Ćwiczenie 3 ANALIZA I CZYSZCZANIE BIAŁEK Część doświadczalna obejmuje: rozdział białek zawartych w surowicy krwi metodą elektroforezy w żelu agarozowym rozdział hemoglobiny od chromianu potasu metodą sączenia żelowego na kolumnie Sephadex G-15 (odsalanie hemoglobiny) WPRWADZENIE Poznanie funkcji określonego białka wymaga jego wyizolowania i oczyszczenia (oddzielenia) od tysięcy innych białek obecnych w badanych ekstraktach komórkowych lub tkankowych. Białko można oddzielić od innych cząsteczek, w tym również od innych białek, wykorzystując różnice w: rozpuszczalności, wielkości cząsteczek, w wielkości ładunku, a także w powinowactwie do specyficznych grup chemicznych. Różnice między poszczególnymi białkami w ich rozpuszczalności wykorzystywane są w metodzie frakcjonowania białek poprzez wysalanie lub wytrącanie na skutek obniżania stałej dielektrycznej roztworu. Białka zawierające małe cząsteczki (np. siarczan amonu używany do wysalania) można oddzielić metodą dializy przez błonę półprzepuszczalną (np. błona celulozowa) bądź metodą filtracji żelowej. Chromatografia metodą filtracji żelowej umożliwia rozdział cząsteczek różniących się wielkością. Powszechnie stosowanymi żelami są preparaty handlowe takie jak: Sephadex, Sepharose czy Biogel. Sephadex produkuje się z naturalnego dekstranu wytwarzanego przez Leuconostoc mesenteroides (paciorkowce heterofermentatywne; fakultatywne anaeroby). Ten wielkocząsteczkowy glikan zawiera 90-95% wiązań α-1-6 glikozydowych, a pozostałe wiązania są typu 1-3 (Ryc. 1). Różne rodzaje żelu Sephadex uzyskuje się z dekstranu o różnej masie cząsteczkowej, który dodatkowo sieciuje się w reakcji z epichlorohydryną. Liczba wytworzonych mostków określa rozmiary oczek w utworzonej w ten sposób sieci. Im więcej poprzecznych mostków znajduje się w sieci, tym mniejsze są jej oczka. W ten sposób produkuje się serię żeli Sephadex o różnych liczbach G wskazujących na rozmiary oczek, umożliwiających frakcjonowanie i rozdział analizowanych związków w szerokim zakresie mas cząsteczkowych (Tabela 1). Żelem o najmniejszych oczkach jest Sephadex G-10, natomiast największe oczka posiada Sephadex G-200. Do oddzielenia związków o małej masie cząstecz- 1
kowej od wielkocząsteczkowych białek najlepiej nadają się kolumny Sephadex G-10 lub G- 15, natomiast do rozdziału białek różniących się wielkością kolumny Sephadex G-50 do G- 200 (Ryc. 2). Na Ryc. 2 pokazano zasadę rozdziału substancji różniących się wielkością cząsteczek na kolumnie Sephadex. Ryc. 1. Fragment struktury żelu Sephadex (widoczne są wiązania α-1-6 glikozydowe oraz mostki powstałe w reakcji z epichlorohydryną) (Kłyszejko-Stefanowicz 2005) Tabela 1. Charakterystyka żeli Sephadex G (Kłyszejko-Stefanowicz 2005) 2
Ryc. 2. Rozdział cząsteczek o różnej wielkości na kolumnie Sephadex (Koolman i Röhm 2005) Chromatografia jonowymienna wykorzystuje różnice w ładunkach wypadkowych poszczególnych białek. Białka, które w określonym ph będą naładowane ujemnie można rozdzielać na anionitach np. na dietyloaminoetylocelulozie (DEAE-celuloza), białka naładowane dodatnio można rozdzielać na kationitach np. karboksymetylocelulozie (CM-celuloza). W chromatografii powinowactwa wykorzystuje się powinowactwo wielu białek do specyficz- 3
