Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: MOLEKULARNE PODSTAWY BIOTECHNOLOGII

Transkrypt

1 Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: Zakład Biologii Molekularnej Wydział Farmaceutyczny, WUM ul. Banacha 1, Warszawa tel ,

2 ĆWICZENIE 1 IZOLACJA raav Z KOMÓREK PAKUJĄCYCH AAV293 cz.i 1. Osad komórek AAV293 z wirusem raav zawiesić w buforze do lizy (15ml buforu/10 stransfekowanych płytek), delikatnie wymieszać, przenieść całość do jednej probówki, 2. Liza termiczna osadu komórek AAV293 zawierających raav: przygotować łaźnię z suchym lodem (-70 C ) oraz termoblok (37 C ), inkubować lizaty komórkowe naprzemiennie w -70 C (10min) oraz 37 C (10min), cykl inkubacji powtórzyć 3x vorteksując lizaty po każdej inkubacji w 37 C, 3. Do probówki z zawiesiną dodać odpowiednią ilość Benzonase (Sigma): 750U, następnie inkubować 30min w 37 C, 4. Zwirować zawiesiną z treścią komórkową: 5700rpm, 20min, RT (room temperature), supernatant przenieść do nowej probówki, 5. Przygotować narzędzia i odczynniki do nawarstwienia bańki (Becman): sterylne szklane strzykawki i igły do punkcji, przenieść lizat wirusowy do bańki unikając tworzenia bąbli, 6. Powoli podwarstwić lizat wirusowy iodixanolem o zwiększającej się %, UWAGA: W BAŃCE NIE MOGĄ ZNALEŹĆ SIĘ BĄBLE POWIETRZA! ILOŚĆ [ml/1 bankę] %IODIXANOLU 9 15%iodixanol, 1M NaCl, PBS-MK 6 25%iodixanol, Phenol Red, PBS-MK 5 40%iodixanol, PBS-MK 5 60%iodixanol, Phenol Red 7. Bankę z nawarstwionym lizatem wirusowym dopełnić od góry buforem do lizy, pozbyć się bąbli powietrza, 8. Zatknąć szyjkę bańki, uprzednio posmarowaną substancja oleistą, metalowym korkiem; zgrzać szyjkę dociskając korek rozgrzanym ramieniem zgrzewarki, przytrzymać korek do momentu, gdy szyjka przestanie się odkształcać, ściągnąć delikatnie korek, pozostawić bańkę przez noc w 4 C, *Protokół przygotowany jest na 10 (15cm) płytek z komórkami AAV293 2

3 ĆWICZENIE 2 IZOLACJA raav Z KOMÓREK PAKUJĄCYCH AAV293 cz.ii 1. Umieścić bańki w rotorze do ultrawirówki (Type 60 Ti Becman), zamknąć bańki czerwonymi wieczkami, zakręcić pokrywę rotora, umieścić rotor w ultrawirówce; wirować 85min, rpm, 18 C, 2. W tym czasie przepłukać kolumny heparynowe (Heparin-agarose type I), uprzednio wylewając z nich zawartość znad złoża, 5 ml buforu 1X PBS-MK, czynność powtórzyć 3x, (Alternatywnie kolumny można zwirować umieszczając je w probówce (Falcon 50ml): 5min, 700rpm) 3. Po wirowaniu bańkę umieszczamy na statywie; jedną igłę (jednorazową) wbijamy w górną część bańki, drugą (z podpiętą strzykawką) w przezroczystą warstwę na dolnej granicy 40% iodixanolu, ostrożnie i delikatnie zaciągać oczyszczony lizat raav (1-3ml) i przenosimy na przepłukana kolumnę heparynową; Wirus powinien przejść przez kolumnę swobodnie, pod wpływem sił grawitacji, 4. Po zatrzymaniu się lizatu wirusowego w kolumnie, przepłukać kolumnę kolejnymi porcjami (3,5ml+3,5ml+3ml) buforu 1X PBS-MK (alternatywie zwirować jak poprzednio), 5. Nanieść na kolumnę bufor do elucji 1M NaCl PBS-MK (2ml+3,3ml: kolejne porcje eluatu zebrać do oddzielnych nowych probówek), 6. Probówki z raav mrozimy w -80 C *Protokół przygotowany jest na 10 (15cm) płytek z komórkami AAV293 3

