Charakterystyka i częstość występowania koekspresji w ostrych białaczkach u dzieci

Transkrypt

1 PRACA ORYGINALNA Charakterystyka i częstość występowaia koekspresji w ostrych białaczkach u dzieci Characteristics ad frequecy of coexpressio i acute lymphoblastic leukemia i childre Jolata Kaufma 1, Bogda Mazur 1, Tomasz Szczepański 2 S T R E S Z C Z E N I E 1 Katedra i Zakład Mikrobiologii i Immuologii oraz 2 Katedra i Kliika Pediatrii, Hematologii i Okologii Dziecięcej Wydziału Lekarskiego z Oddziałem Lekarsko-Detystyczym w Zabrzu Śląskiego Uiwersytetu Medyczego w Katowicach W S T Ę P Ostra białaczka limfoblastycza (acute lymphoblastic leukemia ALL) jest ajczęstszą postacią białaczki u dzieci i staowi około 80 wszystkich białaczek wieku rozwojowego, z czego pochodzi z liii limfocyta B, a jedyie z liii limfocyta T. Ostra białaczka ielimfoblastycza (acute myeloid lymphoblastic AML) staowi około 20 wszystkich białaczek wykrywaych u dzieci. Cytometrycza aaliza immuofeotypu komórek białaczkowych pozwala określić przyależość do daej liii komórkowej oraz stopień dojrzałości, a także wykryć feotypy ietypowe. Celem pracy było określeie częstości i rodzaju występowaia koekspresji w ostrych białaczkach u dzieci. M AT E R I A Ł I M E T O DY Przeaalizowao grupę 275 dzieci z ALL diagozowaych w Kliice Pediatrii i Hematologii w Zabrzu w latach Materiałem był szpik kosty lub krew obwodowa zawierająca ie miej iż 80 komórek blastyczych. W badaiach zastosowao metodę zakowaia pełej krwi lub szpiku z lizą erytrocytów. Użyto przeciwciał sprzężoych z fluorochromami FITC, PerCP lub PE skierowaych przeciwko atygeom: CD1a/ /CD2/CD3/CD4/CD5/CD7/CD8/CD10/CD13/CD14/CD15/CD19/ /CD20/CD22/CD33/CD34/CD117/HLA-DR/MPO/TdT. A D R E S D O KO R E S P O N D E N C J I : Dr. med. Jolata Kaufma Szpital Wojewódzki w Opolu ul. Kośego Opole tel jolatakaufma@vp.pl A. Acad. Med. Siles. 2012, 66, 3, Copyright Śląski Uiwersytet Medyczy w Katowicach ISSN W Y N I K I Największą grupę staowią pacjeci z białaczką prekursorową z liii limfocyta B 70,55, zaś liczby przypadków z T-ALL (14,91) i AML (14,55) są do siebie zbliżoe. Wśród B-ALL ajwiększy odsetek koekspresji dotyczył atygeów mieloidalych: CD13+ (7,2 przypadków), CD33+ (w 7,7), CD13+CD33+ (8,7) oraz CD15+ (4,6). Koekspresja atygeów z liii limfocyta T staowi iewielki odsetek: CD7+ wykryto w 1,5 przypadków B-ALL, CD2+ w 1,5, CD4+ w 0,5, CD1a w 0,5 i CD5+ w 0,5. W przypadku T-ALL koekspresje z iych liii komórkowych zaotowao w 26,8 przypadków, z czego większość dotyczyła 20

2 OSTRE BIA ACZKI U DZIECI atygeów mieloidalych: CD13, CD33, CD14, zaś obecość CD19 wykryto jedyie w 3 przypadkach. Atyge CD13+ zaotowao w 7,3 przypadków T-ALL, CD13+CD33+ w 9,8, CD14+ w 2,4. W AML stwierdzoo obecość koekspresji: CD19 w 3 (7,5) przypadkach, CD2 w 5 (12,5) oraz CD4 w 2 (5,0) przypadkach. W N I O S K I Obecość ietypowych immuofeotypów, w tym występowaie atygeów z iych liii komórkowych a komórkach blastyczych, staowi swoisty dla pacjeta marker diagostyczy pozwalający moitorować osiągaie remisji w trakcie leczeia, idetyfikować białaczkowe acieczeie PMR. S Ł O WA K L U C Z O W E ALL, AML, koekspresja, immuofeotyp A B S T R AC T I N T R O D U C T I O N Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is the most commo form of leukemia ad makes about 80 of all developmetal age leukemias, of which come from B lymphocyte lie ad oly from T lymphocyte lie. Acute myeloid leukemia (AML) makes up about 20 of all leukemias detected amog childre. Cytometric aalysis of leukemic cells immuopheotype allows a precise determiatio of each cell lie status, degree of maturity ad occurrece of coexpressio pheomeo. M AT E R I A L A N D M E T H O D S 275 cases of childre with acute leukemia, diagosed i the Uiversity Ward of Pediatrics ad Hematology i Zabrze i the years The material cosisted of boe marrow or peripheral blood cotaiig ot less tha 80 blast cells. The study applied the method of whole blood ad marrow markig with the subsequet erythrocyte lysis. FITC, PerCP or PE fluorochrome-coupled atibodies were used ad they were directed agaist CD1a, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD10, CD13, CD14, CD15, CD19, CD20, CD22, CD33, CD34, CD117, HLA- -DR, MPO, TdT. R E S U LT S Patiet group with acute leukemia icludes 275 cases. The biggest group cosists of patiets with diagosed acute precursor leukemia from B lymphocyte lie while the umber of cases with T-ALL (14.91) ad AML (14.55) were similar. The most frequet coexpressio beloged to the coexpressio of determiats characteristic for the myeloid lie: CD13, CD33, CD15, which were observed i 28.2 of cases amog the studied oes. The coexpressio of T lymphocyte lie atiges was oticed oly i idividual cases ad those were determiats CD1a, CD2, CD4, CD5, CD7 which occur i 4.5 of all cases of precursor leukemia from B lymphocyte lie. I the group of leukemias from T lymphocyte lie the coexpressio from other cell lies was oticed i 26.8 of cases, most of which were about the expressio of myeloid atiges: CD13, CD33, CD14. The coexpressio of atige CD19 was oticed oly i 3 cases (7.3). There was detected a small umber of cases with childre with AML where there were oticed atiges from other cell lies o leukemia cells. The coexpressios CD19, CD2 ad CD4 were discovered. C O N C L U S I O N S A presece of atypical immuopheotypes, icludig the occurrece of atiges from other cell lies o blast cells, is a good diagostic marker which eables to idetify leukemic CSF ifiltra- 21