nych grup chemicznych. W ten sposób można związać określone białko enzymatyczne do nośnika chromatograficznego, do którego wcześniej został sprzęgnięty substrat, analog substratu bądź specyficzny inhibitor tego enzymu. Białka regulujące ekspresję genów można związać do odpowiedniej sekwencji nukleotydowej DNA unieruchomionej na nośniku chromatograficznym, itd. Wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa (HPLC) wykorzystuje materiały wypełniające kolumnę o znacznie większym rozdrobnieniu niż w klasycznych chromatografiach cieczowych i dlatego aby uzyskać odpowiednią szybkość przepływu konieczne jest zastosowanie zwiększonego ciśnienia. Powszechną metodą rozdziału białek jest elektroforeza w różnych nośnikach. Cząsteczka obdarzona ładunkiem wypadkowym porusza się w polu elektrycznym, a szybkość jej wędrówki (v) zależy od natężenia pola elektrycznego (E), od wypadkowego ładunku cząsteczki białka (z) i współczynnika tarcia (f): v = Ez/f Współczynnik tarcia zależy od wielkości i kształtu cząsteczki migrującej oraz od lepkości środowiska. Rozdział elektroforetyczny prowadzi się prawie zawsze w żelu lub na bibule. Dawniej jako nośników, oprócz bibuły chromatograficznej, używano także żelowanej skrobi oraz folii z octanu celulozy; obecnie poza octanem celulozy powszechnie używa się żeli agarozowych i poliakryloamidowych, umożliwiających najwyższą rozdzielczość. Agaroza jako antykonwekcyjny nośnik do elektroforezy została zaproponowana przez Hjertena w 1961 r. d tego czasu jest niezastąpionym nośnikiem, zwłaszcza do różnego typu immunoelektroforez, a także do rozdziału i analiz kwasów nukleinowych. Rozdziały elektroforetyczne tych biopolimerów w agarozie można wykonywać zarówno na skalę analityczną jak i preparatywną. Agaroza jest polisacharydem (główny składnik agaru) zbudowanym z powtarzających się reszt β-d-galaktopiranozy i 3,6-anhydro-α-L-galaktopiranozy połączonych wiązaniami 1-3 oraz 1-4. Ryc. 3 przedstawia powtarzającą się podjednostkę agarowy. bie reszty galaktozowe w agarozie mogą być w różnym stopniu podstawione grupami siarczanowymi, metoksylowymi, karboksylowymi i pirogronianowymi. Agaroza używana do elektroforezy powinna charakteryzować się jak najniższą zawartością zjonizowanych grup (siarczanowych, karboksylowych), które otoczone są dodatnio naładowanymi przeciwjonami. H CH 2 H H H Ryc. 3. Budowa agarozy (powtarzający się fragment) 4
W polu elektrycznym ruchliwe przeciwjony, wraz z towarzyszącą im otoczką, migrują w kierunku katody. Taki przepływ solwentu (nazywany elektroendoosmozą), zależny jest od liczby zjonizowanych grup w agarozie i zachodzi w kierunku przeciwnym niż wędrówka rozdzielanych białek, wpływając niekorzystnie na jakość ich rozdziału. Wielkość elektroendosmozy jest wyznaczana na podstawie wędrówki substancji nie posiadającej ładunku elektrycznego np. dekstranu i jest wyrażana jako względna ruchliwość elektroforetyczna (M r ) dekstranu w odniesieniu do ruchliwości elektroforetycznej albuminy. Ponieważ dekstran wędruje w kierunku przeciwnym do albuminy, wartość M r ma znak ujemny. W sprzedaży występują trzy podstawowe typy agarozy: o niskiej (M r <0.02), średniej (M r < 0.13) i wysokiej (M r > 0.25) elekroendosmozie. Do elektroforezy białek używa się dwóch pierwszych typów agarozy. W stężeniach > 0.1% i w temperaturze niższej od 40 0 C agaroza zestala się, tworząc żel. Po ogrzaniu do temperatury > 90 0 C, topi się przechodząc w postać zolu. Podczas ochładzania poszczególne łańcuchy polisacharydowe tworzą podwójne helisy, które następnie łączą się w pęczki i tworzą stabilny żel o oczkach, których wielkość uzależniona jest od stężenia agarozy. Elektroforezę białek i kwasów nukleinowych wykonuje się najczęściej w 1 2% żelach agarozowych. Warunki elektroforezy (ph i siłę jonową) dobiera się najczęściej tak, aby sumaryczny ładunek elektryczny poszczególnych białek obecnych w próbie poddanej elektroforezie był ujemny i tak żeby różniły się one tylko wielkościami ładunku netto. W praktyce najczęściej stosuje się bufory zasadowe, których ph jest wyższe od wartości pi najbardziej zasadowych białek. W tych warunkach wszystkie rozdzielane białka poruszają się w jednym kierunku (do anody) lecz z różną szybkością, zależną od stopnia