Substancje biologicznie aktywne z barszczu Sosnowskiego (Heracleum Sosnowsky Manden)

Transkrypt

1 Anna Tomaszkiewicz-Potępa, Otmar Vogt* Politechnika Krakowska Substancje biologicznie aktywne z barszczu Sosnowskiego (Heracleum Sosnowsky Manden) Biologically active compounds from Sosnowski s hogweed (Heracleum Sosnowsky Manden) Barszcz Sosnowskiego (Heracleum Sosnowsky) jest sprowadzoną z Kaukazu, trudną do wytępienia rośliną inwazyjną, występującą w wielu krajach Europy Środkowej, po nieudanych próbach wykorzystania go jako rośliny paszowej. Wtórne metabolity obecne w jego nasionach mogą być wykorzystywane w technologiach małotonażowych, jako substancje biologicznie aktywne lub jako półprodukty do syntezy odpowiednich pochodnych. W pracy zaproponowano metodykę pozyskiwania i rozdziału ekstraktów z ww. surowca, możliwą do zastosowania w większej skali. Dried or frozen seeds, stems and leaves of Sosnovski hogweed were extd. with EtOAc. After removal of the solvent by vacuum evapn. The exts. were disperged in H 2 O and reextd. with n-hexane, tetrahydrofurane, CH 2 Cl 2, PhMe and CCl 4 to sep. the exts. into resp. fractions. Psolarene, angelicine, Me(CH 2 ) 7 OAc and 5-pentadecanolide were identified in the fractions by gas chromatog., IR and H-NMR spectroscopy. Substancje biologicznie aktywne, wykorzystywane m.in. w kosmetyce, farmacji lub ochronie roślin, są otrzymywane metodami syntezy chemicznej lub wyodrębniane z surowców naturalnych. Obie te metody, często łączone, były przedmiotem wielu badań. Wśród aktywnych substancji ważne miejsce zajmują estry alkoholi tłuszczowych, naturalne antyutleniacze oraz furanokumaryny, zarówno o budowie linearnej (psolaren i pochodne) jak i angularnej (angelicyn i pochodne). Podstawowe struktury wymienionych związków zamieszczono na rys.. Rys.. Furanokumaryny o budowie psolarenu i angelicynu Fig.. Furanocoumarins of psolaren and angelicin structures W praktyce medycznej związki te są stosowane m.in. w przypadku takich chorób skóry, jak łuszczyca i bielactwo ), talasemia 2), a także jako czynniki antykonwulsyjne 3) oraz jako substancje wspomagające kurację anty-hiv 4). Mogą być również stosowane w preparatach łagodzących skutki zmiany czasu (jet lag suppressant) 5,6). Fotoaktywność furanokumaryn w stosunku do DNA i RNA różnych organizmów 7) umożliwia wykorzystywanie ich w analityce biochemicznej 8-0), a także jako potencjalny składnik preparatów biobójczych,2). Pozyskiwanie furanokumaryn prowadzone jest poprzez (i) syntezę organiczną, obejmującą zarówno przemiany zachodzące bez zmiany szkieletu węglowego, jak i produkcję odpowiednich pochodnych ze znacznie prostszych związków 2 6), (ii) wyodrębnianie z hydroponicznych hodowli korzeni włoskowatych roślin infekowanych odpowiednimi mikroorganizmami 7, 8), lub (iii) rozdział ekstraktów uzyskanych z naturalnych źródeł roślinnych, np. z olejku bergamotowego ). Aktywność biologiczna alkoholi szeregu C 4 C 20 oraz ich estrów została potwierdzona w licznych badaniach wykonywanych zarówno na czystych substancjach, jak i kompozycjach wyodrębnianych z surowca roślinnego (przeważnie olejki eteryczne). Dla olejków otrzymanych z różnych gatunków rodzaju