II rok BIOTECHNOLOGII METABOLIZM ZWIĄZKÓW LIPIDOWYCH Rok akademicki 2018/2019 Lipoksygenazy Lipoksygenazy to grupa niehemowych enzymów z grupy oksydoreduktaz (EC 1.13.11.12), które utleniają wielonienasycone kwasy tłuszczowe zawierające 1,4-dienową strukturę do odpowiednich pochodnych. Głównymi produktami tej reakcji są sprzężone nienasycone kwasy tłuszczowe i wodoronadtlenki. Generowane przez lipooksygenazę wodoronadtlenki stanowią substraty działania kolejnych enzymów, takich jak: liazy, izomerazy wodoronadtlenkowe czy peroksygenazy. Początkowe produkty działanie LOX mogą być degradowane do różnych związków. W komórkach zwierzęcych podstawowym substratem LOX jest kwas arachidonowy, uwalniany z cząsteczek fosfolipidów błonowych przez PLA 2. Kwas arachidonowy (C20:4) może być metabolizowany także przez cyklooksygenazę lub monooksygenazę epoksygenazę. Cyklooksygenazy katalizują proces syntezy prostaglandyny H2 prekursora prostaglandyn, prostacyklin i tromboksanu. Lipooksygenazy katalizują przyłączenie tlenu w pozycjach 5, 12, 15 kwasu arachidonowego, w wyniku czego powstają hydroperoksydy (HPETE, wodoronadtlenki). Klasyfikacja Podstawą klasyfikacji lipoksygenaz jest pozycja utleniania przy określonym węglu występującym w substracie. W przypadku roślin klasyfikacja odnosi się do kwasu linolowego, natomiast w przypadku zwierząt odnosi się do kwasu arachidonowego. Kwas ten jest utleniany przy węglu 9 lub przy węglu 13. Oksydacje prowadzone są odpowiednio przez 9-lipoksygenazy i 13-lipoksygenazy, a produktami są 9S i 13S utlenione pochodne kwasu linolenowego. U zwierząt klasyfikacja względem kwasu arachidonowego dzieli lipoksygenazy na pięć głównych grup enzymów: 1. 5-lipoksygenazy, które występują w leukocytach różnych gatunków, w pęcherzykach makrofagów, odpowiadają za biosyntezę leukotrienów, a katalizowana przez nie reakcja polega na utlenianiu substratu przy 5 atomie węgla. 2. 15-LOX typu retikulocytarnego, które wstawiają tlen przy 15 atomie węgla substratu, ekspresjonowane są w króliczych i ludzkich retikulocytach oraz w ludzkich komórkach nabłonkowych. 3. 12-LOX typu leukocytarnego, które prowadzą oksydację substratu przy 12 atomie węgla, występują w leukocytach świni oraz mysich makrofagach otrzewnowych. 4. 12-LOX typu płytkowego, posiadające właściwości enzymatyczne analogiczne do poprzedniego typu enzymów, znajdują się w trombocytach wielu gatunków. 5. LOX typu epidermalnego, występujące u ludzi i myszy. W skład tej grupy wchodzą zarówno 8, 12 i 15- lipoksygenazy. LOX te wykazują odmienną specyfikę względem substratu, jednak charakteryzują się znaczną homologią sekwencji aminokwasowej (nawet 99%), w tym również homologią aminokwasów budujących centrum aktywne. 1
Występuje jeszcze jedno kryterium podziału, mianowicie enancjoselektywność. LOX mogą występować jako S-, lub R-lipoksygenazy. Zarówno wśród zwierząt, jak i roślin w większości występują S-LOX, które przeprowadzają insercję tlenu do pro-s rodnikowych intermediatów. Jednak w małych morskich organizmach, takich jak koralowce i rozgwiazdy występują R-LOX. Budowa Cząsteczki LOX zbudowane są z jednego łańcucha polipeptydowego o masie cząsteczkowej 75-81 kda ( 662-711 aa) u ssaków i 94-103 kda ( 838-923 aa) u roślin. Struktura czwartorzędowa LOX jest identyczna w enzymach pochodzenia ssaczego i roślinnego i zawiera dwie domeny: N-końcową -baryłkę (PLAT, Polycystin-1, lipoxygenase, Alpha-Toxin) lub domenę LH2 (Lipoxygenase homology) oraz część katalityczną zlokalizowana na C-końcu łańcucha polipeptydowego. LOX posiadają wysoce konserwatywną sekwencję aminokwasową odpowiedzialną za utrzymanie