jonizacji. Należy dodać, że na jakość rozdziału wpływ ma również rodzaj użytego buforu. Po zakończeniu elektroforezy białka na elektroforegramie denaturuje się (utrwala) w mieszaninie kwasu octowego i metanolu (lub etanolu), wskutek czego białka stają się nierozpuszczalne. Unieruchomione białka można teraz wybarwiać. Do wybarwiania używa się różnych barwników oddziałujących jonowo z białkami (są to najczęściej barwniki sulfonowe, pochodne lub analogiczne do stosowanych w przemyśle tekstylnym do barwienia wełny). Nadmiar niezwiązanego barwnika odmywa się, a wybarwione elektroforegramy poddaje się analizie jakościowej lub ilościowej. Ponieważ ilość związanego barwnika jest proporcjonalna do zawartości białka w danym prążku, dlatego mierząc densytometrycznie intensywność zabarwienia poszczególnych pasm można oznaczyć względne stężenie białek w rozdzielonych frakcjach (Tabela 2B). Metoda ta znajduje zastosowanie do analizy klinicznej białek surowicy krwi. Wzajemne proporcje białek surowicy krwi utrzymują się w określonych granicach, a zmiany tych proporcji są charakterystyczne dla różnych stanów patologicznych. 5
WYKNANIE Elektroforetyczny rozdział białek zawartych w surowicy krwi z użyciem aparatu i zestawu odczynników firmy Cormay (Gel protein 100) dczynniki i sprzęt: 1. Zestaw odczynników do elektroforezy firmy Cormay (Gel protein 100) A. Płytki z agarozą (folie) B. Bufor Tris-barbital (bufor weronalowy) koncentrat. Do elektroforezy rozcieńczyć wodą destylowaną zawartość ampułki 76 ml do 100 ml. Trwałość roztworu roboczego około dwa tygodnie w temp. pokojowej. C. Koncentrat barwnika (Czerń amidowa 10 B). Przygotować roztwór roboczy przez rozcieńczenie wodą destylowaną 1 ampułki 100 ml koncentratu do 300 ml. Trwałość roztworu roboczego powyżej miesiąca w temp. pokojowej. D. Roztwór odbarwiający koncentrat. 10 ml koncentratu rozcieńczyć woda destylowaną do 1000 ml. Trwałość 1 miesiąc w temp. pokojowej. E. Utrwalacz (135 ml 96% etanolu, 30 ml stęż. kwasu octowego i 135 ml wody destylowanej. Roztwór trwały około 3 miesiące w szczelnie zamkniętym naczyniu w temp. pokojowej. 2. Surowica krwi do analizy rozcieńczyć 7-krotnie buforem roboczym, bezpośrednio przed użyciem. 3. Zasilacz prądu stałego (do 150 V) i komora do elektroforezy Cormay S20. Folia poliestrowa z żelem agarowym (po stronie wewnętrznej) Miejsce naniesienia i kierunek wędrówki rozdzielanych białek Pokrywa komory anoda katoda Zbiorniki z buforem Ryc. 4. Schemat aparatu do elektroforezy firmy Cormay 6
Postępowanie Przygotowanie aparatury i prób do rozdziału 1. Ustawić poziomo komorę do elektroforezy i wlać po 150 ml buforu (B) do każdego z naczyń elektrodowych 2. Delikatnie wyjąć płytkę z agarozą z opakowania (nie dotykać powierzchni żelu!) i położyć na bibule żelem do góry. Wykonać tę czynność bezpośrednio przed naniesieniem próbek, tak by uniknąć wysuszenia żelu agarozowego 3. suszyć miejsce naniesienia próbek przez przyłożenie paska bibuły. Po kilku sekundach usunąć wilgotną bibułę 4. W osuszonym miejscu umieścić folię ze szczelinami (studzienkami) do nanoszenia próbek. Dwie skrajne szczeliny powinny pokrywać się ze znakami orientacyjnymi na folii. Delikatnie docisnąć folię do powierzchni żelu 5. Nanieść po 5 µl rozcieńczonej surowicy do każdej studzienki i pozostawić na kilka minut w celu przedyfundowania białek do żelu 6. Usunąć nadmiar surowicy przez przyłożenie paska bibuły. Zdjąć ostrożnie bibułę i folię 7. Zgiąć delikatnie płytkę z agarozą i umieścić ją w komorze tak aby końce były zanurzone w naczyniach elektrodowych, żel był skierowany do dołu, a miejsca naniesienia znajdowały się od strony katody (-) Rozdział elektroforetyczny 1. Zamknąć komorę pokrywą i połączyć przewodami z zasilaczem 2. Włączyć zasilacz i prowadzić elektroforezę 20 30 minut przy napięciu 100 V 3. Po zakończeniu elektroforezy wyłączyć zasilacz, wyjąć płytkę i zanurzyć ją na 15 minut w utrwalaczu w pozycji pionowej 4. Bardzo dokładnie wysuszyć płytkę suszarką fryzjerską lub w suszarce laboratoryjnej w 80 0 C Wybarwianie elektroforegramów 1. Zanurzyć płytkę w barwniku na 10 minut, a następnie odbarwić w 2 3 kolejnych kąpielach w odbarwiaczu (odczynnik firmy Cormay) 2. dbarwioną płytkę wypłukać w wodzie destylowanej i wysuszyć 7
