution M/z 147.1 164.1 18 CA-B/E dla jonu 228 181 197 211 227.9

Widma jonów macierzystych B 2 /E dla jonów 147 i 14 Intensity (Volts) 1.8 1.6 1.4 1.2 1..8.6.4 147.1 164.4 B 2 /E dla jonu 147 Intensity (%age) 1 9 8 7 6 5 4 3 2 1 39.1 65.3 91.2 14.2 117.2 147.1 164.2 EI 198.3 228.2 4 6 8 1 12 14 16 18 2 22 24 Low Resolution M/z.2 169.5 175.1 182 183.7 191.1194.8 24.227.9 211.7 216.3 15 16 17 18 19 2 21 22 23 Low Resolution M/z 228.4 Intensity (Volts) 8 7 6 5 4 3 2 1 14 15.1 12.5 122.2 132.1 137.8 147.4 B 2 /E dla jonu 14 166.2 2.9 24.3 212.4 1 12 14 16 18 2 22 Low Resolution M/z Widma utraty obojętnego fragmentu o masie 64 i 28 Intensity (%age) 1 9 8 7 6 5 4 3 2 1 Intensity (%age) 1 9 8 7 6 5 4 3 2 1 39.1 65.3 91.2 14.2 117.2 147.1 164.2 EI 198.3 228.2 4 6 8 1 12 14 16 18 2 22 24 Low Resolution M/z 182.4 211.1 CNL dla 64 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 Low Resolution M/z 228.7 119.1 Intensity (Volts).6.5.4.3.2.1 65 78 92 93 15 CNL dla 28 6 8 1 12 14 16 18 2 22 Low Resolution M/z

SPEKTRMETR MAS TYPU API 3 +MS2 (137.) CE (1):.31 to 1.52 min from Sample 1 (frag 137 CE 1 15 2 25) of beta... Max. 7.7e5 cps. Zależność stopnia fragmentacji od energii zderzeń + N N H H [M + H + ] = 137 7.5e5 7.e5 6.5e5 6.e5 5.5e5 5.e5 4.5e5 4.e5 3.5e5 3.e5 2.5e5 1.5e5 CE = 1V M + H + 1.e5 5.e4 16.1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 11 12 13 14 15 94.1 137.2 +MS2 (137.) CE (1): 1.93 to 2.655 min from Sample 1 (frag 137 CE 1 15 2 25) of beta... Max. 4.9e5 cps. +MS2 (137.) CE (1): 4.27 to 4.958 min from Sample 1 (frag 137 CE 1 15 2 25) of beta... Max. 3.9e5 cps. 4.9e5 4.5e5 CE = 15V 94.1 4.e5 3.8e5 3.6e5 CE = 25V 94.1 4.e5 3.4e5 3.2e5 3.5e5 3.e5 2.8e5 3.e5 2.5e5 M + H + 137.2 2.6e5 2.4e5 2.2e5 1.8e5 1.6e5 1.4e5 1.5e5 1.2e5 1.e5 44.1 1.e5 5.e4 44.1 16.1 8.e4 6.e4 4.e4 2.e4 16. M + H + 96. 137.2 2 3 4 5 6 7 8 9 1 11 12 13 14 15 2 3 4 5 6 7 8 9 1 11 12 13 14 15