Heracleum potwierdzono aktywność biologiczną tych związków, w stosunku do mikroorganizmów, takich jak Pseudomonas syringae, Xanthomonas campestris, Dr Anna TOMASZKIEWICZ-POTĘPA w roku 970 ukończyła studia na Wydziale Mat-Fiz- Chem Uniwersytetu Jagiellońskiego. Jest adiunktem w Katedrze Technologii Organicznej i Procesów Rafineryjnych Politechniki Krakowskiej. Specjalność metody syntezy i zastosowania związków powierzchniowo czynnych oraz badania nad pozyskiwaniem i zastosowaniem substancji pochodzenia naturalnego. Dr inż. Otmar VOGT *) w roku 990 ukończył studia na Wydziale Inżynierii i Technologii Chemicznej Politechniki Krakowskiej. Doktorat z nauk chemicznych uzyskał na Wydziale Chemii Uniwersytetu Jagiellońskiego. Jest adiunktem w Katedrze Technologii Organicznej i Procesów Rafineryjnych Politechniki Krakowskiej. Specjalność kataliza oraz technologia organiczna, w tym badania nad pozyskiwaniem i zastosowaniem substancji pochodzenia naturalnego. * Autor do korespondencji: Instytut Chemii i Technologii Organicznej, Politechnika Krakowska, 3-55 Kraków, ul. Warszawska 24, tel.: (2) , fax: (2) , ozvogt@chemia.pk.edu.pl\ /7(200)

2 Aspergillus niger i Fusarium solari 9). Aktywność ta przejawia się w całkowitym zahamowaniu rozwoju tych mikroorganizmów. Szeroki przegląd estrów wykazujących aktywność w stosunku do Candida przedstawił Pauli 20), a Kubo i współpr. 2) zbadali działanie alkoholi tłuszczowych na liczne bakterie i grzyby. Octan n-oktylu (rys. 2), Rys. 2. Octan n-oktylu i 5-pentadekanolid Fig. 2. Octyl acetate and oxacyclohexadecan-2-one główny ester w ekstraktach z Heracleum, to związek aktywny w stosunku do organizmów wyższych 22) (toksyczność chroniczna u ssaków, hepatotoksyna), owadów 23) (repelent) oraz mikroorganizmów 20) (zahamowanie rozwoju). Również pozostałe estry z tej grupy wykazują silną aktywność biologiczną 24), wśród nich także laktony omega-hydroksykwasów (m.in. 5-pentadekanolid) 25). Większość rosnących w Polsce roślin zawierających w znaczących ilościach te związki, to rośliny obce w naturalnym polskim ekosystemie, hodowane jako ozdobne, przyprawowe lub spożywcze. Wyjątkiem jest barszcz Sosnowskiego (Heracleum Sosnowski Manden), sprowadzony do Polski ze Związku Sowieckiego w 958 r. i uprawiany na paszę dla zwierząt hodowlanych. Uprawę tę zarzucono, jednak roślina ze względu na wyjątkową odporność i bardzo duże możliwości adaptacyjne szybko rozprzestrzeniła się w stanie zdziczałym. Z powodu dużej zawartości substancji fotouczulających, typowej dla wielu roślin inwazyjnych, barszcz Sosnowskiego stał się groźnym dla ludzi i zwierząt, a jednocześnie trudnym do wytępienia chwastem 26, 27). W wielu rejonach Polski (a także innych krajów Europy Środkowej) stwarza on tak duże zagrożenie, że problematyka jego zwalczania stała się tematem międzynarodowego programu. Ponieważ jednak jest on łatwo dostępnym i tanim surowcem, możliwe stało się jego wykorzystanie jako źródła biologicznie aktywnych połączeń chemicznych. Działania takie mogą przyczynić się do ograniczenia rozprzestrzeniania się tej rośliny w sposób niekontrolowany. Opracowanie metodyki takiego zagospodarowania uciążliwego chwastu było celem niniejszej