diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics 2011 Volume 47 Number 1 7-15 Artykuł na zaproszenie Redakcji Invited article Problemy standaryzacji i kalibracji metod immunochemicznych Standardization and calibration of immunochemistry methods current problems Krystyna Sztefko Zakład Biochemii Klinicznej P-A Instytutu Pediatrii, Uniwersytet Jagielloński, Collegium Medicum Streszczenie Praca przedstawia aktualne problemy dotyczące procesu standaryzacji i kalibracji metod immunochemicznych. Poruszono szereg zagadnień związanych z trudnościami uzyskania odpowiednich wzorców pierwszorzędowych, zwłaszcza dla heterogennych białek, problemy zgodności pomiarowej (traceability) i niepewności pomiaru (uncertainty) wraz z wpływem efektów matrycowych na wyniki uzyskiwane we wzorcach, materiałach kalibracyjnych i próbkach pacjenta. Istotnym elementem procesu standaryzacji i kalibracji metod immunochemicznych jest identyczność zachowania się analitu w materiale wzorcowym, kalibratorach, próbce pacjenta i próbce wzorcowej, problem znany jako komutabilność. Przy braku możliwości standaryzacji metod immunochemicznych można polepszyć porównywalność pomiędzy wyniki poprzez wprowadzenie harmonizacji metod. Jednak najlepszym sposobem poprawy zgodności pomiarowej metod jest poszukiwanie nowych rozwiązań standaryzacji metod, co przedstawiono na przykładzie glikowanej hemoglobiny i hcg. Summary The review presents current problems connected with standardization and calibration of immunochemical methods. Among the most important issues are difficulties to obtain primary standards, especially for heterogeneous proteins, traceability, uncertainty of measurement together with the effect of matrix on the results obtained in reference material, calibrators and patient sample. Identical behavior of the analite in reference material, calibrators, patient s sample and controls is one of the important standardization and calibration problem, known as commutability. In case of lack of standardization of immunochemistry methods, comparability of different methods can be achieved by harmonization process. However, the best solution for increasing the traceability is searching for new standardization option, as it was possible in the case of glycated hemoglobin and hcg. Słowa kluczowe: proces standaryzacji, metody immunochemiczne, wzorce pierwszorzędowe, zgodność pomiarowa, niepewność pomiaru, komutabilność Key words: standardization, immunochemical methods, primary standards, traceability, uncertainty, commutability Prof. dr hab. Krystyna Sztefko Prof. dr hab. Krystyna Sztefko jest kierownikiem Zakładu Biochemii Klinicznej Polsko-Amerykańskiego Instytutu Pediatrii UJ CM w Krakowie. Obecnie pełni drugą kadencję obowiązki prodziekana ds. studenckich i kształcenia na kierunku lekarskim Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego. W zakresie Jej zainteresowań znajdują się zagadnienia związane z pediatryczną diagnostyką laboratoryjną a także zagadnienia związane z problemami dotyczącymi interpretacji wyników oznaczeń uzyskanych metodami immunochemicznych. W ramach zainteresowań naukowych prowadzi prace dotyczące roli insulinopodobnych czynników wzrostu, kwasów tłuszczowych i witaminy D w raku jelita grubego. 7
Problemy standaryzacji i kalibracji metod immunochemicznych Wszystkie oznaczenia biochemiczne wykorzystywane w medycynie, w tym również te wykonywane metodami immunochemicznymi, muszą być dokładne, a więc zgodne z wartością rzeczywistą. Z tego względu każda metoda analityczna wykonywana w laboratorium medycznym wymaga procesu standaryzacji. Standaryzacja jest również niezbędna do zapewnienia porównywalności wyniku danego parametru biochemicznego wykonywanego różnymi metodami immunochemicznymi. Walidacja metod immunochemicznych zależy od pewnych fundamentalnych założeń [1]: 1) substancja, którą mierzy się w roztworze standardu i w surowicy pacjenta jest identyczna; 2) mierzona substancja musi mieć podobną aktywność biologiczną (dla metod biologicznych) lub strukturę chemiczną rozpoznawaną przez przeciwciało wychwytujące metody (dla metod immunochemicznych). Pozornie jest to łatwe do wykonania, ale tylko dla substancji które są homogenne, o wysokim stopniu czystości i identyczne w budowie i własnościach chemicznych z substancją obecną w roztworze standardu. Przykładem takiej substancji jest glukoza, dla której porównywalność pomiędzy metodami jest bardzo dobra. Metodami immunochemicznymi można oznaczać bardzo dużo różnorodnych z punktu widzenia chemicznego substancji, od prostych molekuł (niektóre hormony (np. tyroksyna), leki), poprzez peptydy o znanej struturze I-rzędowej, skończywszy na bardzo dużych heterogennych białkach. Biorąc pod uwagę interferencje pochodzące od swoistych i nieswoistych białek wiążących, autoprzeciwciał i przeciwciał heterofilowych oraz heterogenność wielu hormonów, proces standaryzacji metod immunochemicznych jest bardzo trudny do przeprowadzenia. Najważniejszym elementem standaryzacji jest posiadanie odpowiedniego wzorca i referencyjnej metody pomiarowej [20]. Bardzo dobry wzorzec, odzwierciedlający chemicznie substancję którą chcemy zmierzyć, nie będzie użyteczny, jeżeli nie będzie można przypisać mu odpowiedniej wartości. Również najlepsza metoda oznaczania danego parametru nie spełni swojej roli, jeżeli nie będzie odpowiedniego wzorca któremu chce się przypisać ilościową wartość. Aby przypisać wartość stężenia do materiału referencyjnego, potrzebna jest metoda referencyjna o możliwie najwyższym poziomie w hierarchii metrologicznej. Wartość stężenia danego parametru biochemicznego w materiale referencyjnym przypisana dzięki metodzie referencyjnej reprezentuje najlepsze oszacowanie wartości prawdziwej. Metoda referencyjna opierająca się na najnowszej wiedzy jest