Zależność stopnia fragmentacji od energii zderzeń -MS2 (227.2):.15 to 1.53 min from Sample 2 (frag 227 CE 1 15 2 25) of 1K1686.wiff,... Max. 8.2e5 cps. -MS2 (227.2): 3.5 to 4.257 min from Sample 2 (frag 227 CE 1 15 2 25) of 1K1686.wiff,... Max. 2.4e5 cps. 8.e5 7.5e5 CE = 1V [M H] 227. 2.4e5 2.2e5 CE = 2V 151. 7.e5 6.5e5 6.e5 5.5e5 5.e5 N S 2 1.8e5 1.6e5 179. [M H] 4.5e5 1.4e5 4.e5 1.2e5 227. 3.5e5 N 2 1.e5 3.e5 2.5e5 M = 228 8.e4 6.e4 9.9 14.1 1.5e5 1.e5 4.e4 5.e4 9.9 14. 15.9 2 4 6 8 1 12 14 16 18 2 22 24 179.1 2.e4 118. 65.9 132.1 161. 15.9 45. 92. 145.1 4 14 2 6 8 1 12 16 18 2 22 24 -MS2 (227.2): 1.73 to 2.955 min from Sample 2 (frag 227 CE 1 15 2 25) of 1K1686.wiff,... Max. 4.3e5 cps. -MS2 (227.2): 4.58 to 5.76 min from Sample 2 (frag 227 CE 1 15 2 25) of 1K1686.wiff,... Max. 2.6e5 cps. 4.3e5 4.2e5 4.e5 3.8e5 3.6e5 3.4e5 3.2e5 3.e5 2.8e5 2.6e5 2.4e5 2.2e5 1.8e5 1.6e5 1.4e5 1.2e5 1.e5 8.e4 6.e4 4.e4 2.e4 CE = 15V 179. 151. 91. 14. 66. 118. [M H] 2 4 6 8 1 12 14 16 18 2 22 24 227. 2.6e5 2.4e5 2.2e5 1.8e5 1.6e5 1.4e5 1.2e5 1.e5 8.e4 6.e4 4.e4 2.e4 CE = 25V 9.9 14.1 2 4 6 8 1 12 14 16 18 2 22 24 151. 46. 132. 66. 16. 121.1 161.2 92. 179. [M H] 226.9 Praca w trybie MS Spektrometr typu Q-TF Praca w trybie MS/MS

Spektrometr Q-TF z analizatorem TF typu W Widma fragmentacji peptydu (Q-TF)

Widma fragmentacji peptydu (Q-TF) Spektrometr ESI - Ion Trap firmy Agilent

Widma kolejnych fragmentacji glikozydu (pułapka jonowa LCQ; jony ujemne) Fragmentacja w źródle jonów electrospray (cone voltage fragmentation) Gaz rozpylający (N 2 ) Dysza Płytka osłonowa Ciśnienie atmosferyczne bszar fragmentacji U Zbierak Declusteringpotentiallub nozzle potential lub skimmer potential Q -- -- - -- - - - -- -- - - - - -- -- ---- - --- -- - - - ~ 2 Torr 8 x 1-3 Torr Roztwór próbki Przechodzenie jonów do fazy gazowej Gaz osłonowy (N 2 ) Pompa wstępna Pompa turbomolekularna

62.81 621.31 Cone voltage fragmentation 62.81 [M+2H + ] 2+ MARINER Nozzle potential 1V 621.81 149.2 622.31 622.81 31.15 433.24 631.81 1 36 62 88 114 14 86.41 [M+H + ] + 124.58 B 2 A 249.1 2 221.1 62.8 [M+2H + ] 2+ Y 8 86.4 MARINER Nozzle potential 28V Y 556.3 9 992.5 [M+H + ] + 176.1 631.8 719.4 642.8 124.6 Y 3 B 3 653.8 23.1 Y B 435.2 4 4 522.2 B 1262.6 386.2 499.3 565.3 611.8 8 1284.6 667.3 111.5 Y 6 Y 7 [M+Na + ] + 1 36 62 88 114 14 Widma MS/MS peptydu (M = 1239,6) B 2 A 249.1 2 221.1 62.8 [M+2H + ] 2+ Y 8 86.4 MARINER (ESI-TF) Nozzle potential 28V Y 6 Y 7 Y 556.3 9 992.5 [M+H + ] + 176.1 631.8 719.4 642.8 124.6 Y 3 B 3 653.8 23.1 Y B 435.2 4 4 522.2 B 1262.6 386.2 499.3 565.3 611.8 8 1284.6 667.3 111.5 [M+Na + ] + 1 36 62 88 114 14 249.2 B 2 [M+2H + ] 2+ 621. API 365 (ESI-QQQ) Product Ion Scan dla jonu m/z621 [M+2H + ] 2+ Y Y 8 6 86.6 Y 556.3 3 B 3 23.2 435.3 A 2 Y 7 Y 9 221.2 Y 4 B 4 719.5 992.6 386.3 522.3 54.3 667.3 B B B 6 8 A 611.8 7 3 742.3 111.5 855.4 159.3 47.4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 11 12 13 14