4 Uwodnienie membrany ĆWICZENIE 3 Preparatyka raav DIALIZA raav Bufor dializacyjny: 1X PBS, x obj. próbki, Czas trwania dializy: 2h zmiana buforu, 2h zmiana buforu noc, 4oC, zebranie próbki 1. Kasetę z membraną zanurzyć w buforze dializacyjnym na 30sek., 2. Wyjąć kasetę z buforu, nadmiar płynu osuszyć dotykając brzegiem kasety papierowy ręcznik, UWAGA: MEMBRANA NIE MOŻE DOTKNĄĆ ŻADNEJ POWIERZCHNI! Wypełnienie kasety dializacyjnej próbką 1. Napełnić strzykawkę próbą zostawiając w niej niewielką ilość powietrza, 2. Delikatnie przebić się przez jeden z czterech portów dializacyjnych (w rogu kasety) nie wsuwając igły zbyt głęboko! 3. Powoli naciskać tłok strzykawki, wypuszczając jej zawartość, 4. Po wstrzyknięciu próby należy pozbyć się powietrza wciągając je do strzykawki przy jednoczesnym wysuwaniu igły z portu, Usuwanie próby z kasety dializacyjnej 1. Nabrać powietrza do strzykawki (objętość powietrza ma być dwukrotnie większa niż objętość próbki), 2. Przebić igłą inny, niż przy wpuszczaniu próby, port dializacyjny, wpuścić powietrze, a następnie obrócić kasetę tak, by port z igłą znajdował się na na dole, zaciągnąć całą próbę do strzykawki, wysunąć igłę, TRAWIENIE raav DNAZĄ I ORAZ PROTEINAZĄ K 1. Przygotować probówki o objętości 0,5ml, przygotować mix odczynników zgodnie z danymi w tabeli (Vkońcowe=50 µl), odczynnik µl/próbę Stężenie końcowe 10X bufor 5 1X(10mM Tris HCl, 2,5mM MgCl2, 0,1mM CaCl2) DNase I 3,7 7500U/ml H2O 36,3? raav 5? 2. Inkubować próbę 30min w temp.37 C, 3. Inaktywować DNazę I poprzez inkubację próby przez 10min w 65 C, 4. Do części prób potraktowanych DNazą dodać 2 µl Proteinazy K (20 µg), inkubować 60min. w 50 C, 5. Inaktywację Proteinazy przeprowadzić poprzez 20min. inkubację próby w 95 C, 4

5 PRZYGOTOWANIE KRZYWEJ WZORCOWEJ paavlacz DO REAKCJI qpcr (kolejne ćwiczenia) 1. Przeliczenie stężenia paav/lacz na liczbę kopii cząsteczek plazmidu przypadająca /µl Dane: Wlk.plazmidu: 7272bp Stężenie plazmidu: 5243,3 ng/µl = 5,243 µg/µl Algorytm liczenia: Założenie: 1bp (base pair)=650g/mol (dsdna) UWAGA! Miano wirusa określa się na podstawie krzywej wyliczonej dla ssdna 1b=325 g/mol 1base g/mol 7272bases X g/mol X g w 1 molu (6,022*10^23 cząstek substancji) 1 g to Y cząstek Y/10^6 = ilość cząsteczek/µg 1 µg Y/10^6 cząstek 5,243µg (w 1 µl) Z cząstek Ilość cząstek plazmidu/µl (I rozcieńczenie): Ilość cząstek plazmidu/reakcję (I rozcieńczenie): Kalkulator: 2. Przygotowanie seryjnych rozcieńczeń (10-krotnych) plazmidu paav/lacz; Vkońcowa= 50µl, zakres rozcieńczeń: X*10^11 - X*10^23 Przygotować odpowiednią ilość probówek ze sterylną wodą (po 45µl), Do pierwszej probówki (I rozcieńczenie) przenieść 5µl stocku plazmidu paav/lacz, zworteksować i tą samą ilość rozcieńczonego plazmidu przenieść do kolejnej probówki (rozcieńczenie I), Kolejne rozcieńczenia przygotować w ten sam sposób, Seryjne rozcieńczenia przechowywać w temperaturze -70 C 5

6 ĆWICZENIE 4 Szacowanie miana raav REAKCJA REAL-TIME PCR (SYBRGreen) 1. Przygotować reakcję real-time PCR: Rozmrozić odczynniki oraz materiał do badania, W reakcji qpcr należy uwzględnić: o 8 punktów krzywej wzorcowej: X*10^10 - X*10^3 o raav2 niedializowany 1X [ND] o raav2 dializowany 1X [D] o raav2 niedializowany DNase(+) 1X [ND,Dnase] o raav2 dializowany DNase(+) 1X [D,Dnase] o raav2 niedializowany DNase(+)Protease(+) 1X [ND,Dnase, Prot.] o raav2 dializowany DNase(+)Protease(+) 1X [D,Dnase, Prot.] o NTC: non template control Przygotować mix reakcyjny (Vkońcowa=25µl/próbę): ODCZYNNIK ilość µl /1 próbę ilość µl/ prób BUFOR 12,5 SYBRGreen Primer F 1,25 Primer R 1,25 H2O 8 DNA 2 Rozporcjować mix na płytce w ilości pomniejszonej o matrycę, która będzie dodana do każdej studzienki, W pierwszej kolejności, w wyznaczonym, na poniższym schemacie, miejscu, do studzienki z mixem reakcyjnym dodać wodę (NTC); następnie rozpipetować kolejne punkty krzywej wzorcowej, a w ostatniej kolejności do studzienek na płytce dodać materiał badany; zaraz po nałożeniu 1 pełnej kolumny studzienek, należy zabezpieczyć ją wieczkiem, Rozkład punktów krzywej wzorcowej oraz prób na płytce: 6

7 Po nałożeniu wszystkich prób na płytkę należy ją zrównoważyć i zwirować (1, 2200rpm), następnie wstawić do aparatu (ABI 7500) i wprowadzić odpowiednie ustawienia w programie do qpcr, Omówienie wyników: 7