pracy. Część doświadczalna w wyparce próżniowej. Zerowy efekt ekstrakcji toluenem potwierdza całkowite wymycie subfrakcji rozpuszczalnej w dichlorometanie. Rozdział chromatograficzny Frakcje 2 i 3 poddano rozdziałowi chromatograficznemu na otwartej kolumnie o średnicy cm, stosując jako wypełnienie ditlenek krzemu (Sigma-Aldrich, Kieselgel mesh, 60Ǻ). Jako eluentu dla frakcji 2 użyto n-c 6 H 4 COOC 2 H 5 OH:CHCl 3 :0, M KOH w CH 3 OH w stos. obj. 40:20:20:20:, a dla frakcji 3 CH 2 Cl 2 COOC 2 H 5 :n-c 7 H 6 w stos. obj. ::6, otrzymując odpowiednio subfrakcje oraz Metody badań spektralnych Badania spektroskopowe IR zostały przeprowadzone z wykorzystaniem spektrometru FT-IR (Spektrometer BIO-RAD 75C). Widma H NMR rejestrowano na aparacie FT NMR BS 587A firmy TESLA BRNO o częstotliwości roboczej 80 MHz, z wzorcem wewnętrznym TMS, w CDCl 3 (subfrakcja 2.8 w DMSO). Widma UV-Vis wykonano na aparacie firmy Stellar Net Inc. Model EPP 2000C o zakresie nm. Spektroskopia masowa Analizę GC-MS wykonano na chromatografie gazowym z detektorem masowym firmy Agilent Technologies 6890N Network GC System, stosując detektor 5975C inert XL MSD, bibliotekę widm masowych NIST 95, nastrzyk 0,2 ml (z zastosowaniem autosamplera 7863B Agilent), split 50:, kolumnę uniwersalną HPMS-5, objętościowe natężenie gazu nośnego (He) 2 cm 3 /min, temperaturę dozowania 270 C, program temperaturowy C z narostem temperatury 0 C/min., C przez 2 min i w 250 C przez 5 min. Omówienie wyników We wstępnych badaniach porównano efektywność ekstrakcji różnych morfologicznie części rośliny, o różnym stopniu dojrzałości i odmiennym sposobie przechowywania. Wyniki przedstawione na rys. 3 wskazały jednoznacznie, że pożądane efekty ekstrakcji można osiągnąć wychodząc z suchych dojrzałych nasion. Dodatkową zaletą takiego surowca jest również stabilność i powtarzalność składu, niezależnego od stopnia dojrzałości rośliny, gleby, nasłonecznienia i innych Surowiec Jako surowiec wykorzystano dziko rosnący Barszcz Sosnowskiego, zebrany na terenie woj. małopolskiego i identyfikowany w Katedrze Ochrony Roślin Uniwersytetu Rolniczego w Krakowie. W badaniach wstępnych użyto liści, łodyg i nasion o różnym stopniu dojrzałości, zebranych latem i jesienią 2006 r., a następnie suszonych lub mrożonych. W zasadniczej części pracy surowcem były suche, dojrzałe nasiona barszczu, zebrane jesienią 2007 r. Ekstrakcja surowca Rozdrobniony surowiec ekstrahowano octanem etylu w sposób ciągły (aparat Soxhleta), uznając za koniec ekstrakcji praktyczny brak fluorescencji ekstraktu zbierającego się wokół gilzy wypełnionej materiałem biologicznym (lampa UV, 365 nm). Po zakończeniu procesu ekstrakcji, użyty rozpuszczalnik oddzielano w wyparce próżniowej. Rozdział ekstrakcyjny Substancje wyodrębnione z suchych dojrzałych nasion rozdzielano, dyspergując je w wodzie, a następnie frakcjonując metodą ciągłej ekstrakcji ciecz ciecz, przy zastosowaniu kolejno n-heksanu (), tetrahydrofuranu (2), dichlorometanu (3), toluenu (X zerowy efekt ekstrakcji) i chloroformu (4). Każdorazowo rozpuszczalniki oddzielano Rys. 3. Wydajność ekstrakcji z różnych morfologicznie części Barszczu Sosnowskiego. nasiona zielone suszone, 