Chromatografia gazowa sprzężona ze spektrometrią mas GC/MS Problemy związane z techniką GC/MS Problemy aparaturowe Chromatograf gazowy Spektrometr mas Próbka w formie pary rozcieńczonej dużą ilością gazu EI: praca w wysokiej próżni CI: konieczność użycia gazu jonizującego ESI: wprowadzanie próbki w roztworze APCI:wprowadzanie próbki w roztworze rozpuszczalnika odpowiedniego do CI Problemy do rozwiązania: pozbycie się dużej ilości gazu nośnego szybkie skanowanie graniczenia dotyczące próbki Lotność(ew. po derywatyzacji) dporność na wysoką temperaturę

Budowa zestawu chromatograf gazowy spektrometr mas (GC/MS) strzykawka z próbką komora termostatowana kolumna kapilarna źródło jonów linie transmisji danych hel Chromatograf gazowy Spektrometr mas Komputer Spektrometr mas z analizatorem kwadrupolowym Źródło jonów EI Analizator kwadrupolowy Detektor do pompy do pompy sygnał do wzmacniacza

Analiza GC/MS mieszaniny wzorcowej Abundance 6.43 TIC: EVALDEM.D 9.78 35 5.28 7.74 3 25 2 15 1 5 Time--> 5.5 6. 6.5 7. 7.5 8. 8.5 9. 9.5 Abundance 6 Average of 7.713 to 7.753 min.: EVALDEM.D (-) 188 55 5 45 4 35 3 25 2 15 1 5 m/z--> 27 76 152 63 94 126 51 12 86 113 162 39 136 177 2 3 4 5 6 7 8 9 1111213141516171819 Identyfikacja związku z wykorzystaniem biblioteki widm masowych Abundance 9 Average of 7.713 to 7.753 min.: EVALDEM.D (-) 188 Widmo zmierzone 8 7 6 5 4 3 152 2 1 m/z--> Abundance 76 63 51 94 126 27 39 86 12 113 136 162 177 2 3 4 5 6 7 8 9 1111213141516171819 Widmo biblioteczne m/z--> 9 8 7 6 5 4 3 2 1 #7274: 3-Chlorobiphenyl $$ 1,1'-Biphenyl, 3-chloro- (CAS) 188 152 Cl 76 63 51 39 94 126 86 12 113 136 162 173 2 3 4 5 6 7 8 9 1111213141516171819

Chromatogram gazowy mieszaniny nitrotoluenów HN 3 H 2 S 4 N2 + 9.38 1.43 + N 2 N 2 14 6. 7. 8. 9. 1 11. α-pinen (96 %) 2. 33 ChromatogramGC/MS olejku cytrynowego. Składniki zidentyfikowano na podstawie biblioteki widm Wiley a β-pinen (97 %) 3.17 sabinen (97 %) mircen 3.33 (96%) 3.96 4.78 limonen (99 %) γ-terpinen (97%) 5.82 linalool (97%) 11.57 11.72 p-cymen (97%) α-terpinolen 6.4 (98%) 6.66 octan linalylu (91%) 12.12 α-bergamoten (98 %) 12.3 β-kariofilen (99 %) 11.5 12. 12.5 13. 13.5 14. 11.57 12.12 β-bisabolen (95 %) Z-cytral (97 %) 13.52 α-terpineol (91 %) 13.69 14.7 14.19 13.52 14.19 geranial (96%) octan geranylu (91 %) 14.45 14.45 14.5 2. 4. 6. 8. 1 12. 14. min. Liczby w nawiasach określająw procentach współczynnik zgodności widma zmierzonego i bibliotecznego

Chromatogram całkowitego prądu jonowego i chromatogram dla wybranej masy jonu Chromatogramydla wybranych mas w warunkach pomiaru wysokiej rozdzielczości