pracowanie wyników Dokonać oceny wizualnej rozdzielonych frakcji, przygotować dokumentację rozdziału (rysunek lub kserokopię płytki, opisać rozdzielone frakcje białkowe). Przy opracowywaniu wyników należy zwrócić uwagę, że każda z wybarwionych frakcji zawiera po kilka białek, które nie różnią się ruchliwością elektroforetyczną (patrz Tabela 2A). Wyniki te świadczą o tym, że białka zawarte w poszczególnych frakcjach (albuminy, α 1 -, α 2 -, β- i γ-globuliny) mają podobne wartości pi (Tabela 2). Tabela 2. Białka osocza krwi (Koolman i Röhm 2005) 8
Usuwanie chromianu potasowego z roztworu hemoglobiny (odsalanie) metodą sączenia żelowego na kolumnie Sephadex G-15 W laboratoriach biochemicznych często zachodzi potrzeba oddzielenia od białek cząsteczek o małej masie (soli) np. usuwanie siarczanu amonu po wysalaniu białek. dsolić białka lub zmienić ich środowisko można na drodze dializy. Wielkość porów w stosowanej do tego celu błonie półprzepuszczalnej umożliwia przenikanie cząsteczek o małej masie, podczas gdy cząsteczki białka o znacznie większej masie nie przenikają przez błonę (Ryc. 5). Jednak dializa jest czasochłonna i wymaga wielokrotnej wymiany roztworu dializacyjnego, dlatego obecnie można ją z powodzeniem zastąpić sączeniem żelowym na kolumnie Sephadex G-10 lub G-15 Ryc. 5. Schemat dializy (Koolman i Röhm 2005) WYKNANIE dczynniki i sprzęt 1. Kolumna Sephadex G-15 w 0,9% roztworze NaCl 2. 1% roztwór chromianu (VI) potasu (m.cz. 194 Da); roztwór hemoglobiny (m.cz. 67 000 Da) w 0,9% roztworze NaCl 3. Butla z tubusem 4. Probówki z zaznaczoną objętością 2 ml 20 sztuk 5. Spektrofotometr 9
Postępowanie Zmieszać 0,5 ml 1% chromianu (VI) potasu z 0,5 ml roztworu hemoglobiny. Przy zamkniętym wypływie kolumny nałożyć na jej górną, odsłoniętą powierzchnię 1 ml uzyskanego roztworu. Po naniesieniu próby otworzyć wylot kolumny i poczekać aż cała naniesiona próba wniknie do nośnika (Uwaga! nie dopuścić do wniknięcia powietrza do nośnika (zapowietrzenia) kolumny). Zamknąć wylot kolumny i ostrożnie nanieść około 3 ml roztworu do elucji, a następnie podłączyć butlę z roztworem elucyjnym. tworzyć wylot kolumny i zbierać do probówek frakcje o objętości 2 ml (zebrać około 15 frakcji). Doświadczenie zakończyć po wypłynięciu z kolumny chromianu (VI) potasu. Następnie kolumnę dokładnie przemyć roztworem 0,9% NaCl (dwiema objętościami kolumny). Zmierzyć absorbancję poszczególnych frakcji przy długości fali λ = 410 nm (chromian (VI) potasu), a następnie przy 540 nm (hemoglobina), względem roztworu elucyjnego. W opracowaniu należy zestawić uzyskane wyniki w tabeli oraz przedstawić graficznie wyniki rozdziału. Zagadnienia do przygotowania: metody chromatograficzne stosowane w oczyszczaniu białek (chromatografia jonowymienna, chromatografia adsorpcyjna, filtracja żelowa, chromatografia powinowactwa, HPLC) elektroforeza i ogniskowanie izoelektryczne metody rozdziału białek wykorzystujące różnice w ich pi dializa i sączenie żelowe (filtracja żelowa) zasada i zastosowanie Literatura Biochemia JM Berg, JL Tymoczko, L Stryer PWN, Warszawa, 2005 Ćwiczenia z biochemii pod redakcją L. Kłyszejko-Stefanowicz, PWN, Warszawa, 2005 Biochemia. Ilustrowany przewodnik J Koolman, K-H Röhm, PZWL, Warszawa 2005 10