prawidłowej budowy centrum aktywnego i wiązanie jonu żelaza katalitycznego ("LOX motyw : His-X4-His-X4-His-X17- His-X8-His). Katalityczny atom żelaza jest umiejscowiony w otoczeniu 3 konserwatywnych reszt His, jednej reszty His/Asn/Ser i C-końcowej Ile ułożonych przestrzennie na kształt oktaedru. Substrat (kwas tłuszczowy) może lokalizować się w kieszeni substratowej zarówno grupa karboksylową na jej dnie, jak i u wylotu. Jest to zależne od rodzaju (a dokładniej- jonizacji) reszt aminokwasowych obecnych w obrębie części początkowej (wlotu) i końcowej kieszeni. Jak na razie kwestią niewyjaśnioną jest sposób transportu cząsteczek tlenu do wnętrza kieszeni substratowej. Sugeruje się, że dyfunduje on swobodnie wzdłuż kieszeni, jednak możliwe jest, że w strukturze przestrzennej enzymu istnieje specjalny kanał, mający na celu ułatwienie dotarcia O 2 w pobliże jonu Fe. Mechanizm reakcji katalizowanej przez lipoksygenazy Substratem enzymatycznej reakcji peroksydacji może być tylko kwas tłuszczowy posiadający w cząsteczce ugrupowanie (1Z,4Z)-penta-1,4-dienowe. Katalizowana przez lipoksygenazy reakcja składa się z trzech etapów: 1. oderwania atomu wodoru od allilowego atomu węgla i utworzenia rodnika pentadienylowego, 2
2. wewnątrzcząsteczkowej rearanżacji wolnego rodnika alkenylowego, to znaczy przeniesienia elektronu wolnorodnikowego w kierunku końca CH 3 lub końca karboksylowego cząsteczki, w każdym z tych przypadków przesunięcie wynosi 2 atomy węgla (stąd notacja [+2] lub [-2]) i zawsze dochodzi do zmiany położenia wiązania podwójnego z typu izolowanego na sprzężony, wynikiem tych przekształceń jest powstawanie dwu rodzajów produktów, różniących się miejscem przyłączenia tlenu, 3. przyłączenia cząsteczki tlenu atmosferycznego, które następuje zawsze w pozycji 1 lub 4 ugrupowania (1Z,4Z)- penta-1,4-dienowego. Reakcja peroksydacji lipidów przez lipoksygenazy jest możliwa dzięki obecności w cząsteczce enzymu łatwo zmieniającego stopień utlenienia atomu żelaza niehemowego (Fe 2+ Fe 3+ ). Znaczenie biologiczne reakcji LOX LOX roślinne konwertują kwas linolenowy i linolowy do postaci różnych aktywnych metabolicznie intermediatów zaangażowanych w obronę roślin, ich wzrost, wydawanie nasion i obumieranie (np. kwas jaśminowy). U zwierząt podstawową funkcją LOX jest przemian kwasu arachidonowego do eikozanoidów. Odgrywają one znaczącą rolę w utrzymywaniu homeostazy komórki oraz biorą udział w przebiegu wielu chorób, w tym przebiegających ze stanem zapalnym (przeziębienie, gorączka, artretyzm, astma, nowotwory). Wykazują również zdolność do peroksydacji lipidów kwasów tłuszczowych lipidów błonowych, pozwalając tym samym na lokalne zmiany struktury i funkcji błon biologicznych, bez których nie zachodziłyby procesy dojrzewania wielu komórek, w tym erytrocytów, komórek nabłonka soczewki i keratynocytów. Inhibitory aktywności LOX Jak w przypadku każdego enzymu, częściowa lub całkowita utrata aktywności przez LOX może być spowodowana wieloma czynnikami. Należą do nich czynniki zmieniające konformację białka, zmieniające konformację lub właściwości substratu, związki chemiczne oddziałujące z kieszenią substratową i/lub centrum aktywnym enzymu. Do inhibitorów LOX zaliczane są m.in. kwas kawowy (kwas 3,4-dihydroksycynamonowy), kurkumina (diferuilometan), ketokonazol (lek przeciwgrzybiczny) i niesteroidowe leki przeciwzapalne (np. ibuprofen). Ponieważ reakcja katalizowana przez LOX przebiega zgodnie z mechanizmem wolnorodnikowym, do w/w czynników inhibicyjnych dołączyć można drobnocząsteczkowe antyoksydanty (np. likopen, beta-karoten, luteinę, wit. C) oraz związki chelatujące jony metali (EDTA czy EGTA). 3