Analiza GC/MS 1-metylo-4-nitrobenzosultamu N S 2 N S 2 - S 2 N A N 2 M = 228 N 2 M = 228 N 2 M = 164 N CH 2 A N 2 M = 164 M + N CH 2 N 2 M = 164 Analiza GC/MS 4-nitrobenzosultamu H N S 2 t - S 2 N 2 N 2 8a M = 15 M = 214 N 2 NH 2 N 9a M = 3 H N Generation and Reactions of Aza-orthoxylylenesintheInjectorofGC/MS System, W. Danikiewicz, K. Wojciechowski, M. lejnik, Tetrahedron Lett., 36, 199 (1995). N 2 Abundance 38 36 34 32 3 28 26 24 22 2 18 16 14 12 1 8 6 4 2 8.3 8a 15.8 Time--> 6. 7. 8. 9. 1 11. 12. 13. 14. 15. 16. Abundance 22 2 18 16 14 12 1 8 6 39 4 2 m/z--> 51 77 91 15 N 2 M = 214 Scan 118 (15.8 min) 149 119 134 H N S 2 167 18 195 4 6 8 1 12 14 16 18 2 22 24 26 28 3 t 26 223 236? 9a 9a 251 265 283 M + M +. 3

Zastosowania techniki GC/MS Analiza składu mieszanin poreakcyjnych Badania reakcji chemicznych w fazie gazowej Analiza produktów naturalnych (np. olejki zapachowe) Identyfikacja zanieczyszczeńw lekach, kosmetykach, artykułach spożywczych itp. Analizy medyczne (np. profil kwasowy) Analizy antydopingowe Analizy kryminalistyczne (np. identyfikacja producentów narkotyków) Analizy zanieczyszczeń środowiska Chromatografia cieczowa sprzężona ze spektrometrią mas LC/MS lub HPLC/MS

Problemy związane z techniką LC/MS Problemy aparaturowe Chromatograf cieczowy Spektrometr mas Próbka w formie rozcieńczonego roztworu, często z zawartością bufora EI: praca w wysokiej próżni CI: konieczność użycia gazu jonizującego ESI: wprowadzanie próbki w roztworze APCI:wprowadzanie próbki w roztworze rozpuszczalnika odpowiedniego do CI Problemy do rozwiązania: konieczność odparowania dużej ilości rozpuszczalnika problem substancji buforujących szybkie skanowanie graniczenia dotyczące próbki Niska lotność Rozpuszczalność w wybranym rozpuszczalniku (eluencie) Trwałość w warunkach HPLC Dopasowanie rodzaju źródła jonów do warunków chromatografii cieczowej Średnica wewnętrzna kolumny chromatograficznej Przepływ eluenta Rodzaj źródła jonów 4 4,6 mm,5 1 ml/min TurboIonSpray, APCI 1-2 mm 5 2 µl/min Electrospray standardowy, APCI 1 1 µm,5 5 µl/min Microspray 1 1 µm 1 5 nl/min Nanospray Podstawowa zależność: dwukrotnie mniejsza średnica = czterokrotnie mniejszy przepływ

Warunki, które muszą być spełnione podczas pomiaru HPLC/MS Próbka musi byćwystarczająco polarna, aby ulec jonizacji w technice electrospray (ESI), ewentualnie APCI. Analiza z zastosowaniem faz odwróconych. Akceptowalne eluentyto: metanol, woda, acetonitryl, izopropanol i ich mieszaniny. Dopuszczalny jest pomiar w gradiencie składu eluenta. Kolumna z wypełnieniem najlepiej C-18, C-8 lub analogicznym, służącym do analiz w fazach odwróconych. Eluentnie może zawieraćnielotnych buforów, np. fosforanowych. Dopuszczalne sąoctan i mrówczan amonu, kwasy octowy i mrówkowy itp. lotne związki. Czas analizy nie powinien przekraczać 6 min. Uwaga: technika jonizacji APPI (fotosprej) umożliwia pracęz zastosowaniem faz normalnych, ale wymaga jeszcze dopracowania. ANALIZA ZANIECZYSZCZEŃ DIGKSYNY H H H H H H