określana jako metoda definitywna. Przy pomocy takiej metody przypisywana jest wartość stężenia danego parametru w próbce standardu (wzorzec pierwszorzędowy). Taki wzorzec musi być dobrze scharakteryzowany nie tylko chemicznie (jaka struktura jest mierzona), ale także musi być znana interakcja pomiędzy mierzonym antygenem i przeciwciałem stosowanym w metodzie immunochemicznej. W przypadku stosowania w metodzie przeciwciała monoklonalnego, musi być znana jego swoistość dla konkretnego epitopu. Metody definitywne są z reguły bardzo czasochłonne, przy pomocy tych metod nie ma możliwości wykonania setek oznaczeń w krótkim czasie i są one kosztowne. Jednakże, jeżeli w różnych laboratoriach wykona się oznaczenie metodą definitywną w sposób dokładnie taki jak podany w instrukcji, wynik dla danej próbki powinien być prawdziwy, co oznacza że musi znajdować wewnątrz opisanej dla metody niepewności pomiaru. Wzorce pierwszorzorzędowe produkowane w ograniczonych ilościach są niezbędne do uzyskania wzorców drugorzędowych. Przeniesienie wartości z pierwszorzędowego wzorca na wzorzec drugorzędowy dokonywane jest przy pomocy metody referencyjnej. Materiał referencyjny drugorzędowy może być stosowany nie tylko w procedurach referencyjnych, ale także jako kontrola prawdziwości. Wzorce drugorzędowe są wykorzystywane przez producentów zestawów odczynnikowych dla metod immunochemicznych do przeniesienia wartości na kalibratory, które z kolei są stosowane w metodach rutynowych. Proces standaryzacji metody zawsze polepsza prawdziwość (brak błędu systematycznego) mierzonego stężenia analitu, ale nie wpływa bezpośrednio na precyzję metody immunochemicznej. Hierarchiczna zależności pomiędzy metodami definitywnymi, referencyjnymi, komercyjnymi i rutynowymi oraz pomiędzy wzorcem pierwszorzędowym, drugorzędowym, kalibratorami komercyjnym i kalibratorami stosowanymi w metodzie rutynowej jest dobrze znana diagnostom laboratoryjnym i przeniesienie wartości z góry do dołu, a więc od wzorca pierwszorzędowego do kalibratorów służących do kalibracji metod wydaje się prostym analitycznie zadaniem. Hierarchię metod definitywnych, referencyjnych i rutynowych oraz odpowiednich materiałów referencyjnych i kalibratorów przedstawiono na rycinie 1. Rycina 1. Hierachiczna zależność pomiędzy metodą definitywną, referencyjną i rutynową a odpowiednimi materiałami referencyjnymi. Niepewność pomiaru jest najniższa dla metody definitywnej i najwyższa dla metody rutynowej. Dla metod immunochemicznych problem standaryzacji wymaga jednak pewnych wyjaśnień i odpowiedzi na następujące pytania: 1) czy istnieją wzorce pierwszorzędowe; 2) czy zawsze jest zachowana zgodność pomiarowa (traceability); 3) jaka jest niepewność pomiaru (uncertainty) na każdym etapie procesu standaryzacji; 4) jak rozwiązać problem komutabilności. 8
K. Sztefko Wzorce pierwszorzędowe w immunochemi Dla prostych, dobrze zdefiniowanych substancji takich jak hormony sterydowe, hormony tarczycy, aminy biogenne czy leki, certyfikowane, wysoko oczyszczone, wzorce są dostępne, ale nie oznacza to, że możliwe jest proste przeniesienie ilościowej wartości z wzorca pierwszorzędowego na kalibratory. Większość spośród oznaczanych, prostych chemicznie, substancji występuje w płynach biologicznych w postaci wolnej i w postaci związanej ze swoistymi i nieswoistymi białkami wiążącymi, i zawsze istnieje we krwi równowaga pomiędzy frakcją wolną i frakcją związaną. Powoduje to inne zachowanie się czystego wzorca (np. tyroksyny) w roztworze wodnym, a inne w surowicy. Zatem nie zawsze posiadanie odpowiedniego wzorca pierwszorzędowego oznacza możliwość pełnej standaryzacji metody rutynowej. Ponieważ nie ma obecnie metod pozwalających na oznaczenie stężenia analitów w wodzie surowicy, oznaczenie stężenia np. wolnej tyroksyny (FT4) w surowicy wymaga przeprowadzenia dializy równowagowej lub ultrafiltracji przed właściwym oznaczeniem wolnej frakcji tyroksyny. Bezpośredni pomiar wielu substancji w surowicy krwi, bez naruszenia równowagi pomiędzy frakcją wolną i frakcją związaną, nie jest obecnie możliwy. Dużym problemem jest uzyskanie pierwszędowego wzorca dla wysokocząsteczkowych peptydów i białek. Najczęściej standardy dla białek są uzyskiwane z naturalnych źródeł biologicznych, np. poprzez proces ekstrakcji z tkanki lub guza, lub są uzyskiwane technikami rekombinacji DNA. Ich sekwencje aminokwasowe i stężenia molowe są możliwe do określenia. Niestety dla wielu złożonych białek definicja substancji, którą chcemy zmierzyć, jest bardzo trudna ze względu na ich heterogenność, zarówno chemiczną jak i konformacyjną. Ponadto, sam proces oczyszczania może być przyczyną zmian strukturalnych lub zmian integralności białka i stanowić źródło różnego rodzaju zanieczyszczeń. Podkreślić również należy, że peptydy/białka obecne w próbce pacjenta i rekombinowane białka mogą nie mieć takiego samego składu cząsteczkowego oraz II- i III-rzędowej struktury, zatem oczyszczony materiał referencyjny może posiadać odmienną antygenowość w porównaniu do białka rekombinowanego. Z tego powodu rekombinowane białko, oczyszczone białko i natywne białko mogą w różny sposób reagować nie tylko w metodach stosujących różne przeciwciała, ale także w metodach wykorzystujący dokładnie te same przeciwciała wychwytujące i znakowane [8]. Heterogenność cząsteczkowa jest cechą prawie wszystkich białek. Heterogenność białka może być u danego pacjenta ustalona genetycznie, ale może też zależeć od jednostki chorobowej i jej stadium. Heterogenność białek obserwowana w próbkach pacjenta może wynikać z różnych potranslacyjnych procesów biochemicznych, takich jak glikozylacja, polimeryzacja, sialylacja, czy agregacja. Ponadto, próbka pacjenta może zawierać prohormony, fragmenty hormonów powstałe wskutek hydrolizy, wolne podjednostki