Wyznaczanie wartości IC 50. Istnieje cały szereg doświadczeń, których wyniki przedstawia się w postaci graficznie wyznaczonej wartości IC50 (IH50, EH50), czyli takiego stężenia działającego czynnika, w którym obserwowany parametr przyjmuje wartość 50%. Umożliwia to porównywanie wpływu różnych czynników na badane zjawisko. Przykładem takich eksperymentów może być badanie zdolności detergentów do solubilizacji błony erytrocytarnej, przeżywalności komórek w hodowlach tkankowych, czy wygaszanie fluorescencji przez wzrastające stężenia wolnych rodników. W przypadku tego doświadczenia IC50 będzie to takie stężenie induktora (AAPH, nadtlenku wodoru), w którym fluorescencja badanej sondy spada o połowę względem wartości początkowej. W jaki sposób możemy wyznaczyć tę wartość? 1. Fluorescencja sondy bez AAPH wynosi 20. Jest to nasze 100%. 2. Wybieramy czas, po upływie którego odczytujemy wyniki, jest to moment na wykresie, kiedy dochodzi do całkowitej utraty fluorescencji przez sondę, na naszym wykresie jest to 420s. 3. Dla tego czasu określamy poziom fluorescencji przy wszystkich badanych stężeniach induktora i obliczamy procent obserwowanej fluorescencji początkowej: 5 mg AAPH 0 jednostek, czyli 0 %, 4 mg AAPH 5 jednostek, czyli 25%, 2 mg AAPH 14 jednostek, czyli 70%. 4. Następnie obliczamy stopień wygaszenia fluorescencji: dla 5 mg AAPH jest to 100 %, dla 4 mg 75 %, dla 2 mg 30%. 5. Rysujemy wykres zależności stopnia wygaszenia fluorescencji od stężenia induktora. Na tym wykresie Legenda: znajdujemy punkt, który odpowiada 50% wygaszeniu fluorescencji i czarny kontrola (sonda bez AAPH) znajdujemy stężenie, dla którego taka zależność występuje. Dla każdej czerwony 5 mg AAPH niebieski 4 mg AAPH badanej sondy i badanego induktora wykonujemy oddzielny wykres. zielony 2 mg AAPH 6. Zebrane wartości IC50 przedstawiamy w tabeli. Uwaga: Wszystkie wartości stężeń zostały wymyślone na potrzeby tego zadania i nie mają nic wspólnego z rzeczywistością. 4
Przykładowe zadania na obliczanie wartości IC50 1. Badano reakcję hemolizy erytrocytów pod wpływem dodawanego detergentu. Sposobem detekcji był pomiar ilości uwolnionej hemoglobiny przy =540 nm. Uzyskane wyniki zebrano w tabeli. Wiedząc, że podczas całkowitej hemolizy erytrocytów w wodzie destylowanej otrzymano A 540 =0.49 wyznacz graficznie wartość IC 50. 2. Przygotowano liposomy z lecytyny jajecznej znakowane 1 mol% NBD- PE. Ponieważ sondę włączono do dwuwarstwy przed jej uwodnieniem, otrzymano liposomy symetryczne, tzn. sonda obecna była w obydwu monowarstwach. Sonda ta jest wrażliwa na status oks-red środowiska. Pod wpływem dodanego do roztworu tiosiarczanu sodowego dochodzi do nieodwracalnych zmian chemicznych w NBD i związek ten przestaje fluoryzować. Jeżeli tiosiarczan sodowy dodany będzie z zewnątrz liposomów, wygasi fluorescencję całej puli NBD obecnego w Stężenie detergentu A 540 [ M] 1 0.03 2 0.07 5 0.13 10 0.22 15 0.3 20 0.36 30 0.46 50 0.48 Objętość tiosiarczanu sodowego (c p=0.8 mm) Fluorescencja [AU] 2 μl 420 4 μl 380 6 μl 320 8 μl 200 10 μl 120 15 μl 50 25 μl 20 zewnętrznej monowarstwie (otrzymujemy liposomy asymetryczne ). Tiosiarczan sodowy posiada zdolność dyfuzji biernej poprzez błonę lipidową, dlatego w miarę upływu czasu obserwujemy także stopniowe wygaszania fluorescencji sondy zlokalizowanej w wewnętrznej monowarstwie. Posługując się powyższą tabelą wyznacz graficznie IC 50 procesu wygaszania NBD-PE obecnego w liposomach symetrycznych, wiedząc że przed dodaniem tiosiarczanu sodowego zarejestrowano fluorescencję o wartości 450 AU, próba miała objętość 2.5 ml, zaś wygaszanie wewnętrznej puli NBD wskutek dyfuzji związku przez błonę (w trakcie trwania doświadczenia) można oszacować na ok. 15% obserwowanych zmian. 