2 nasiona ½ dojrzałe suszone, 3 nasiona dojrzałe suszone, 4 nasiona zielone mrożone, 5 nasiona ½ dojrzałe mrożone, 6 nasiona dojrzałe mrożone, 7 łodygi suszone, 8 łodygi mrożone, 9 liście suszone, 0 liście mrożone Fig. 3. Efficiency of leaching morphologically different parts of Sosnowski hogweed. green dried seeds, 2 semiripened dried seeds, 3 ripened dried seeds, 4 green frizzed seeds, 5 semiripened frizzed seeds, 6 ripened frizzed seeds, 7 dried stems, 8 frizzed stems, 9 dried leaves, 0 frizzed leaves 89/7(200) 697

3 tego typu czynników. Obecność wielu składników stwierdzono jedynie w suszonych nasionach. W mrożonym surowcu były obecne prawdopodobnie w postaci glikozydów nierozpuszczalnych w octanie etylu. Ponieważ skład ekstraktu z dojrzałych suchych nasion był najbogatszy, a jednocześnie najbardziej stabilny (niezależny od miejsca zebrania i sposobu przechowywania), ten surowiec został wytypowany do dalszych badań. W wyniku ciągłej ekstrakcji nasion octanem etylu otrzymano,3% suchego ekstraktu (w stosunku do masy surowca). Wolny od rozpuszczalnika ekstrakt zdyspergowano w wodzie i poddano rozdziałowi metodą ciągłej ekstrakcji ciecz ciecz na 4 frakcje (tabela i 2), które rozdzielano dalej zgodnie ze schematem przedstawionym na rys. 4). Tabela. Wyniki rozdziału ekstraktu na frakcje główne Table. The results of separation of extract into main fractions Wydajność frakcji, % z suchej masy ekstraktu surowca 5,38 5,8 25,50 2,88 9,00 2,5 0,65 0,07 Rys. 4. Schemat rozdziału na subfrakcje octanowego ekstraktu z nasion barszczu Sosnowskiego Fig. 4. Separation of acetate extract of Sosnowski hogweed seeds to respective subfraction myśle kosmetycznym i farmaceutycznym, a jednocześnie nie zawsze łatwych do zsyntetyzowania. Dominujący wśród nich octan n-oktylu jest dobrym rozpuszczalnikiem triterpenów, stosowanym m.in. w komponowaniu leków przeciwastmatycznych 28). Jest też związkiem bazowym w syntetycznych zapachach pomarańczowych. -Oktanol wykazuje silną inhibicję wzrostu Gram(+) mikroorganizmów Bacillus cereus, Listeria monocytogenes i Staphylococus epidermidis 29). Propionian oktylu i octan n-heksylu to składniki egzotycznych kompozycji perfumeryjnych, a pozostałe estry wykorzystywane są jako substancje o owocowej nucie zapachowej 30, 3). Estry te wspomagają także transport substancji aktywnych poprzez skórę, co czyni je pożądanymi składnikami wielu preparatów kosmetycznych i leczniczych 32). Niemal wszystkie te estry znane są ze swej biologicznej aktywności 33). Obecne w badanym surowcu estry oczyszczono i rozdzielono destylując je pod zmniejszonym ciśnieniem (w warunkach atmosferycznych ich temperatury wrzenia mieszczą się w przedziale C. Sumaryczny uzysk frakcji estrowych z suchego surowca wyniósł 3,6% (tabela 2). Większość składników frakcji estrowych (..3) była także obecna w niektórych subfrakcjach wyodrębnionych w następnych etapach rozdziału. Subfrakcja.2 zawierała dwie furanokumaryny szeregu angelicynu (angelicyn i pimpinellin). Pewnym zaskoczeniem była dość wyraźna obecność w subfrakcji 2. butylowanego p-hydroksytoluenu BHT (2,6-di-tert-butylo-p-krezol), znanego ze swych właściwości antyutleniających. W skład niższych subfrakcji wyodrębnionych z frakcji głównej 2 wchodziły estry 2., 2.2, 2.3 (m.in. biologicznie aktywny 5-pentadekanolid, ketony 2.2 i 2.3, oraz furanokumaryny szeregu angelicinu (2.2 i 2.3). W subfrakcjach wyższych zidentyfikowano polarne pochodne kumaryny, a także inne polarne substancje. Frakcja 3 zawierała niemal wyłącznie furanokumaryny, zarówno pochodne angelicynu (3. i 3.2), jak i psolarenu (3. 