białka, kompleksy białek z innymi makrocząsteczkami białkowymi lub składnikami nieorganicznymi. Z tego powodu przygotowanie materiału referencyjnego dla heterogennych analitów, który odzwierciedlałby wszystkie formy białek obecne w próbce jest trudne w praktyce do wykonania, ponieważ nie jest znany stosunek molowy różnych form białka w danym momencie czasowym. Także w przypadku wielu białek nie do końca wiadomo ile form danego heterogennego białka jest obecnych w próbce, a niekiedy wręcz brakuje wiedzy na ten temat. Częściowa degradacja proteolityczna lub nicking to częste procesy dotyczące białek i hormonów. Także różnice w strukturze chemicznej hormonów w zależności od pochodzenia tkankowego, różnice między formami wydzielanymi przez gruczoł i produkowanymi ektopowo, czy też różnice form hormonu obecnych w surowicy i moczu stawiają wysokie wymagania dla analityków. Dodatkowo, niektóre białka obecne w próbkach biologicznych mogą być immunoreaktywne nie wykazując przy tym aktywności biologicznej i odwrotnie niektóre biologicznie aktywne białka mogą nie wykazywać immunoreaktywności, zatem nie będą rozpoznawane przez przeciwciała zastosowane w metodach immunochemicznych. Dla wieku heterogennych cząsteczek brak jest referencyjnych metod pomiaru i wartości stężeń są przypisane do materiału referencyjnego na zasadzie consensusu. Tak jest w przypadku wielu wzorców dla hormonów glikoproteinowych składających się z częściowo oczyszczonych preparatów, a ich ilość jest określana metodami biologicznymi i wyrażana w arbitralnych jednostakch (IU, zdefiniowanych zgodnie ze standardami WHO). Przez analogię można wymienić także niektóre przeciwciała (np. przeciwciała przeciwko peroksydazie tarczycowej, (anty-tpo) i niektóre hormony glikoproteinowe (np. LH, FSH) których ilość we krwi jest także określana w IU/l. Dla wielu heterogennych białek mierzonych metodami immunochemicznymi nie ma międzynarodowej referencyjnej procedury pomiarowej. Także dla wielu analitów nie są dostępne materiały referencyjne ani kalibratory. Obecnie, dla niektórych heterogennych białek mierzonych metodami immunochemicznymi nie istnieje także procedura referencyjna. Należy zatem zadać pytanie, czy możliwa jest standaryzacja heterogennych białek i uzyskanie materiału wzorcowego, który odzwierciedlałby różnice w składzie form białek w różnych stanach patologicznych? Do przygotowania standardu potrzebna jest nie tylko informacja o różnych formach molekularnych białka, ale także informacja odnośnie reaktywności przeciwciał stosowanych w metodzie w stosunku do charakterystyki analitu w próbce biologicznej i materiale referencyjnym. Jak wiadomo, swoistość i powinowactwo przeciwciał może być modyfikowane w obecności innych substancji w próbce pacjenta. Zatem dla wielu białek dokładna definicja analitu, który chcemy zmierzyć i wpływ matrycy próbki, gdy wartość stężenia jest przypisana przez metodę referencyjną, stanowi problem nierozwiązany. Proces kalibracji Dla każdej rutynowo wykonywanej metody immunochemicz- 9
Problemy standaryzacji i kalibracji metod immunochemicznych nej zależność pomiędzy mierzonym sygnałem (radioaktywność, aktywność enzymatyczna, fluorescencja, chemiluminescencja) a stężeniem mierzonego analitu wskazująca na przebieg reakcji antygenen-przeciwciało musi być ustalona (krzywa kalibracyjna). Jest to proces znany jako kalibracja metody. Każda metoda immunochemiczna wymaga kilku kalibratorów, zwykle od 5 do 8, z właściwie przypisaną wartością w oparciu o odpowiedni materiał referencyjny. Zwykle kalibratory zawierają czysty analit w roztworze (gotowy do użycia, ready-to-use) lub są w postaci materiałów liofilizowanych, które muszą być rozcieńczone w odpowiednim roztworze (diluent) zgodnie z instrukcją metody. Krzywa kalibracyjna jest wykreślana najczęściej komputerowo i stężenie w nieznanej próbce jest określane przez ekstrapolację. Krzywe kalibracyjne dla analitów mierzonych metodami immunochemicznymi różnią się kształtem od krzywych otrzymywanych dla innych metod analitycznych, często nie są liniowe, zatem aby obliczyć stężenie analitu w badanej próbce musi być zastosowane odpowiednie modelowania matematyczne. Jeżeli oznaczenie immunochemiczne jest wykonywane na automatycznej platformie, dla każdej zależności pomiędzy sygnałem a stężeniem analitu przypisanego do kalibratora, funkcja matematyczna opisująca krzywą kalibracyjną jest obliczana w oparciu o wbudowany komputer, a stężenie analitu w nieznanej próbce jest obliczane z wielkości sygnału i wyrażane od razu w odpowiednich jednostkach. Także liczniki scyntylacyjne gamma i czytniki płytek zwykle wyposażone są we wbudowane programy komputerowe. Jest konieczne aby wszystkie programy matematyczne dopasowywujące krzywe kalibracyjne pozwalały na jak najlepsze odzwierciedlenie właściwej krzywej w całym zakresie stężeń. W zależności od metody/platformy immunochemicznej, stosowane są m.in. liniowa interpolacja, regresja polynomialna, transformacja logit-logitowa lub cztero albo pięcio parametrowa metoda log-logistyczna (8). Diagności laboratoryjni nie zawsze są zaznajomieni z rodzajem obliczeń matematycznych stosowanym dla danej metody i zdarza się, że metoda matematyczna jest błędnie zastosowana, co daje błędne wyniki u pacjenta, zwłaszcza w pobliżu obu końców krzywej. Najczęściej zdarza się to jeżeli ta sama transformacja matematyczna jest zastosowana dla wszystkich testów wykonywanych na platformie. Dobrą praktyką laboratoryjną jest nie tylko krytyczne spojrzenie na obliczenia komputerowe, ale także posiadanie dostępu do oryginalnego przebiegu krzywej. Niektóre metody immunochemiczne wykonywane na platformach (głównie metody niekompetycyjne) mające liniową zależność pomiędzy mierzonym sygnałem a stężeniem analitu wymagają tylko jednego lub dwu kalibratorów