Molecular Weight = 78.9588 Exact Mass = 78.4296 Molecular Formula = C 41 H 64 14 ANALIZA DIGKSYNY H Widmo APCI(-) digoksynyw układzie MeH-CHCl 3. Jon pseudomolekularny[m + Cl] - ulega fragmentacji tracąc kolejne reszty cukrowei zachowując jon Cl -. M + Cl - H - Q1: 14.74 to 15.247 min from CH3ClDigoxin. wiff Max. 2.6e6 cps. 2.6e6 815.6 H H H H 389.2 + 1 + 35 = 425.2 519.3 + 1 + 35 = 555.3 649.4 + 1 + 35 = 685.4 2.4e6 2.2e6 2.e6 1.8e6 1.6e6 1.4e6 555.2 685.6 817.6 78.4 + 35 = 815.4 1.2e6 1.e6 425.2 687.6 8.e5 557.6 6.e5 4.e5 427.5 649.8 211.3 47.7 667.7 797.8 295.6 389.6 779.9 519.6 537.7 2 25 3 35 4 45 5 55 6 65 7 75 8 85 9 ANALIZA DIGKSYNY Chromatogram całkowitego prądu jonowego 3.1e8 3.e8 2.8e8 2.6e8 2.4e8 2.2e8 2.e8 1.8e8 1.6e8 1.4e8 1.2e8 1.e8 8.e7 6.e7 4.e7 2.e7 TIC of -Q1: from CH3ClDigoxin.wiff 8 6.99 7.99 47.4 46.68 48.4 48.67 49.59 51 5.43 45.99 5.65 14.58 45.69 51.2 14.73 45.7 51.44 14.33 44.38 14.2 15.15 25.3 25.75 26.4 15.4 26.37 15.85 13.67 17.9 13.35 24.93 31.7 32.74 38.8 41.62 43.7 Max. 3.1e8 cps. 52.73 57.85 Chromatogramprądu jonowego wybranych jonów(jony [M+Cl] - digoksyny i acetylodigoksyny) 8.4e7 8.e7 7.5e7 7.e7 6.5e7 6.e7 5.5e7 5.e7 4.5e7 4.e7 3.5e7 3.e7 2.5e7 2.e7 1.5e7 1.e7 5.e6 5 1 15 2 25 3 35 4 45 5 55 Time, min XIC of -Q1: 856. to 86 amu from CH3ClDigoxin.wiff, Added <XIC of -Q1: 815. to 819. amu fro... Max. 8.4e7 cps. 14.9 14.63 14.41 14.83 15.15 25.3 24.93 13.74 22. 25.63 26.9 13.42 26.42 21.6 16.87 27.76 7.77 8.61 5.26 29.84 2.6 38.2 38.82 5 1 15 2 25 3 35 4 45 5 55 Time, min

Widma masowe APCI(-) digoksyny (M= 78,4) i jej pochodnej acetylowej -Q1: 14.74 to 15.18 min from CH3ClDigoxin.wiff 816. 2.7e6 2.6e6 2.4e6 2.2e6 2.e6 1.8e6 Digoksyna 685.6 Max. 2.7e6 cps. [M + Cl] - 1.6e6 Molecular Weight = 78.9588 Exact Mass = 78.4296 Molecular Formula = C 41 H 64 14 H H H H 519.3 + 1 + 35 = 555.3 649.4 + 1 + 35 = 685.4 78.4 + 35 = 815.4 H H 389.2 + 1 + 35 = 425.2 1.4e6 1.2e6 1.e6 8.e5 6.e5 4.e5 211.3 425.2 555.2 2 3 4 5 6 7 8 9 1 -Q1: 25.98 to 26.137 min from CH3ClDigoxin.wiff 1.5e6 1.4e6 1.3e6 1.2e6 1.1e6 1.e6 9.e5 8.e5 7.e5 6.e5 Pochodna acetylowa digoksyny 688.7 47.7 537.7 649.8 667.7 779.9 797.8 425.3 555.5 557.6 685.6 819. [MAc+ Cl] - M= 42 857.8 Max. 1.5e6 cps. 5.e5 4.e5 3.e5 1.e5 861. 816. 688.6 537.7 667.6 727.8 428.4 519.6 597.5 775.9 311.5 839.8 899.8 295.5 389.7 2 3 4 5 6 7 8 9 1 Widma masowe APCI(-) digoksyny (M= 78,4) i jej pochodnej acetylowej -Q1: 14.74 to 15.18 min from CH3ClDigoxin.wiff 815.6 2.7e6 2.6e6 2.4e6 2.2e6 2.e6 1.8e6 Digoksyna 685.6 Max. 2.7e6 cps. [M + Cl] - 1.6e6 Molecular Weight = 78.9588 Exact Mass = 78.4296 Molecular Formula = C 41 H 64 14 H Ac H H 519.3 + 1 + 35 = 555.3 649.4 + 1 + 35 = 685.4 H H 389.2 + 1 + 35 = 425.2 78.4 + 42 + 35 = 857.4 1.4e6 1.2e6 1.e6 8.e5 6.e5 4.e5 211.3 425.2 555.2 2 3 4 5 6 7 8 9 1 -Q1: 25.98 to 26.137 min from CH3ClDigoxin.wiff 1.5e6 1.4e6 1.3e6 1.2e6 1.1e6 1.e6 9.e5 8.e5 7.e5 6.e5 Pochodna acetylowa digoksyny 688.7 47.7 537.7 649.8 667.7 779.9 797.8 425.3 555.5 557.6 685.6 819. [MAc+ Cl] - M= 42 857.8 Max. 1.5e6 cps. 5.e5 4.e5 3.e5 1.e5 861. 816. 688.6 537.7 667.6 727.8 428.4 519.6 597.5 775.9 311.5 839.8 899.8 295.5 389.7 2 3 4 5 6 7 8 9 1