3.5). W subfrakcji 3.6 stwierdzono obecność polarnych nasyconych seskwiterpenów lub/i triterpenów (IR, H NMR, dodatni wynik próby Liebermanna). Frakcja 4, stanowiąca zaledwie 0,07% surowca zawierała prawdopodobnie pochodne furanokumarynowe o dużych cząsteczkach i długołańcuchowych podstawnikach alifatycznych. Furanokumaryny wyodrębnione z wąskich frakcji mogą być wykorzystane wprost jako składniki fitoceutyków lub też mogą służyć jako surowiec w przemianach chemicznych, prowadzących do związków rzadko występujących w przyrodzie lub trudnych do wydzielenia. W ten sposób może być wykorzystany m.in. bergapten, z którego otrzymuje się 6,7 -dihydroksybergamottin (DHB) oraz inhibitor cytochromu P450 (CYP3A4) 32). Warunki rozdziału chromatograficznego dobrano metodą TLC stosując wywoływanie w świetle UV (364 nm) i 20-proc. roztwór SbCl 5 w CCl 4 jako wywoływacz chemiczny. Uzyskane subfrakcje badano standardowymi metodami (IR, H NMR, UV-Vis, GC-MS). W przypadku frakcji nie nadających się do rozdziału metodą chromatografii gazowej, określono ogólny charakter chemiczny wykorzystując widma IR oraz H NMR. Stwierdzono, że subfrakcje..3 zawierały wiele estrów mających znaczne zastosowanie w środkach ochrony roślin, prze- Wnioski Wykorzystanie nasion barszczu Sosnowskiego jako źródła surowców dla technologii małotonażowych może być alternatywą dla licznych i mało skutecznych metod jego eliminacji z ekosystemu. Obecne w ekstrakcie substancje mają liczne zastosowania, potwierdzone odpowiednimi patentami, a przedstawiony sposób rozdziału ekstraktu pozwala na wykorzystanie zaproponowanej metodyki w większej skali. Uzyskane subfrakcje zawierają praw /7(200)

4 Tabela 2. Charakterystyka składu subfrakcji Table 2. Characteristics of composition of subfractions Symbol frakcji Składniki (GC-MS)*** Udział w subfrakcji, % Udział we frakcji głównej, % Uwagi oktanal octan butylu oktan--ol 4. 2-metylopropionian heksylu 8,62* 2 nieziden ty fikowane octan n-oktylu 69 2-metylomaślan heksylu 2 3-metylomaślan heksylu 5 oktan--ol 3 2-metylopropionian heksylu 5.2 octan n-oktylu 72,80* 6 nieziden ty fikowanych 2-metylomaślan heksylu 2 walerianian nonylu 6.3 octan n-oktylu 82 2-metylomaślan heksylu 6 0,74* 5 nieziden ty fikowanych.2 angelicyn 66 pimpinellin 33,56* 2-metylopropionian oktylu 2 octan n-oktylu metylomaślan heksylu 0 3-metylomaślan heksylu 5 8,0 6 nieziden ty fikowanych 5-dodecylodihydro-2(3H)-furanon butylowany p-hydroksytoluen (BHT) 0 octan n-oktylu metylomaślan heksylu 0 angelicyn 6 pimpinellin 2 4-izobutoksy-2-butanon 2,7 6 nieziden ty fikowanych 5-dodecylodihydro-2(3H)-furanon angelicyn 89 pimpinellin izobutoksy-2-butanon 3 40,7 5-pentadekanolid 2 (9Z,2Z)-oktadeka-9,2-dien--ol 2 7-hydroksy-4-metylokumaryna ester metylowy kwasu 3-oktylooksiranooktanowego 