do wykonania serii oznaczen badanych próbek. Taka procedura analityczna jest możliwa do wykonania, ponieważ stabilne, w pełni zautomatyzowane, analizatory immunochemiczne przechowują w pamięci krzywą kalibracyjną (master curve) ustaloną przez producenta i taka krzywa wymaga tylko okresowego sprawdzenia. Typowa przechowywana krzywa dla metod immunochemicznych jest stabilna przeciętnie dwa tygodnie a analizy swobodnego dostępu (random access) mogą być łatwo wykonywane. Jednakże, należy zwrócić uwagę na możliwe błędy podczas kalibracji metody stosującej tylko jeden lub dwa kalibratory, zwłaszcza pod koniec okresu ważności krzywej master ustalonej przez producenta. W przypadku wielu testów immunochemicznych wykonywanych na platformach immunochemicznych, np. dla narkotyków (drug abuse) czy dla markerów chorób infekcyjnych, aby określić punkt odcięcia pomiędzy dodatnim a ujemnym wynikiem pacjenta wystarczające jest zastosowanie tylko jednego pojedynczego kalibratora razem z nieznana próbką. Zwykle dodatnie i ujemne kontrole są także włączane jako nieznane próbki aby sprawdzić kalibrację metody. Efekt matrycowy Znajomość hierachii metod i szczegółowe informacje na temat wzorców stosowanych w procesie standaryzacji nie wystarczają do pełnego zrozumienia tego procesu w przypadku metod immunochemicznych. Przyczyną tego jest sama natura tych metod, a więc reakcja antygen-przeciwciało stanowiąca ich podstawę. Przebieg tej reakcji zależy nie tylko od formatu metody ale przede wszystkim od efektów matrycowych, które są główną przyczyną różnic pomiędzy wynikami stężenia danego parametru uzyskanych w materiale referencyjnym i w natywnej próbce biologicznej. Efekt matrycowy jest definiowany jako wpływ własności próbki, niezależnie od obecności analitu, na pomiar a przez to na wartość mierzonej ilości [14]. Matryca próbki to wszystkie składniki znajdujące się w systemie biologicznym z wyjątkiem samego analitu [14]. Matryca kalibratorów stosowanych do kalibracji większości analitów różni się istotnie od matrycy próbki biologicznej (surowicy lub osocza). Kalibratory w metodach immunochemicznych często są przygotowywane w środowisku wodnym lub organicznym, które nie są komutabilne z próbką biologiczną. Takie kalibratory nie powinny być stosowane. Dla osób, które korzystają z metod immunochemicznych znany jest fakt, że w trakcie wykonywania samej kalibracji metody rzadko kiedy można mieć zastrzeżenia co do jakości metody, natomiast już przy oznaczaniu próbek biologicznych jakość metody bywa kwestionowana. Efekt matrycowy powinien być wzięty pod uwagę na każdym etapie procesu standaryzacji/kalibracji, zaczynając od metod definitywnych z pierwszorzędowymi wzorcami poprzez metody referencyjne z drugorzędowymi wzorcami, a kończąc na kalibratorach stosowanych w metodach rutynowych i przypisaniu wartości do mierzonej próbki pacjenta. Efekt matrycowy może wpływać na każdy etap standaryzacji/kalibracj i dlatego zgodność efektów matrycowych z zestawu na zestaw powinna być utrzymana. Jeżeli analit zachowuje się podobnie w materiale referencyjnym, w kalibratorach i w próbkach pacjenta, wówczas są one komutabilne, i zgodność pomiarowa jest spełniona. Powinno się pamiętać jednakże, że w każdej metodzie immunochemicznej na reakcję antygen-przeciwciało, która zachodzi w próbce pacjenta, wpływa wiele czynników takich jak ph, siła jonowa, obec- 10
K. Sztefko ność różnych białek (swoiste białka wiążące, immunoglobuliny, autoprzeciwciała), a także różnice w poziomie hydrofobowości cząsteczek, zatem końcowy wynik zawsze zależy od interferencji, które są unikalne dla próbki pacjenta. Najbardziej pożądane do kalibracji metod immunochemicznych są materiały opracowane na podstawie odpowiedniej matrycy (na bazie surowicy), co nie zawsze jest osiągalne. Dostępność certyfikowanego materiału referencyjnego przygotowanego na bazie odpowiedniego matrix jest krytyczne dla procesu standaryzacji metod immunochemicznych. Zgodnie z definicją, efektem matrycowym jest wpływ wszystkich innych składników systemu analitycznego, z wyjątkiem analitu, którego wartość jest mierzona w zależności od określonych warunków. Chociaż materiał referencyjny (drugorzędowy) przygotowany w oparciu o odpowiednią matrycę z reguły jest komutabilny z prawidłową surowicą, problemy z oznaczaniem analitu pojawiają się, gdy w próbce pacjenta są patologicznie zmienione białka (np. zhydrolizowane, zmodyfikowane) lub inne nietypowe substancje interferujące. Matryca drugorzędowych materiałów referencyjnych powinna mieć następujące własności: optymalna przejrzystość, stężenie triglicerydów mniejsze niż 0.020 g/l, nieobecność hemoglobiny i bilirubiny. Ponadto, powinna być ona testowana na HIV-1 i -2, HTLV-1, HBaAg i HCV i musi być wolna od takich składników jak czynniki reumatoidalne i przeciwciała monoklonalne (znane czynniki interferujące w metodach immunochemicznych) (20). Chociaż matryca drugorzędowych wzorców uzyskanych w oparciu o surowicę jest podobna do próbek biologicznych, nie eliminuje to jednak całkowicie problemu, ponieważ matryca różni się pomiędzy analizowanymi próbkami pobranymi od różnych pacjentów. Należy też pamiętać, że problemy matrycowe są też uzależnione od formatu metody immunochemicznej. Zgodność pomiarowa (traceability) Właściwa standaryzacja wyników laboratorium medycznego wymaga stosowania się do reguł metrologii. Metrologiczna zgodność pomiarowa w medycynie laboratoryjnej oznacza wiarygodne przeniesienie mierzonych wartości uzyskanych w metodzie o najwyższym poziomie hierarchicznym (definitywna, referencyjna) do metod rutynowych stosowanych w laboratorium do pomiaru stężenia analitu w próbce pacjenta. Zgodnie z definicją ISO, zgodność pomiarowa (traceability) jest własnością wyniku pomiaru lub wartości wzorca, dzięki czemu może ona być