Kreatynina Kwas moczowy

ROZDZIŁ 18 Kreatynina Kwas moczowy Barbara Posielężna Dorota Polańska Pierwszym sygnałem upośledzenia czynności nerek obserwowanym w badaniach laboratoryjnych jest wzrost stężenia azotu pozabiałkowego w surowicy krwi. zot pozabiałkowy osocza krwi (RN rest nitrogen) stanowi sumę azotu zawartego w moczniku, kreatyninie, kwasie moczowym, amoniaku i w aminokwasach. Ostra niewydolność nerek jest stanem, w którym dochodzi do upośledzenia funkcji nerek i niedostatecznej eliminacji z organizmu produktów przemiany materii: mocznika, kreatyniny i kwasu moczowego. Kreatynina powstaje w wyniku rozpadu fosfokreatyny i w warunkach prawidłowych jest wydalana w całości przez nerki. Wzrost jej stężenia w surowicy krwi jest czułym wskaźnikiem niewydolności nerek. Wielkość przesączania kłębuszkowego GFR (ang. Glomelural Filtration Rate) określa się najczęściej na podstawie wskaźnika oczyszczania osocza z endogennej kreatyniny czyli klirensu kreatyniny. Klirens (wskaźnik oczyszczania) jest to jednostka objętości osocza (ml) oczyszczonego całkowicie z danej substancji w jednostce czasu. Klirens wyrażamy w ml/s lub ml/min. U osób zdrowych klirens endogennej kreatyniny wynosi ok.120 ml/min. W diagnostyce ma zastosowanie znormalizowana wartość GFR tzw. NGFR, 259

którą uzyskujemy przeliczając wartość klirensu endogennej kreatyniny na standardową powierzchnię ciała 1,73 m 2. Cystatyna C jest markerem szybkości filtracji kłębuszkowej. Jej stężenie we krwi zależy jedynie od wielkości GFR, dzięki czemu jest specyficznym markerem funkcji nerek. Cystatyna C jest nieglikozylowanym białkiem o m. cz. 13.3 kda, o pojedynczym łańcuchu z dwoma wiązaniami dwusiarczkowymi. Należy do grupy inhibitorów proteinaz cysteinowych. Jest produkowana przez wszystkie jądrzaste komórki organizmu i wydzielana do przestrzeni pozakomórkowej w niezmiennych ilościach. Jest filtrowana w kłębuszkach nerkowych a w komórkach cewek proksymalnych reabsorbowana i katabolizowana. Wartości prawidłowe w surowicy wynoszą: 0,54-1,21 mg/l (zakres ten może się zmieniać w zależności od zastosowanej metody oznaczania). W przypadkach uszkodzenia nerek (przewlekłe zapalenie kłębuszków nerkowych, zespół nerczycowy, nefropatia cukrzycowa) obserwujemy szybki wzrost jej stężenia, poprzedzający wzrost stężenia kreatyniny w surowicy. Wzrost stężenia cystatyny C następuje już przy niewielkim obniżeniu szybkości filtracji kłębuszkowej. Jest więc parametrem o większej czułości niż kreatynina, której znamienny wzrost stężenia w osoczu/surowicy krwi następuje dopiero, gdy GFR obniży się do około połowy wartości prawidłowego stężenia kreatyniny. Do oznaczeń stężenia cystatyny C potrzebna jest tylko jedna próbka surowicy/osocza heparynizowanego. W przypadku oznaczania klirensu kreatyniny, oprócz próbki surowicy/osocza konieczne jest wykonanie dobowej zbiórki moczu pobranej według ścisłych wskazań lekarza oraz ograniczenie wysiłku fizycznego w dniu poprzedzającym badanie. Stężenie cystatyny C nie zależy od masy mięśniowej i diety, czyli czynników, które w istotny sposób wpływają na stężenie kreatyniny. Ponadto, metody pomiaru cystatyny C nie są podatne na interferencje analityczne ze strony substancji obecnych w badanych próbkach, jak np. bilirubiny czy kwasu askorbinowego. Cystatyna C jest też lepszym markerem GFR u chorych z zaawansowaną niewydolnością nerek, ponieważ w odróżnieniu od kreatyniny nie następuje jej wzmożone wydzielanie przez cewki nerkowe. Zalety cystatyny C: wysoka czułość stężenie zależne tylko od GFR tylko jedna próbka krwi 260

