Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: TERAPIA GENOWA
Plan ćwiczeń Ćwiczenie 1: Przygotowanie warsztatu terapii genowej 1. Kontrola jakościowa preparatów plazmidowych paav/lacz, paav/gfp Ćwiczenie 2: Transfer genów do komórek 1. Transfekcja komórek (HEK293; B16F10) kompleksami paav/lacz:pei oraz paav/gfp:pei Ćwiczenie 3: Ekspresja transgenu 1. Badanie ekspresji genu wprowadzanego do komórek na plazmidzie paav 2. Badanie obecności sekwencji transgenu (GFP) z wykorzystaniem techniki PCR
Ćwiczenie 1 Kontrola jakościowa preparatów plazmidowych paav/lacz, paav/gfp: 1. Wirowanie hodowli bakteryjnej nocnej paav/lacz (paav/gfp). 2. Izolacja plazmidowego DNA z komórek bakteryjnych z wykorzystaniem komercyjnego zestawu odczynników (Miniprep, Qiagen) 3. Cięcie enzymatyczne wyizolowanego plazmidowego DNA rozdział elektroforetyczny 4. Reakcja PCR (RedTaq, Stratagene) na wybraną sekwencję plazmidu (LacZ/GFP) rozdział elektroforetyczny Ad.1. Ad.2. Pobrać po 2ml hodowli bakteryjnej (paav/lacz; paav/gfp) do dalszej analizy (miniprep); Odwirować 2ml hodowli bakteryjnej: >8000 rpm, 3 RT; odrzucić supernatant Osad zawiesić w 250 µl buforu P1, przenieść do świeżego eppendorfa Do probówki dodać kolejne 250 µl buforu P2, dokładnie wymieszać obracając probówkę kilkukrotnie Dodać 350 µl buforu N3 i wymieszać jak poprzednio Zwirować: 13000rpm, 10min Supernatant przenieść na kolumnę do wirowania (QIApreo spin kolumn) Zwirować 1, odrzucić przesącz Przepłukać kolumnę 0,75ml buforu PE i wirować przez 1 Odrzucić przesącz, kolejne wirowanie: 1 13000rpm W celu wyeluowania pdna kolumnę przenieść do nowego eppendorfa, delikatnie nakroplić na nią 50 µl H 2 O, pozostawić na 1-5 na blacie, zwirować (1 ) Ad.3. Objętość reakcyjna: 20 µl Stężenie wyjściowe pdna(paav/lacz): Do reakcji: 1-2 µg pdna Bufor reakcyjny 10X 1X Enzym restrykcyjny:10u/µl/reakcję Wielkość fragmentów po cięciu: Ø Cięcie enzymatyczne Bufor 2 µl 2 µl NotI - 1 µl H 2 O pdna Inkubacja mieszaniny reakcyjnej przez 1h, 37 o C Przygotowanie 1,8% żelu agarozowego (2,52 g agarozy/140 ml buforu 1X TBE (Trisacetate); podgrzać w mikrofalówce do momentu uzyskania klarownego roztworu, co
jakiś czas mieszając zlewkę z płynem; dodać BrEt (5 µg/µl 5 µg/ml); przelać roztwór do saneczek elektroforetycznych, pozostawić żel do zastygnięcia) Elektroforeza agarozowa: nałożyć po 10 µl/studzienkę mieszaniny reakcyjnej zmieszanej z obciążnikiem (2 µl) + marker wielkości w ilości 4 µl ( na pierwszą z brzegu studzienkę); 30-40min, 100V; po wskazanym czasie żel sprawdzić podświetlając go promieniami UV Ad.4. Objętość reakcyjna: 20 µl Stężenie wyjściowe pdna(paav/gfp): Do reakcji: 100 ng pdna Bufor reakcyjny 10X 1X dntps: 10mM RedTaq: 1U/ µl Wielkość produktu: Warunki reakcji: 94 o C 5 94 o C 30 55 o C 30 72 o C 30 72 o C 10 4 o C 30 cykli 1 Bufor 10X 2 µl dntps 2 µl Forward 1 µl Reverse 1 µl RedTaq 1 µl H 2 O pdna
Ćwiczenie 2 Transfekcja komórek (HEK293; B16F10) kompleksami pdna:pei Protokół opisuje ilości na 1 (6cm) płytkę; PEI=polietylenoimina Wyjściowe stężenie PEI 10X (rozcieńczyć w wodzie do 1X) Stężenia plazmidów paav/lacz st.: paav/lacz st pdrive/lacz: paav/gfp: współczynnik kompleksowania R= µl PEI/µg DNA (R=2) Przygotować mieszaninę PEI (0,1X) z NaCl: 20 µl 1X PEI + 100 µl NaCl Przygotować mieszaninę pdna w NaCl; 10 µg (?µl) pdna dopełnić do 120 µl NaCl Dodać ( kropla po kropli ) mi PEI do miu pdna, delikatnie wymieszać, 20-30min 37 o C Zmienić pożywkę na płytkach z komórkami (2,5ml poż.mem 2%FBS) Dodać mi PEI z pdna na płytki z komórkami Liczenie komórek w komorze Burkera Po 10 µl zawiesiny komórek odpipetować na komorę nad i pod środkowym rowkiem, przykryć szkiełkiem nakrywkowym i liczyć wg wzoru: LICZBA KOM. W 1ML= N 10000 CAŁKOWITA LICZBA KOM. = N 10000 ROZCIEŃCZENIE