w relacji do ustalonej ścieżki referencyjnej, zwykle narodowych lub międzynarodowych standardów, poprzez udokumentowany, nieprzewany ciąg porównań, z których wszystkie mają podaną niepewność pomiaru [4]. Numerycznie, zgodność pomiarowa wyniku może być oceniona jako jej dokładność (brak błędu systematycznego). Należy jednak rozróżnić określenia dokładność i prawdziwość. Dokładność jest najbliższą zgodnością pomiędzy mierzoną ilościowo wartością a rzeczywistą wartością substancji mierzonej, natomiast prawdziwość jest najbliższą wartością pomiędzy średnią z nieskończonej liczby powtórzeń mierzonych ilościowo wartości a mierzoną ilościowo wartością referencyjną (ryc.2) [15]. Wprowadzenie zgodności pomiarowej do laboratoriów medycznych zabezpiecza w pewnym sensie analityków, którzy przy zapewnieniu zgodności pomiarowej mogą przyjąć że stężenie analitu w nieznanej próbce mierzone rutynowym systemem pomiarowym i wynik otrzymany w w tej samej próbce uzyskany metodą referencyjną lub definitywną są równoważne. Jest Rycina 2. Wymagana komutabilność pomiędzy próbkami wzorcowymi, kalibratorami, próbą kontrolą i próbka pacjenta. Zgodność pomiarowa (traceability) wyrażona jest poprzez dokładność i prawdziwość. to możliwe do osiągnięcia tylko wtedy, gdy wiadomo co jest mierzone (struktura substancji, którą mamy zamiar zmierzyć), jak będzie mierzone (materiał referencyjny i metoda referencyjna muszą być zdefiniowane), jaka będzie niepewność pomiaru i czy utrzymany zostanie cały proces kalibracji i przypisania wartości [7,18]. Zawsze należy rozróżnić metody referencyjne od materiału referencyjnego, chociaż są ściśle ze sobą związane. Jeżeli nie jest dostępny materiał referencyjny, wtedy nawet najbardziej wyrafinowane metody definitywne będą bezużyteczne w sensie zgodności pomiarowej. Także jeżeli materiał referencyjny jest dostępny, ale nie ma metody referencyjnej, dzięki której można by przypisać wartość stężenia, taki materiał nie może być stosowany. Innymi słowy brak jest albo odpowiedniego wzorca albo metody referencyjnej. Taka sytuacja jest częsta w przypadku pomiaru analitu metodami immunochemicznymi i dlatego stężenie analitu w próbce pacjenta jest ekstrapolowane z procedury wybranej przez producenta i odpowiednich kalibratorów. To dotyczy głównie heterogennych białek, np. markerów nowotworowych [8]. Niezależnie od braku materiału referencyjnego lub metody referencyjnej, jeżeli u pacjenta wynik stężenia dowolnego analitu nie wykazuje zgodności pomiarowej z międzynarodowo akceptowanym materiałem referencyjnym, wtedy jest duże prawdopodobieństwo niewłaściwej interpretacji wyników ze wszystkimi medycznymi konsekwencjami dla pacjenta. Dla wielu analitów mierzonych metodami immunochemicznymi, główną przyczyną braku zgodności pomiarowej wyniku jest słaba standaryzacja. Producenci odczynników stosowanych w metodach 11
Problemy standaryzacji i kalibracji metod immunochemicznych immunochemicznych powinni dostarczać certyfikat dowodzący zachowania łańcucha zgodności pomiarowej dla kalibratorów stosowanych w metodach rutynowych z klinicznie akceptowalną niepewnością pomiaru. Dopóki laboratorium stosuje komercyjne odczynniki do immunochemii i postępuje zgodnie z polecaną analityczną procedurą, proces walidacji sprawdzający zgodność pomiarową nie jest potrzebny (17). Rozważając zastosowanie zgodności pomiarowej, powtórzyć należy jeszcze raz istotne rozróżnienie pomiędzy analitami dobrze chemicznie zdefiniowanymi i analitami w próbce pacjenta, które są heterogenne. Dla pierwszej grupy cząsteczek, wyniki uzyskiwane w próbce pacjenta mają zgodność pomiarową z układem SI. Dla analitów heterogennych, wprowadzenie standaryzacji jest trudniejsze. Ponieważ są one heterogenne i ich skład w płynach biologicznych człowieka zmienia się w zależności od stanu chorobowego, czasu pomiaru i aktywności proteaz, wszystkie materiały referencyjne (z definicji) są tylko zastępcze (surrogates) w odniesieniu do analitów mierzonych w próbce pacjenta. Ponieważ materiały wzorcowe mogą w jakimś zakresie odzwierciedlać typową heterogenną mieszaninę analitu obecnego w płynach biologicznych, często reprezentują one tylko przeciętne warunki istniejące w surowicy krwi. Dla tych związków referencyjne procedury pomiarowe, niezależne od rutynowo stosowanych zasad analitycznych, są niedostępne w większości przypadków. Niezgodność pomiędzy wynikami otrzymywanymi przez różne metody immunochemiczne są często wynikiem przygotowania kalibratorów przez producentów odczynników na bazie masy, które nie są dostępne dla innych producentów. Niepewność pomiaru Niepewność pomiaru, zgodnie z ISO Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement jest to parametr połączony z wynikiem pomiaru charakteryzujący rozproszenie wartości, które najprawdopodobniej może być spowodowane substancją mierzoną [5], kiedy substancja mierzona jest ilością, którą chce się zmierzyć. W sensie praktycznym, całkowita niepewność wynika z przypisania wartości numerycznej substancji mierzonej obecnej w kalibratorach stosowanych w rutynowych metodach i z błędów normalnie pojawiających się w procedurze analitycznej [21]. Jak wspomniano wcześniej, dla wielu analitów mierzonych metodami immunochemicznymi nie ma materiałów referencyjnych ani metod referencyjnych, dlatego przypisanie wartości do materiałów kalibracyjnych ma wysoki stopień niepewności. Na pomiar stężenia każdego analitu wpływa zarówno błąd systematyczny, określany przez bias, jak i błąd przypadkowy definiowany jako współczynnik zmienności (CV), zatem niepewność pomiaru w metodach immunochemicznych może być wysoka. Gdy wszystkie składowe błędu całkowitego mogłyby być odpowiednio skorygowane, nadal pozostaje niepewność pomiaru danej ilości. Dla każdego pomiaru jest możliwe zdefiniowanie z pewnym prawdopodobieństwem