stanowią iż, cystatyna C jest idealnym markerem wykorzystywanym do monitorowania wartości GFR u dzieci, u pacjentów w podeszłym wieku, u chorych leczonych lekami nefrotoksycznymi, a także do monitorowania wartości GFR u pacjentów po przeszczepie nerki. Oznaczanie cystatyny C istotnie zwiększa trafność diagnoz dotyczącących szybkości filtracji kłębuszkowej, co może przyczynić się do wcześniejszego rozpoznania i podjęcia szybkiego leczenia, poprawiając rokowania chorych z przewlekłą niewydolnością nerek. Jednakże zdania są podzielone, co do potrzeby ciągłego monitorowania jej stężenia. Wprawdzie oznaczenie stężenia cystatyny C jest dobrym wskaźnikiem udanego przeszczepu nerki, lecz lepszym wskaźnikiem ostrego odrzucenia przeszczepu jest oznaczenie stężenia kreatyniny. Nie bez znaczenia jest również wysoki koszt badania, oznaczanie cystatyny C wykonuje się metodą immunonefelometryczną (PENI- particle enhaned nefelometric immunoassay), wykorzystując zautomatyzowane nefelometry. Oznaczanie stężenia kreatyniny jest tanie i proste do wykonania, dlatego jest zalecane do badania chorych z zaawansowaną niewydolnością nerek. Endogenna kreatynina oraz inulina (polifruktoza) są całkowicie przesączane w kłębkach i nie podlegają przemianom kanalikowym, dlatego wykorzystuje się je do oceny przesączania kłębuszkowego (GFR). Co prawda klirens inuliny jest złotym standardem wyznaczania GFR, lecz wykonuje się go rzadko ze względu na wysoką cenę badania i ograniczenie jego stosowania u pacjentów z cukrzycą. Z kolei kreatynina częściowo ulega wydzielaniu kanalikowemu, co fałszywie podwyższa GFR. Normalnie w ten sposób wydzielane jest 10-40% kreatyniny. W wydzielaniu bierze udział transporter dla kationów organicznych występujący w kanaliku proksymalnym. Ta droga transportu ulega wysyceniu przy stężeniu kreatyniny w osoczu wynoszącym 1,5-2,0 mg/dl. Z kolei u osób z zaawansowaną niewydolnością nerek, część kreatyniny jest rozkładana w jelitach przez bakteryjną kreatyninazę. Powoduje to zawyżenie klirensu o około 15 ml/min/1,73 m 2. Natomiast paraaminohipuran sodu (PH) wykorzystuje się do oceny przepływu krwi przez nerki - RBF (ang. Renal blood flow). Przy prawidłowym stężeniu kreatyniny w surowicy jest ona w całości przesączana w kłębuszku. Oznaczanie klirensu endogennej kreatyniny jest dogodną metodą kliniczną oceny szybkości przesączania kłębuszkowego. Kreatynina powstaje w mięśniach przez nieenzymatyczne i nieodwracalne odszczepienie cząsteczki wody z fosfokreatyny i kreatyny. Biosynteza kreatyny zachodzi w wątrobie i w nerkach z udziałem aminokwasów: argininy, glicyny i metioniny wg. schematu zamieszczonego na rys. 18.2. Jednak w większej części kreatyna jest dostarczana z pokarmem ponieważ znajduje się w produktach mięsnych. Może być wchłaniana z przewodu pokarmowego i 261

transportowana do mięśni. Zwiększona podaż kreatyny z pokarmem powoduje także jej zwiększoną konwersję do kreatyniny. Stężenie kreatyniny w surowicy jest wypadkową trzech parametrów: szybkości wydalania kreatyniny z moczem, szybkości jej wytwarzania z fosfokreatyny i kreatyny głównie mięśni szkieletowych, całkowitej objętości wody ustrojowej. Wzrost stężenia kreatyniny w surowicy obserwujemy: przy spadku przesączania kłębkowego (spadek GFR o 50%, powoduje wzrost stężenia przekraczający górny zakres wartości referencyjnych), przy spożyciu mięsa o dużej zawartości kreatyny, we wzmożonym wysiłku fizycznym. Należy pamiętać, że stężenie kreatyniny w osoczu można interpretować wyłącznie u pacjentów ze stabilną funkcją nerek. Przy gwałtownie narastającej niewydolności stężenie kreatyniny w surowicy nie zdąży wzrosnąć i nie odzwierciedla stopnia niewydolności. Wzrost stężenia kreatyniny w surowicy prowadzi do sekrecji cewkowej kreatyniny, wówczas klirens będzie podwyższony w stosunku do filtracji kłębkowej. Spadek stężenia kreatyniny w surowicy obserwujemy przy zmniejszonej masie mięśniowej, w starszym wieku, przy stosowaniu diety niskobiałkowej, w niedożywieniu. Rysunek 18.1. Relacja pomiędzy stężeniem kreatyniny w surowicy a GFR. Warto zwrócić uwagę,że początkowo niewielkie podwyższenie stężenia kreatyniny w osoczu związane jest z gwałtownym obniżeniem GFR. 262