Ćwiczenie 3 Badanie ekspresji genu wprowadzanego do komórek na plazmidzie paav lub z wykorzystaniem raav: 1. Zebranie komórek z płytek po transfekcji 2. Liza termiczna osadu komórkowego 3. Test Beta-gal 4. Test Beta-gal in situ (Stratagene) Ad.1. Ściągnąć pożywkę znad powierzchni komórek, dwukrotnie przepłukać je PBSem (2-3ml/płytkę); Płytki z komórkami delikatnie zeskrobać (scaper) z powierzchni płytki i zawieszone w PBSie przenieść do probówki 15ml Zwirować 3, RT, 1500 rpm, supernatant delikatnie ściągnąć ssawką nie naruszając osadu komórkowego Ad.2. Osad komórek zawiesić w buforze 0,25M Tris ph=8 w ilości 50-200 µl/próbę, roztwór powinien być mętny; (-70 o C 10min, 37 o C 10min)3 Wirowanie: 12000 rpm, 10min, 4 o C Zebrać supernatant (lizat białkowy), w trakcie początkowych etapów eksperymentu trzymać na lodzie (nadmiar mroźić w -20 o C) Ad.3. Odpipetować do nowej probówki 10 µl lizatu białkowego /próbę Odpipetować tą samą ilość (co lizatu białkowego) samego buforu Tris (próbka ślepa która posłuży do kalibracji) Dodać 3 µl 100X Mg/próbę Dodać 50 µl substratu ONPG/próbę Dopełnić do 300 µl buforem fosforanowym (0,1 M Na 3 PO 4 ) Inkubacja w 37 o C, 30-60min (żółte zabarwienie) Blokowanie reakcji: 500 µl węglanu sodu (1M Na 2 CO 3 ) Pomiar absorbancji przy wartości 420nm Pomiar ilości białka całkowitego (met.lowry: 10 µl lizatu białkowego, 50 µl odczynnika A + 450 µl odczynnika B, zworteksować, 15-20 RT) przy wartości 750nm Obliczyć współczynnik Abs 420/Abs 750 Ad.4. Ściągnąć ssawką medium znad komórek Dodać na płytkę z komórkami 3ml 1X roztworu utrwalającego (fiing solution), inkubować 10 RT Ściągnąć z płytki utrwalacz, przepłukać komórki dwukrotnie 1X PBSem (4ml/płytkę) Dodać 2ml świeżego 1X roztworu wybarwiającego (staining solution), inkubować 15min-24h, 37 o C Po ściągnięciu roztworu wybarwiającego komórki, przepłukać je 1X PBSem (4ml/płytkę) Dokonać analizy mikroskopowej
Badanie obecności sekwencji transgenu (GFP) z wykorzystaniem techniki PCR: 1. Zebranie komórek z płytek po transfekcji/infekcji 2. Izolacja DNA (Sherlock, alternatywnie Qiagen) 3. Pomiar stężenia DNA 4. Reakcja PCR Ad.1. Osad komórkowy zawiesić w Ad.2. Osad komórkowy zawiesić w 0,3ml buf.te, zworteksować Dodać 0,3ml buf. L 1.4, zworteksować Dodać 20 µl Proteinazy K, zworteksować Inkubacja w 50 o C co jakiś czas worteksując próbkę do momentu całkowitego zlizowania komórek Lizat przenieść na kolumnę z żółtym korkiem (filtr 1), zwirować 5000 rpm 1 Usunąć kolumnę, przesącz nanieść na kolumnę z niebieskim korkiem (Spin 10 AX), zwirować 5000 rpm 1 Wylać przesącz i ponownie włożyć kolumnę do probówki, dodać 0,6ml roztworu K2, 5000 rpm 1 Powtórzyć poprzednią czynność Przenieść kolumnę do nowej probówki (2ml) i dodać 0,35ml roztworu elucyjnego K3, 2 RT, następnie 5000 rpm 1 Ponownie dodać 0,35ml roztworu K3, następnie zwirować 5000 rpm 1 Usunąć kolumnę, eluat (w nim DNA) przenieść do probówki (1,5ml) dodając 5 µl Wzmacniacza precypitacji oraz 0,6ml izopropanolu, całość wymieszać, zwirować 12000 rpm 5 Po odwirowaniu zlać supernatant (osad DNA niebiesko-zabarwiony) i dodać 70% EtOH, wymieszać, 12000 rpm 5 Po wirowaniu zlać supernatant, osad osuszyć przez odwrócenie probówki na 10min w RT Osad po wyschnięciu zawiesić w wodzie dest./buforze TE/10mM ph =8 Ad.3. Przygotować 60-krotne rozcieńczenie DNA do pomiaru spektrofometrycznego (objętość próby: 600 µl) Dokonać pomiaru absorbancji badanej próby przy następujących długościach fal: Abs 260 oraz Abs 280 Obliczyć stężenie DNA wg formuły: Abs 260*współczynnik dsdna (50)*rozcieńcznie (60)
Ad.4. Objętość reakcyjna: 20 µl Stężenie wyjściowe pdna(paav/gfp): Do reakcji: 100 ng pdna Bufor reakcyjny 10X 1X dntps: 10mM RedTaq: 1U/ µl Długość produktu: 1 Bufor 10X 2 µl dntps 2 µl Forward 1 µl Reverse 1 µl RedTaq 1 µl H 2 O pdna Warunki reakcji: 94 o C 5 94 o C 30 55 o C 30 72 o C 30 72 o C 10 4 o C 30 cykli