przedziału, wewnątrz którego wynik laboratoryjny może się znajdować. Jest oczywiste, że niepewność końcowych wyników laboratoryjnych zależy od niepewności pomiaru analitu na każdym etapie łańcucha zgodności pomiarowej. Najmniejsza niepewność pomiaru dotyczy zawsze metod definitywnych a najwyższa jest charakterystyczna dla immunochemicznych metod rutynowych. Należy mocno podkreślić, że termin błąd pomiaru nie jest równoważny z terminem niepewność pomiaru. Diagności laboratoryjny znają doskonale terminy błąd przypadkowy, błąd systematyczny i błąd całkowity, ale niepewność pomiaru, która wynika z przypadkowych efektów i nieperfekcyjnego skorygowania błędów systematycznych jest mniej znana. W przypadku metod immunochemicznych niekompletna definicja substancji, którą chce się zmierzyć, brak porównywalności matryc wzorca i próbki pacjenta, brak wiedzy na temat - ile i jakie nieznane czynniki środowiskowe na każdym etapie procedury standaryzacji wpływają na procedurę analityczną - są głównymi przyczynami niepewności pomiaru, o którą należy się martwić. Koncepcja niepewności pomiaru jest całkiem nowa dla laboratoriów medycznych i dużo dyskutuje się na temat, jak niepewność powinna być mierzona (jeżeli rzeczywiście jest potrzebna) przez laboratorium oraz jak (i czy w ogóle) niepewność pomiaru powinna być podawana [13,19]. Problem komutabilności Wszystkie kalibratory stosowane w rutynowych metodach immunochemicznych dla wszystkich istotnych klinicznie parametrów muszą zachowywać się w sposób podobny jak zachowują się wszystkie badane próbki w różnych metodach, a wszystkie badane próbki muszą zachowywać się jednolicie, chociaż różnie, w poszczególnych metodach. Koncepcja o podobnym zachowaniu się analitu i jednolitej zależności między metodami jest wyrażany przez termin komutabilność (commutability) [10]. Komutabilność reprezentuje równoważność zależności matematycznej pomiędzy wynikami różnych procedur pomiarowych dla materiału referencyjnego i dla reprezentatywnych próbek uzyskanych od osób zdrowych i chorych [5]. Praktycznie, jeżeli materiał referencyjny będzie mierzony zarówno metodą referencyjną jak i metodą rutynową, stosunek numeryczny uzyskanych wyników musi być taki sam jak stosunek wyników uzyskanych oboma metodami dla próbki pacjenta (ryc.3) [6,9,17]. Nie jest możliwe całkowite wyeliminowanie problemu braku komutabilności, Rycina 3. Matematyczne wyrażenie komutabilności pomiędzy próbką wzorcową i próbką pacjenta. 12
K. Sztefko ponieważ próbki biologiczne mogą różnić się istotnie nie tylko między różnymi pacjentami, ale także u tego samego pacjenta w zależności od warunków klinicznych. Podobne zachowanie się analitu powinno być nie tylko w kalibratorach i próbkach pacjentów ale także w próbkach stosowanych dla zapewnienia kontroli jakości. Dla diagnostów laboratoryjnych jest rzeczą dobrze znaną, że gdy próbki kontrolne mierzone w różnych laboratoriach nie są komutabilne, wtedy wyniki kontroli jakości muszą być opracowywane oddzielnie dla poszczególnych metod lub analizatorów immunochemicznych, w przeciwnym razie wyniki próbek kontrolnych mogą być całkowicie nieporównywalne. Zatem istotne różnice w wartościach docelowych dla próbek kontrolnych mierzonych różnymi metodami immunochemicznymi są uzależnione nie tylko od różnic formatów metod i charakterystyki przeciwciał stosowanych w metodach, ale także od tego czy są one komutabilne czy nie. Należy jeszcze raz podkreślić, że każdy użytkownik metod immunochemicznych z reguły obserwuje bardzo dobrą zgodność pomiędzy nominalną i mierzoną wartością gdy mierzy się stężenie w próbkach kontrolnych dostarczonych przez producenta, ale dla próbek kontrolnych wyprodukowanych na bazie surowicy taka zgodność nie zawsze jest uzyskiwana. Dlatego kalibracja metod immunochemicznych nie może być oceniana tylko w oparciu o kilka próbek kontrolnych [12]. Zatem proces kalibracji z perfekcyjną zależnością pomiędzy sygnałem i stężeniem analitu, a także zgodność pomiędzy nominalną i mierzoną wartością stężenia analitu w próbkach kontrolnych metody nie zawsze świadczą o dobrej jakości metody, bowiem podstawowym problemem jest zawsze komutabilność wzorca, próbki kontrolnej i próbki pacjenta. Aby uniknąć niezgodności wynikającej z braku komutabilności i zapewnić nieprzerwany ciąg zgodności pomiarowej mierzonej wartości, zalecane jest przygotowanie i zastosowanie drugorzędowego materiału referencyjnego [9]. Przy przeniesieniu wartości z jednego materiału referencyjnego na inny konieczne jest również sprawdzenie komutabilności. Wykonanie procedury kalibracyjnej z użyciem materiału referencyjnego, który nie jest komutabilny, jest jednym z istotnych przyczyn słabej porównywalności wyników między metodami immunochemicznymi. Również istotne jest rozróżnienie błędu systematycznego (bias) pochodzącego z rzeczywistej różnicy pomiędzy stężeniem analitu mierzonego różnymi metodami immunochemicznym od bias wynikającego z braku komutabilności. Kierunki poprawy standaryzacji metod immunochemicznych Trudności w ustaleniu zgodności pomiarowej przy standaryzacji heterogennych białek były impulsem do poszukiwania nowych rozwiązań na polu standaryzacji w immunochemii i nowej definicji analitu, którego stężenie chce się zmierzyć. Z punktu widzenia immunochemii, najbardziej istotna jest charakterystyka unikalnej struktury analitu rozpoznawanej przez przeciwciało wychwytujące metody a nie charakterystyka całej cząsteczki. Metoda immunochemiczna opiera się na swoistej reakcji pomiędzy unikalnym epitopem na analicie i przeciwciałem wychwytującym metody, co oznacza, że to co naprawdę jest mierzone to struktura białka która jest komplementarna do odpowiedniego miejsca na cząsteczce przeciwciała. W mieszaninie różnych form tego samego białka obecnego w próbce, istotne jest