Wzrost wydalania kreatyniny z moczem obserwujemy w przypadku jej zwiększonej produkcji oraz w akromegalii. Spadek wydalania kreatyniny z moczem obserwujemy przy: rozwijającej się niewydolności nerek, nadczynności tarczycy, niedokrwistości hemolitycznej, stosowaniu leków o ubocznym działaniu nefrotoksycznym, stosowaniu leków zmniejszających przepływ nerkowy lub hamujących kanalikową sekrecję kreatyniny. W celu oznaczenia klirensu kreatyniny należy zebrać dobową zbiórkę moczu (DZM), pobrać krew pod koniec zbiórki moczu i oznaczyć stężenie kreatyniny we krwi i w moczu. Klirens kreatyniny obliczamy ze wzoru: C cr gdzie: C u V u C s CU (mg/ml) VU (ml) C (mg/ml) 1440(min.) S - stężenie kreatyniny w moczu - objętość moczu z DZM - stężenie kreatyniny w surowicy (osoczu) 263

nerka GLY amidynotransferaza glicynowa RG Ornityna wątroba guanid ynooctan (glikocyjamina) + CH 3 met ylotransferaza gua nidynooctanowa mięśnie KRETYN +TP kinaza kreatynowa FOSFOKRETYN -H O 2 etap nieenzymatyczny nieodwracalny -P i KRETYNIN Rycina 18.2. Synteza kreatyny i kreatyniny Interpretacja klirensu kreatyniny jest możliwa gdy: badany ma w dłuższym czasie stałą masę mięśniową, dobowa zbiórka moczu jest bardzo dokładna, a mocz przechowywany jest w odpowiedniej temperaturze (wzrost temperatury powoduje wzmożoną konwersję kreatyny do kreatyniny nawet o 20%). Zaniżone wyniki oznaczania klirensu kreatyniny występują przy: niedokładnej dobowej zbiórce moczu, 264

w obecności kwasu askorbinowego, białkomoczu. Materiałem biologicznym do oznaczania stężenia kreatyniny może być: surowica, heparynizowane osocze i mocz. Metoda oznaczenia jest oparta na reakcji Jaffe`go, w której kreatynina w środowisku alkalicznym tworzy z pikrynianem barwny związek. Natężenie powstałego zabarwienia mierzy się kolorymetrycznie. W metodzie tej interferuje wiele substancji chromogennych (białka, kwas moczowy, kwas askorbinowy, acetooctan w kwasicy ketonowej), podwyższając wynik nawet o 20%. Referencyjną metodą oznaczania kreatyniny jest metoda enzymatyczna. Zasada oznaczenia oparta jest na sprzężonych reakcjach: w pierwszej reakcji enzym amidohydrolaza kreatyninowa (kreatyninaza) katalizuje przekształcenie kreatyniny do kreatyny, w drugiej reakcji katalizowanej przez kreatynazę kreatyna przekształca się do sarkozyny (Nmetylglicyny) i mocznika. Następnie sarkozyna w obecności oksydazy sarkozynowej przekształca się do glicyny i formaldehydu z wytworzeniem nadtlenku wodoru. Powstający nadtlenek wodoru jest oznaczany w reakcji z pochodną fenolu i z 4-aminofenazonem w obecności peroksydazy, w wyniku której powstaje pochodna benzochinonoiminy barwy czerwonej. Intensywność jej zabarwienia mierzona przy długości fali 546 nm jest proporcjonalna do stężenia kreatyniny w badanej surowicy. Kwas moczowy Stanowi końcowy etap metabolizmu endo- i egzogennych puryn u człowiekapowstawanie kwasu moczowego z nukleozydów purynowych zachodzi wg schematu (rys. 18.3.). U niższych naczelnych jest utleniany w obecności urykazy (oksydazy moczanowej) do alantoiny, która jest lepiej rozpuszczalna w wodzie. U człowieka ze względu na zmiany strukturalne genu ludzkiego homologu urykazy, które prowadzą do braku jego ekspresji (staje się pseudogenem) dochodzi do niemożności przekształcenia kwasu moczowego do allantoiny. W efekcie stężenie kwasu moczowego w osoczu jest bliskie granicy jego rozpuszczalności, a w moczu mamy praktycznie stale do czynienia z roztworem przesyconym. 265