Widma masowe APCI(-) digoksyny (M= 78,4) i jej pochodnej acetylowej -Q1: 14.74 to 15.18 min from CH3ClDigoxin.wiff 816. 2.7e6 2.6e6 2.4e6 2.2e6 2.e6 1.8e6 Digoksyna 685.6 Max. 2.7e6 cps. [M + Cl] - 1.6e6 Molecular Weight = 78.9588 Exact Mass = 78.4296 Molecular Formula = C 41 H 64 14 Ac H H H 519.3 + 1 + 35 = 555.3 649.4 + 1 + 35 = 685.4 H H 389.2 + 1 + 35 = 425.2 78.4 + 42 + 35 = 857.4 1.4e6 1.2e6 1.e6 8.e5 6.e5 4.e5 211.3 425.2 555.2 2 3 4 5 6 7 8 9 1 -Q1: 25.98 to 26.137 min from CH3ClDigoxin.wiff 1.5e6 1.4e6 1.3e6 1.2e6 1.1e6 1.e6 9.e5 8.e5 7.e5 6.e5 Pochodna acetylowa digoksyny 688.7 47.7 537.7 649.8 667.7 779.9 797.8 425.3 555.5 557.6 685.6 819. [MAc+ Cl] - M= 42 857.8 Max. 1.5e6 cps. 5.e5 4.e5 3.e5 1.e5 861. 816. 688.6 537.7 667.6 727.8 428.4 519.6 597.5 775.9 311.5 839.8 899.8 295.5 389.7 2 3 4 5 6 7 8 9 1 WYKRYWANIE PACLITAXELU (TAKSLU) W MATERIALE BILGICZNYM NHBz Ac H H H H Bz Ac