4,4 4 nieziden ty fikowane hydroksy-4-metylokumaryna 4 acetylooctan etylu 8 0,8 3 nieziden ty fikowane hydroksy-4-metylokumaryna 75 alkilowa pochodna,2,3,4-tetra-hydro-- 23 metano-4-naftaleno-5,8-diolu 0,3 9 nieziden ty fikowanych 2.7 woski** 0,5 2.8 alifatyczne, obojętne**,9 octan oktylu angelicyn 9 psolaren 5,0 2 nieziden ty fikowane 5-metoksy-angelicyn 5 angelicyn ksantotoksyna 0 pimpinellin 6 4,9 izopimpinellin 5 ksantotoksyna 2 bergapten imperatoryna 7 izoimperatoryna 5 27,6 3 nieziden ty fikowane alloizoimperatoryna 4 izopimpinellin 9 bergapten marmezin 36 7,3 3 nieziden ty fikowane izopimpinellin 4 byakangelikol 22 izopimpinellin 7 3.5,6 6 nieziden ty fikowanych 2-hydroksybenzaldehydo(2-hydroksybenzylideno)hydrazon nasycone związki polarne (seskwiterpeny, triterpeny)** 7 4 alifatyczne pochodne furanokumaryn** 00 * uzysk z suchego surowca, ** frakcje charakteryzowano metodami IR i H NMR, *** wymieniono składniki występujące w ilości powyżej % 89/7(200) 699

5 dopodobnie również mikroskładniki dające efekt synergiczny, niemożliwy do osiągnięcia przy komponowaniu składników metodą syntezy. Praca została sfinansowana w ramach projektu badawczego nr N /638, realizowanego w latach Otrzymano: LITERATURA. Pat. USA (980), E. Nikolaiski. 2. Pat. europ. EP (2008), N. Bianchi i in. 3. F. Tosun i in., Food Chem. 2008, 07, Zgł. pat. USA 2005/ A (2005), K.T. Ashiagbor i in. 5. Pat. europ. EP (2008), N. Bianchi i in. 6. Pat. USA (990), P.E. Forlot. 7. Pat. USA (2000), J.W. Harris. 8. A.J. Potapenko i in., Biofizika 2004, 49, nr 2, Zgł. Pat USA 2007/ A (2007), D. Kawa i in. 0. Koji Nakano i in., Anal. Chim. Acta 2006, 578, 93.. Pat. USA B2 (2005), M.H. Jacobsen i in. 2. T. Ben Amor, G. Jori, Insect Biochem. Mol. Biol. 2000, 30, T. Ojala i in., J. Ethnopharmacol. 2000, 73, Y. R. Lee, Tetrahedron 995, 5, nr, S. A. Osadchii i in., Russian Int. Bull., Int. Ed. 2006, 55, nr 2, Pat. USA B2 (2004), R. Seemayer, J. Liang. 7. S. Guillon i in., Trends Biotechnol. 2006, 24, nr 9, M. Sidwa-Gorycka i in., Plant Sci. 2003, 65, G. Iscan, F. Demirci i in., Z. Naturforsch. 2003, 58c, A. Pauli, Med. Res. Rev. 2006, 26, I. Kubo, H. Muroi, A. Kubo, Bioorganic. Medic. Chem. 995, 7, W.C. Daughtrey i in., Toxicol. Sci. 989, 2, nr 2, D.T. Malerbo-Suza, R.H. Nogueira-Couto, Brazilian Archiv. Biol. Technol. 2004, 47, nr, Database of pheromones and semiochemicals, [online dostęp: 26 kwiecień 2009 r.], dostępny w Internecie: S. Zschocke i in., Phytochem. Anal. 998, 9, nr 6, N. Kabuce, NOBANIS Invasive Alien Species Fact Sheet Heracleum sosnowsky (2006), Online Database of the North European and Baltic Network on Invasive Alien Species NOBANIS [online dostęp: 25 styczeń 2009 r.], dostępny w Internecie: org/. 27. Š. Jahodova, Diversity Distrib. 2007, 3, Pat. świat. WO/2008/ (2008). 29. G. Iscan i in., Z. Naturforsch. 2003, 58c, M.R. Rosen, Delivery system handbook for personal care and cosmetic products. Technology, applications and formulations, William Andrew Publ., 2005 r. 3. Zgł. pat. USPTO (2006), K. D. Perring i in. 32. M. Fuji i in., Int. J. Pharmaceutics 999, 37, Pat. USA (2007), O. Rangel i in. 34. Pat. USA (2006), D.J. Edwards, P.M. Woster /7(200)