znalezienie unikalnej, niezmiennej części cząsteczki, która może być obecna na każdej formie lub jest obecna tylko na jednej formie. Jeżeli unikalna struktura jest obecna na wszystkich formach heterogennego białka, wówczas mierzone będą wszystkie formy (całkowite stężenia danego białka). Jednakże, gdy mierzone są wszystkie formy białka, wówczas brak informacji na temat indywidualnych form, które mogą zmieniać się w procesie chorobowym w różnych kierunkach, nie dając zmian całkowitego poziomu białka, może mieć istotne znaczenie dla procesu diagnostycznego. Innymi słowy, informacja na temat relatywnych ilości różnych form białka może być utracona. Jeżeli unikalna struktura może być przypisana tylko jednej formie, wówczas może być przeprowadzona standaryzacja pojedynczej izoformy białka. Jednakże aby zastosować takie podejście, konieczna jest wiedza o dokładnej strukturze i własnościach fizykochemicznych formy białka, jak również unikalnej struktury cząsteczki rozpoznawanej przez przeciwciało. Takie podejście wykorzystano w przypadku glikowanej formy hemoglobiny HbA1c (3). Wiadomo, że amino-końcowa grupa hemoglobiny tworzy zasadę Schiffa z grupą aldehydową glukozy, a spontaniczne i nieodwracalne przegrupowanie Amadoriego tworzy pochodną ketonową. Hydroliza trypsyną zarówno hemoglobiny HbA1c jak i hemoglobiny HbA1 daje amino-końcowy heksapeptyd o znanej sekwencji. Jednak produkt trawienia trypsyną HbA1c różni się od produktu otrzymanego w wyniku hydrolizy HbA1 ponieważ amino-końcowy heksapeptyd HbA1c ma dodatkowo 1-deoksyfruktozę przyłączoną do amino-końcowej grupy. Taki fragment białka jest odpowiedni jako pierwszorzędowy materiał referencyjny. Podstawą procedury referencyjnej było tutaj wykorzystanie trawienia trypsyną całej krwi, a następnie ilościowe określenie przy pomocy HPLC/MS produktu trawienia. W metodzie immunochemicznej dla HbA1c, przeciwciało wychwytujące jest swoiste dla glikowanego heksapeptydu. Mając referencyjną metodę (HPLC/MS) i referencyjny materiał (glikowany heksapeptyd HbA1c), standaryzacja metody immunochemicznej dla HbA1c może być przeprowadzona i uzyskanie zgodności pomiarowej systemu referencyjnego jest możliwe. Stosując takie podejście do standaryzacji innych heterogennych białek o wysokiej masie cząsteczkowej mierzonych metodami immunochemicznymi, niezbędna jest znajomość unikalnej struktury fragmentu białka i jego fizycznych i chemicznych własności, jak również chemicznej struktury przeciwko której przeciwciało metody jest skierowane. Takie podejście może nie być możliwe dla wszystkich heterogennych białek. Ale nawet gdyby przeprowadzenie standaryzacji w oparciu o dobrze scharakteryzowane epitopy dla wszystkich glikoprotein obecnych we krwi człowieka było możliwe, 13
Problemy standaryzacji i kalibracji metod immunochemicznych informacje na temat oznaczania najbardziej użytecznych form białek w praktyce klinicznej nadal nie są dostępne. Inny przykład współczesnego podejścia do standaryzacji heterogennych białek można przedstawić na przykładzie hcg. Większość obecnych metod immunochemicznych mierzy niezmieniony hcg (nicked and non-nicked hcg) lub hcg plus hcgβ. Wszystkie metody różnią się swoistością w stosunku do różnych form hcg. Najbardziej powszechnie stosowane do kalibracji hcg są standardy międzynarodowe (trzeci - IS 75/537, lub czwarty - IS 75/589). Oba wzorce są wykalibrowane w jednostkach biologicznych (jednostki międzynarodowe na litr, IU/l). Standardy WHO dla wolnej podjednostki β i wolnej podjednostki α są także kalibrowane w arbitralnych jednostkach IU/l. Z powodu heterogenności HCG, dla właściwego procesu standaryzacji istotne jest, którą formę rzeczywiście chce się zmierzyć w próbce pacjenta. Ostatnio przygotowano grupę standardów - 1 st WHO International Reference Reagents (IRRs, WHO code 99/688) dla sześciu izoform hcg. Ten wzorzec zawiera niezmienioną hcg (intact hcg, IRR 99/688), nicked hcg (hcgn, IRR 99/642), podjednostkę beta hcg (hcgβ, IRR 99/650), nicked podjednostkę beta hcg (hcgβn, IRR 99/692), fragment beta core hcg (hcgβcf, IRR 99/708) i podjednostkę alfa hcg (hcgα, IRR 99/720), wszystkie w jednostkach molowych (16). Ta grupa wzorców IRRs to pierwszy standard dla hormonów glikoproteinowych, które są przeznaczone do kalibracji metody na podstawie porównania wzajemnej reaktywności i mogą służyć w badaniach reakcji krzyżowych. W oparciu o ten standard wykazano, że stosowane obecnie metody do oznaczania hcg różnią się istotnie w rozpoznawaniu poszczególnych form hcg w surowicy (16). Powoduje to zależne od metody różnice stężenia hcg w surowicy i co bardziej istotne, również w moczu (16). Pomimo tak ogromnego postępu w uzyskaniu materiału referencyjnego mogącego służyć do standaryzacji metody oznaczania HCG, nadal nie ma standardu dla hyperglikozylowanej hcg (istotny pomiar tej formy we wczesnej ciąży) i hyperglikowanej wolnej podjednostki beta (istotnej jako marker nowotworowy). Prowadzone są również badania w kierunku uzyskania wiarygodnej metody do ilościowej oceny hcg w moczu (2). Harmonizacja metod immunochemicznych Jeżeli standaryzacja analitu mierzonego metodami immunochemicznymi nie jest możliwa, tak jak to ma miejsce w przypadku glikoprotein, aby polepszyć porównywalność metod można zastosować proces harmonizacji. Należy jednak pamiętać, że harmonizacja metod nie jest równoważna ich standaryzacji. Celem procesu harmonizacji jest uzyskiwanie podobnych wyników dla analitów mierzonych różnymi zharmonizowanymi metodami kalibrowanymi przy zastosowaniu tych samych kalibratorów. Harmonizacja wyników uzyskiwanych u pacjentów nie zawsze wymaga wystandaryzowanych metod. W tym miejscu należy podkreślić, że jeżeli kalibratory zastosowane w metodach immunochemicznych do pomiaru danego analitu mają stężenia przypisane na podstawie