Wykrywanie taksolu w materiale biologicznym +Q1:.1 to 1.2 min from Sample 1 (widmoq+) of taxol.wiff 4.3e6 4.2e6 4.e6 3.8e6 3.6e6 3.4e6 3.2e6 3.e6 2.8e6 2.6e6 2.4e6 2.2e6 2.e6 1.8e6 1.6e6 1.4e6 1.2e6 1.e6 8.e5 Widmo ESI(+) próbki taksolu 31.3 531 413.4 384.2 337.4 396.2 468.2 Max. 4.3e6 cps. 6.e5 4.e5 324.4367.3 86.5 243.3285.3 49.3 421.4 898.6 591.4 257.2 381.3 398.3 485.4 531.4 757.4 854.5 974.6 2 3 4 5 6 7 8 9 1 876.4 [M + Na + ] + NHBz H Ac H H Bz Ac H Paclitaxel(taksol) M = 853.3 +Product (876.5): 1.32 to 1.753 min from Sample 2 (fragmentacja 876.5 CE 35) of taxol.wiff 1.9e5 1.8e5 1.7e5 1.6e5 1.5e5 1.4e5 1.3e5 1.2e5 1.1e5 1.e5 9.e4 8.e4 7.e4 6.e4 5.e4 4.e4 3.e4 2.e4 1.e4 14.9 38.2 531.2 49.4 59.4 547.3 35.3 469.1 591.4 Widmo CID jonu [M + Na + ] + taksolu Max. cps. 876.4 5 1 15 2 25 3 35 4 45 5 55 6 65 7 75 8 85 9 694.2 Wykrywanie taksolu w materiale biologicznym TIC of +Q1: from Sample 1 (powtorka1) of 13HPLC.wiff Max. 9.4e7 cps. 9.4e7 9.e7 5.51 Chromatogram całkowitego prądu jonowego badanej mieszaniny 8.5e7 8.e7 7.5e7 7.e7 6.5e7 6.e7 5.5e7 5.e7 4.5e7 4.e7 3.5e7 3.e7 3.43 9.18 8.93 11.9 26.71 17.44 27.14 26.15 34.63 34.2 12.33 17.74 35.25 2.66 7.5 9.63 23.14 24.65 27.38 33.68 17.4 21.45 35.47 27.59 2.88 14.79 28.13 33.24 36.2 33.93 34.95 2.5e7 2.e7 1.5e7 1.e7 5.e6 2 4 6 8 1 12 14 16 18 2 22 24 26 28 3 32 34 36 38 Time, min Base Peak Chrom. of +Q1: from Sample 1 (powtorka1) of 13HPLC.wiff Max. 4.2e6 cps. 4.2e6 5.51 Chromatogram maksymalnych pików badanej mieszaniny 4.e6 3.8e6 3.6e6 3.4e6 3.2e6 3.e6 2.8e6 2.6e6 2.4e6 2.2e6 2.e6 1.8e6 1.6e6 1.4e6 1.2e6 1.e6 8.e5 6.e5 4.e5 5.34 5.68 9.18 11.78 11.96 17.44 26.64 34.45 2 4 6 8 1 12 14 16 18 2 22 24 26 28 3 32 34 36 38 Time, min 26.44 9.45 26.3 17.31 12.26 17.12 26.1 8.9 17.86 3.43 33.71 17.63 2.68 7. 27.59 2.19 16.94 24.91 12.53 9.73 33.46 22.57 24.51 35.64 2.64 27.83.49 14.11 32.97 26.84 27.8 27.29 34.8 33.88 34.95 35.17 35.4

WYKRYWANIE TAKSLU W MATERIALE BILGICZNYM XIC of +Q1: 875. to 877. amu from Sample 1 (powtorka1) of 13HPLC.wiff Max. 2.2e5 cps. Chromatogramjonu m/z876,4 badanej mieszaniny 2.1e5 1.9e5 1.8e5 1.7e5 1.6e5 1.5e5 1.4e5 1.3e5 1.2e5 1.1e5 1.e5 9.e4 8.e4 7.e4 6.e4 5.e4 4.e4 3.e4 2.e4 1.e4.42 2.23 7.17 8.86 13.97 18.56 18.87 2 4 6 8 1 12 14 16 18 2 22 24 26 28 3 32 34 36 38 Time, min 19.5 19.92 14.98 23.47 11.1 18.31 2.16 18.25 24.21 5.29 11.16 28.6 29. 2.7 31.38 9.87 33.48 35.97 +Q1: 18.531 to 238 min from Sample 1 (powtorka1) of 13HPLC.wiff, subtracted (12.884 to 1... Max. 5.9e4 cps. Widmo masowe (po odjęciu tła) dla piku z powyższego chromatogramu 5.9e4 5.5e4 5.e4 4.5e4 4.e4 3.5e4 3.e4 2.5e4 2.e4 1.5e4 1.e4 5 899.1 86 513.6 97.2 766.9 327.5 832. 965.4 243.5 771.7 94. 13.2 282.6 875.8 368.3 585.5 212.4 541.5 719.7 787.8 146.4 256.6 919.7 943.1 32.4 431.7 536.7 58.6 229.7 163.4 277.4 68.6 877.9 55.3 727.6 793.9 927. 987.1 528.9 179.3 1144.7 2 3 4 5 6 7 8 9 1 11 12 811. 816. 854.9 Wykrywanie taksolu w materiale biologicznym +Q1:.1 to 1.2 min from Sample 1 (widmoq+) of taxol.wiff 4.3e6 4.2e6 4.e6 3.8e6 3.6e6 3.4e6 3.2e6 3.e6 2.8e6 2.6e6 2.4e6 2.2e6 2.e6 1.8e6 1.6e6 1.4e6 1.2e6 1.e6 8.e5 Widmo ESI(+) próbki taksolu 31.3 531 413.4 384.2 337.4 396.2 468.2 Max. 4.3e6 cps. 6.e5 4.e5 324.4367.3 86.5 243.3285.3 49.3 421.4 898.6 591.4 257.2 381.3 398.3 485.4 531.4 757.4 854.5 974.6 2 3 4 5 6 7 8 9 1 876.4 [M + Na + ] + NHBz H Ac H H Bz Ac Paclitaxel(taksol) M = 853.3 +Product (876.5): 1.32 to 1.753 min from Sample 2 (fragmentacja 876.5 CE 35) of taxol.wiff 1.9e5 1.8e5 1.7e5 1.6e5 1.5e5 1.4e5 1.3e5 1.2e5 1.1e5 1.e5 9.e4 8.e4 7.e4 6.e4 5.e4 4.e4 3.e4 2.e4 1.e4 14.9 38.2 531.2 49.4 59.4 547.3 35.3 469.1 591.4 H Widmo CID jonu [M + Na + ] + taksolu Max. cps. 876.4 5 1 15 2 25 3 35 4 45 5 55 6 65 7 75 8 85 9 694.2