Przy prawidłowym ph płynów ustrojowych obecne są zarówno kwas moczowy, jak i moczan sodowy: ph 5.75 - przewaga moczanu sodowego ph = 5.75 - równowaga ph 5.75 - przewaga kwasu moczowego Fizjologiczne ph moczu jest zwykle niższe niż pk kwasu moczowego, stąd związek ten w moczu występuje głównie w postaci niezjonizowanego kwasu. Wzrost ph powoduje wzrost rozpuszczalności, co ma duże znaczenie w transporcie kanalikowym. W ph 7.0 rozpuszczalność kwasu moczowego wynosi 1600 mg/l, a w ph 5.0-60 mg/l. Stężenie kwasu moczowego w surowicy krwi to wypadkowa prędkości degradacji nukleotydów purynowych i nerkowego wydalania kwasu moczowego. Zaburzenia metabolizmu puryn są związane z hiperurykemią i hipourykemią. Hiperurykemia to wzrost stężenia kwasu moczowego w surowicy powyżej 7 mg/dl. W 20% związana jest z nadprodukcją kwasu moczowego a w 80% z zaburzeniami jego wydalania. Hiperurykemia z nadmiernym wytwarzaniem kwasu moczowego (wzrost syntezy de novo): zespół Lesch-Nyhana całkowity lub częściowy brak enzymu HGPRT-azy (hipoksantynoguaninofosforybozylotransferazy) katalizującego resyntezę nukleotydów, choroba von Gierkiego niedobór enzymu glukozo-6-fosfatazy,wzmożone wytwarzanie rybozo-5-fosforanu prekursora PRPP(5`-fosforybozylopirofosforanu). Hiperurykemia z prawidłową produkcją kwasu moczowego, lecz zaburzonym jego wydalaniem: odwodnienie (zmniejszenie objętości krwi krążącej) prowadzące do obniżenia perfuzji nerek tzw. niewydolność przednerkowa, choroby miąższu nerek np. zapalenie odkłębkowe, kwasica ketonowa i mleczanowa prowadzą do zaburzenia sekrecji cewkowej kwasu moczowego. Ponadto hiperurykemia może towarzyszyć: łuszczycy i chorobom nowotworowym (wzmożona biosynteza kwasu moczowego), gwałtownemu rozpadowi tkanek (rozpad nowotworu pod wpływem chemioterapii), nadmiernej podaży puryn w diecie. Hipourykemia - obniżone stężenie kwasu moczowego w surowicy poniżej 3 mg/dl w wyniku: zahamowania reabsorpcji kanalikowej i wzrost wydalania przez nerki, 266

defektu oksydazy ksantynowej lub jej hamowania allopurinolem, tiopuryną lub febuxostatem, stosowania diety nisko lub bezpurynowej. DENOZYN NH 3 Deaminaza adenozyno wa INOZYN GUNOZYN P i Ryb-1 P Fosforylaza nukleozydów purynowych P i Ryb-1 P HIPOKSNTYN GUNIN Oksydaz a ksantynowa O 2 NH 3 Deaminaza guaninowa KSNTYN Oksydaza ksantynowa O 2 KWS MOCZOWY Rycina 18.3. Powstawanie kwasu moczowego z nukleozydów purynowych. W płynie pozakomórkowym kwas moczowy występuje jako sól sodowa w stężeniu bliskim stanu nasycenia roztworu. Jeżeli stężenie kwasu moczowego przekroczy górne wartości referencyjne to może nastąpić krystalizacja moczanu. Jednostką chorobową charakteryzującą się podwyższonym stężeniem kwasu moczowego w surowicy krwi jest skaza moczanowa (dna 267