3. Przygotowano próbę kontrolną zawierającą 10 μl piraniny z roztworu 0,1 mg/ml oraz 250 μl AAPH z roztworu 32,6 mg/ml. Całość dopełniono buforem fosforanowym o ph 7,0 do 3 ml. Próby badane zawierały 10 μl piraniny (stężenie 0,1 mg/ml) oraz wzrastające stężenia ekstraktów etanolowych z oleju lnianego. Po 5 minutach preinkubacji dodawano 250 μl AAPH o stężeniu 32,6 mg/ml i prowadzono pomiar dokonując odczytu co 30 s, aż do całkowitego zaniku fluorescencji próby kontrolnej. Na postawie załączonego wykresu oblicz IC 50 (w g/l) procesu hamowania wygaszania piraniny przez wolne rodniki w obecności ekstraktów z oleju (F 0 - fluorescencja samej piraniny, F- fluorescencja piraniny w obecności AAPH lub AAPH i ekstraktów z oleju). 4. Badano wpływ ekstraktu z oleju lnianego na peroksydację kwasu linolowego indukowaną jonami żelaza. Do emulsji z kwasu linolowego (25 μl) dodano wzrastające stężenia ekstraktów olejowych i dopełniono do 900 μl 10 mm buforu Tris- HCl ph 7,4. Próbki inkubowano 10 minut, po czym dodano 100 μl roztworu soli Mohra, tak by końcowe stężenie jonów żelaza w 3 ml wynosiło 2,5 mm. Po 15 minutach inkubacji dodano 2 ml odczynnika A i przeniesiono próbki do wrzącej łaźni wodnej na 10 minut. Po wystudzeniu i odwirowywaniu wszystkich prób ilość produktów utleniania oznaczano kolorymetrycznie przy długości fali 535 nm. Znając powyższe dane oraz wyniki eksperymentu zobrazowane na rysunku obok oblicz różnicę pomiędzy wartościami IC 50 procesu peroksydacji w obecności oraz nieobecności jonów żelazowych. 5
F0/F 5. Jedną z metod badania zmian konformacyjnych białek podczas ich oddziaływania z ligandami jest pomiar wewnętrznej fluorescencji reszt Trp białka lub pomiar jej wygaszania przez wygaszacze. Do wygaszania kolizyjnego dochodzi, gdy cząsteczki wygaszacza swobodnie przemieszczają się w roztworze, wygaszanie takie jest zatem zależne od stężenia wygaszacza. Użycie substancji wygaszających o różnych właściwościach pozwala określić typ środowiska, w jakim znajdują się w warunkach eksperymentu reszty Trp. Silniejsze wygaszanie fluorescencji reszt tryptofanowych przez wygaszacze o charakterze hydrofilowym (KI, akrylamid) niż hydrofobowym (TCE) świadczyć może o ekspozycji reszt Trp do środowiska polarnego i odwrotnie. Ponadto, zmiana profilu wygaszania fluorescencji pod wpływem jakiegoś czynnika, np. przyłączanego liganda, świadczyć może o zmianach konformacyjnych białka zachodzących pod wpływem tego oddziaływania. 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0 100 200 300 400 500 600 stężenie KI [mm] Na rysunku powyżej przedstawiono wygaszanie fluorescencji reszt Trp enolazy przez KI (tzw. krzywe Sterna- Volmera) w obecności liposomów zbudowanych z PC/PI 96:4 w zależności od molowego stosunku lipid/białko. Na podstawie danych odczytanych z powyższego wykresu proszę sporządzić kolejny wykres obrazujący zależność wartości IC 50 procesu wygaszania fluorescencji Trp przez KI od stosunku molowego lipid/białko. Przykładowe schematy zadań obliczeniowych z wykorzystaniem roztworu wyjściowego (stock solution) 1. Jakie objętości roztworu NaOH o stężeniu 4 mg/ml należy pobrać, aby uzyskać w próbach stężenia 0.5 i 0.005 mm (mol/litr). Końcowa objętość każdej próbki wynosi 10 ml. 2. Jakie będą stężenia roztworów NaOH w próbach po dodaniu do nich 10 mikrolitrów z roztworu stock solution oraz 15 mikrolitrów ze 100x rozcieńczonego roztworu wyjściowego, jeżeli końcowa objętość każdej próby wynosi 2 ml. 6