Wykrywanie taksolu w materiale biologicznym XIC of +MRM (12 pairs): 876.5/591.4 amu from Sample 2 (powtorka2) of 13HPLC.wiff Max. 12 cps. XIC of +MRM (12 pairs): 876.5/531.2 amu from Sample 2 (powtorka2) of 13HPLC.wiff Max. 14 cps. 12 11 1 9 8 4.48 14 Chromatogram MRM 876 591 13 Chromatogram MRM 876 531 4.41 12 11 1 9 13.89 7 6 5 8 7 6 26.56 4 3 2 4.62 1.67 7.4 9.18 1.32 4.87 7.61 13.17 19.542 2.7 22.57 26.22 5 4 3 2 2.58 4.56 4.75 1.57 2. 5.11 11.49 16.7 17.2 23.74 1 3.15 3.55 5.97 11.83 15.72 18.11 24.63 26.5 1.63 7.29 9.33 14.64 17.52 19.94 2.82 25.55 2 4 6 8 1 12 14 16 18 2 22 24 26 28 Time, min 2 4 6 8 1 12 14 16 18 2 22 24 26 28 Time, min XIC of +MRM (12 pairs): 876.5/38.2 amu from Sample 2 (powtorka2) of 13HPLC.wiff 4 38 36 34 32 3 28 26 24 22 2 18 16 14 12 1 8 6 4 2 3.76 4.39 4.66 Chromatogram MRM 876 38 8.66 Max. 4 cps. 2 4 6 8 1 12 14 16 18 2 22 24 26 28 Time, min XIC of +MRM (12 pairs): 876.5/591.4 amu from Sample 2 (powtorka2) of 13HPLC.wiff 4 38 36 34 32 3 28 26 24 22 2 18 16 14 12 1 8 6 4 2 4.48 Nałożone chromatogramymrm Max. 12 cps. 4.62 1.67 7.4 9.18 1.32 13.17 19.542 2.7 22.57 26.22 3.153.55 5.97 11.83 15.72 18.11 25.74 26.66 2 4 6 8 1 12 14 16 18 2 22 24 26 28 Time, min Zastosowania techniki LC/MS Analiza składu mieszanin poreakcyjnych Analiza białek i produktów ich hydrolizy enzymatycznej Identyfikacja zanieczyszczeńw lekach, kosmetykach, artykułach spożywczych itp. Analizy medyczne(np. oznaczanie stężenia leków i ich metabolitów we krwi) Analizy antydopingowe Analizy kryminalistyczne (np. identyfikacja producentów narkotyków) Analizy zanieczyszczeń środowiska