moczanowa). Ostry stan zapalny dotyczy najczęściej stawu śródstopno-paliczkowego (podagra), stawów kciuka (chiragra) i stawu kolana (gonagra). Przyczyną napadów bólowych i destrukcji stawów w przebiegu dny moczanowej jest wytrącanie się kryształów moczanu sodowego w tkankach bradytroficznych. Wydalanie kwasu moczowego: 75% - całkowitej puli powstającego w ciągu doby kwasu moczowego wydala się z moczem, a 25% - przechodzi do przewodu pokarmowego i rozkładane jest przez bakterie jelitowe. Metody oznaczania stężenia kwasu moczowego w surowicy krwi i w moczu Metoda enzymatyczna - oparta na dwóch sprzężonych reakcjach. Kwas moczowy w obecności urykazy utlenia się do alantoiny i powstaje nadtlenek wodoru, który w obecności aminoantypiryny i dichlorofenolu oraz enzymu peroksydazy daje barwny związek czerwieni chinonowej. Natężenie zabarwienia mierzymy kolorymetrycznie i jest ono wprost proporcjonalne do stężenia kwasu moczowego. Metoda kolorymetryczna oparta jest na reakcji, w której kwas moczowy w obecności węglanu sodowego redukuje kwas fosforowolframowy do błękitu wolframowego. 268

ĆWICZENI PRKTYCZNE ĆWICZENIE 1 Oznaczanie stężenia kreatyniny w surowicy i w moczu ZSD METODY Podstawą oznaczenia jest reakcja Jaffe go, w której kreatynina w środowisku zasadowym redukuje żółty kwas pikrynowy do pomarańczowego kwasu pikraminowego. Natężenie powstałego zabarwienia jest proporcjonalne do zawartości kreatyniny w badanej próbce. MTERIŁ BDNY surowica rozcieńczony mocz ODCZYNNIKI 1. Odczynnik roboczy (kwas pikrynowy 0,035 mol/l zmieszany w stosunku 1:1 z r-rem NaOH o stężeniu 1,6 mol/l) 2 Wzorzec kreatyniny 2mg/dl WYKONNIE Mocz używany do oznaczenia jest rozcieńczony 50-krotnie. Oznaczenie wykonać wg schematu: Składnik próby (ml) Próba badana Próba Próba surowica Mocz wzorcowa odczynnikowa surowica 0,1 - - - rozcieńczony mocz - 0,1 - - wzorzec kreatyniny - - 0,1 - woda destylowana - - - 0,1 odczynnik roboczy* 1,0 1,0 1,0 1,0 Wymieszać i pozostawić na 20 minut w temperaturze pokojowej. Zmierzyć absorbancję próby badanej i próby wzorcowej względem próby odczynnikowej przy długości fali 520 nm. 269

OBLICZENI Stężenie kreatyniny (c s ) w surowicy obliczyć wg wzoru: C S B W 2( mg / dl) lub C S B W 177( mol / l) Stężenie kreatyniny (c u ) w moczu obliczyć wg wzoru: C u B W 100( mg / dl) lub C u B W 8,84( mmol / l) Klirens kreatyniny (C cr ) obliczyć wg wzoru: C cr CU (mg/ml) VU (ml) C (mg/ml) 1440(min.) S gdzie: V u (ml) cakowita objętość moczu wydalona przez pacjenta w ciągu 24 h 1440 (min) czas dobowej zbiórki moczu ĆWICZENIE 2 Oznaczanie stężenia kwasu moczowego w surowicy ZSD METODY Kwas moczowy w obecności urykazy utlenia się do alantoiny i powstaje nadtlenek wodoru, który w obecności aminoantypiryny i dichlorofenolu oraz peroksydazy daje barwny związek czerwieni chininowej. MTERIŁ BDNY surowica ODCZYNNIKI Odczynnik R 1 (bufor fosforanowy ph 7,4 100mmol/l, EHSPT 0,72 mmol/l żelazicyjanek 30 µmol/l. 4-aminoantypiryna 0,37 mmol/l, urykaza 150 U/l, peroksydaza 1200U/l odczynnik R 2 stabilizator reakcji wzorzec: kwas moczowy o stężeniu 5 mg/dl 270

WYKONNIE Oznaczenie wykonać wg schematu: Składnik próby (ml) Próba badana Próba wzorcowa Próba odczynnikowa odczynnik R 1 1,0 1,0 1,0 odczynnik R 2 1,0 1,0 1,0 wzorzec kwasu moczowego - 0,05 - próba badana 0,05 - - Woda - - 0,05 Wymieszać i pozostawić w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Po tym czasie odczytać absorbancję próby badanej i próby wzorcowej względem próby odczynnikowej przy długości fali 550 nm. OBLICZENI Stężenie (c) kwasu moczowego w próbie badanej obliczyć wg wzorów: B CS (5 mg / dl ) W lub B C= S 297,4 (μμmo / l) W 271