materiału referencyjnego, które niekoniecznie stanowią wartości prawdziwe i we wszystkich metodach warunki reakcji i swoistość reagujących przeciwciał będzie taka sama, wówczas wyniki będą zharmonizowane, nawet jeżeli zgodność pomiarowa (traceability) nie będzie utrzymana. Z drugiej strony, dwie dobrze wystandaryzowane metody immunochemiczne mogą nie być zharmonizowane jeżeli występuje różnica w immunoreaktywności epitopu przeciwko któremu skierowane jest przeciwciało zastosowane w zestawie, lub w metodach zastosowane są różne przeciwciała przeciwko temu samemu epitopowi. W obu przypadkach będzie brak harmonizacji metod. Zwykle wyniki oznaczeń stężenia analitu uzyskane tylko dla kalibratorów w różnych metodach immunochemicznych są bardzo dobrze zharmonizowane, ale nie osiąga się harmonizacji dla próbki pacjenta gdy występuje problem komutabilności [9]. Dzieje się tak dlatego, że to samo białko zachowuje się odmiennie w próbkach kalibratora i w próbce pacjenta w odniesieniu do wiążącego przeciwciała, głównie gdy w próbkach biologicznych obecne jest różne spektrum heterogennych białek. Porównywalność wyników w metodach immunochemicznych może być osiągnięta tylko wtedy gdy stosuje się dobrze wystandaryzowane i zharmonizowane metody, a wszystkie problemy komutabilności są rozwiązane. Obecnie, wiele problemów związanych z poprawą porównywalności wyników między różnymi metodami immunochemicznymi oczekuje na rozwiązanie. Głównym celem standaryzacji i harmonizacji metod immunochemicznych jest uzyskiwanie wyników, które są porównywalne nie tylko między dwoma metodami (czy platformami immunochemicznymi) stosowanymi w tym samym laboratorium, ale uzyskanie porównywalności wyników na całym świecie, niezależnie od metody. To zapewniłoby wymienność wyników ponad czasem i przestrzenią nie tylko dla pacjentów ale także wyników badań klinicznych wykonywanych w różnych krajach dla różnych populacji, co znacznie polepszyłoby opiekę nad pacjentem [11]. Standaryzacja nie jest procesem izolowanym ważnym tylko dla laboratorium. Jest to międzynarodowy problem oczekujący na rozwiązanie przez naukowców, profesjonalistów laboratoryjnych i producentów odczynników stosowanych w metodach immunochemicznych. Niestety bardzo dużo pracy wymagać będzie polepszenie porównywalności i uzyskanie możliwości przenoszenia wyników danego pacjenta między zestawami. Piśmiennictwo 1. Bangham DR. Standardization in peptide hormone immunoassays: principle and practice. Clin Chem 1976; 22: 957-962. 2. Cole LA, Khanlian SA. The need for a quantitative urine hcg assay. Clin Biochem 2009; 42: 676-83. 3. Goodall I. HbA1c standardization destination global IFCC standardization. How, why, where, and when a tortuous pathway from kit manufacturers, via interlaboratory lyophilized and whole blood comparisons to designated national comparison schemes. Clin Biochem Rev 2005; 26: 5-19. 4. In vitro diagnostic medical devices measurement of quantities in biological samples metrological traceability of values 14
K. Sztefko assigned to calibrators and control materials. ISO 17511:2003, Geneva: International Organization for Standardization; 2003. 5. International Organization for Standardization (ISO). Guide to the expression of uncertainty measurement. Geneva: ISO 1993. 6. International Organization for Standardization (ISO). In vitro diagnostic systems measurement of quantities in samples of biological origin description of reference materials. ISO 15194:2002. Geneva, Switzerland: ISO, 2002. 7. International vocabulary of basic and general terms in metrology (VIM). ISO/IEC Guide 99:2007. Geneva: International Organization for Standardization; 2007. 8. Jeffcoate SL. Role of reference materials in immunoassay standardization. Scand J Clin Lab Invest Suppl 1991; 205:131-3. 9. Miller WG, Myers GL, Rej R. Why commutability matters. Clin Chem 2006; 52: 553-4 10. Moss DW, Whitcher JT. Reference material and reference measurement system in laboratory medicine. Commutability and the problem of method-dependent results. Eur J Clin Chem Clin Biochem 1995; 33: 1003-7. 11. Müller MM. Implementation of reference systems in laboratory medicine. Clin Chem 2000; 46: 1907-9. 12. Panteghini M. Traceability, reference systems and result comparability. Clin Biochem Rev 2007; 28: 97-104. 13. Plebani M. Evaluating laboratory diagnostic tests and translational research, Clin Chem Lab Med 2010; 48: 983-8. 14. Stenman UH. Immunoassay standardization: it is possible, who is responsible, who is capable. Clin Chem. 2001; 47: 815-20 15. Stöckl D, D Hondt H, Thienpont LM. Method validation across the disciplines Critical investigation of major validation criteria and associated experimental protocols. J Chromatography B 2009; 877: 2180-90. 16. Sturgeon CM, Berger P, Bidart JM, Birken S, Burns C, Norman RJ, Stenman UH, on behalf of the IFCC Working Group in hcg. Differences in recognition of the 1 st WHO international reference reagents for hcg-related isoforms by diagnostic immunoassays for human Chorionic Gonadotropin. Clin Chem 2009; 55: 1484-91. 17. Vesper HW, Miller WG, Myers GL. Reference materials and commutability. Clin Biochem Rev 2007; 28:139-47. 18. Vesper HW, Thienpont LM. Traceability in laboratory medicine. Clin Chem 2009; 55: 1067-75. 19. Westgard JO. Managing quality vs measuring uncertainty in the medical laboratory. Clin Chem Lab Med 2010; 48; 31-40. 20. Whicher JT. Secondary reference materials. Clin Biochem 1998; 31: 441-6. 21. White GH, Farrance I. On behalf of the AACB Uncertainty of Measurement Working Group. Uncertainty of measurement in quantitative medical testing a laboratory implementation guide. Clin Biochem Rev 2004; 25: 1-24. Adres do korespondencji: Zakład Biochemii Klinicznej P-A Instytut Pediatrii UJ CM 30-663 Kraków, Ul. Wielicka 265 15