3 tio ad to moitor remissios durig treatmet, ad additioally, to fid out a possible disease recurrece i boe marrow ad CSF. K E Y W O R D S ALL, AML, coexpressio, immuopheotypic profile W S T Ę P Ostra białaczka limfoblastycza (acute lymphoblastic leukemia ALL) jest ajczęstszą postacią białaczki u dzieci i staowi około 80 wszystkich białaczek wieku rozwojowego, z czego pochodzi z liii limfocyta B, a jedyie z liii limfocyta T. Ostra białaczka ielimfoblastycza (acute myeloid leukemia AML) staowi około 20 wszystkich białaczek wykrywaych u dzieci [1]. Białaczka limfoblastycza jest złośliwym owotworem wywodzącym się z komórek prekursorowych liii limfoidalej [2,3]. Jest to choroba iejedoroda, zaś ocea feotypu atygeowego komórek białaczkowych pozwala określić ich pochodzeie oraz stopień dojrzałości, co ma zaczeie w doborze protokołu leczeia [4]. Immuofeotyp jest to charakterystyczy zbiór atygeów powierzchiowych, cytoplazmatyczych oraz jądrowych związay z dojrzewaiem, różicowaiem i fukcją badaej komórki oraz iformujący, w jakim stopiu immuofeotyp komórek białaczkowych odpowiada immuofeotypowi prawidłowej komórki szpiku [5,6,7]. Atygey wykrywao przy użyciu swoistych przeciwciał mookloalych. W tabeli I przedstawioo przykładowe markery immuologicze wykorzystywae do diagostyki ostrych białaczek, które pozwalają stwierdzić, jaka liia komórkowa uległa trasformacji owotworowej oraz czy obece są atygey ietypowe [8]. Podstawą określeia immuofeotypu jest założeie, że komórka białaczkowa zatrzymuje się a określoym etapie dojrzewaia i różicowaia, a jej immuofeotyp odpowiada immuofeotypowi komórki z prawidłowej hematopoezy. Moża jedak zaobserwować zjawisko występowaia ietypowych immuofeotypów komórek białaczkowych, polegające a braku ekspresji jedej charakterystyczej determiaty atygeowej (immuofeotyp iepeły) bądź obecości determiat dodatkowych, charakterystyczych dla iych liii komórkowych (koekspresja), a także występowaie feotypu asychroiczego, polegające a rówoczesej ekspresji determiat z prekusorowego i dojrzałego etapu rozwoju daej komórki [2]. Występowaie ieprawidłowych, aberratych immuofeotypów bywa tłumaczoe aormalą ekspresją geów, złośliwą trasformacją pluripotecjalych komórek progeitorowych, które zdole są zarówo do limfoidalego, jak i mieloidalego różicowaia. Wykazaie koekspresji jest możliwe w przypadku zastosowaia wieloparametrowej cytofluorymetrii. W grupie białaczek z koekspresją atygeów iych iż zdefiiowaa liia komórkowa moża wyróżić: białaczki limfoblastycze z ekspresją atygeu mieloidalego ALL+My lub limfoidalego iego iż opisaa liia ALL+Ly; białaczki mieloidale z ekspresją atygeów limfoidalych AML+Ly [54]. Celem pracy było określeie rodzaju i częstości występowaia koekspresji w ostrych białaczkach u dzieci. Tabela I. Podstawowe markery immuologicze stosowae w immuofeotypowaiu białaczek Table I. Basic immuological markers used i leukemia immuopheotypig Typ białaczki ALL z liii B ALL z liii T AML Markery immuologicze CD19, CD20, cycd22, CD79a, CD10, cyigm kappa, lambda, TdT, CD34, CD38, HLA-DR cycd3, CD3, CD2, CD7, CD5, CD1a, CD4, CD8, TdT, HLA-DR, TCR /, TCR /, CD34 MPO, CD34, CD117, CD13, CD33, CD15CD64, CD14, CD71, CD41, Gly-A, HLA-DR, TdT 22

4 OSTRE BIA ACZKI U DZIECI M A T E R I A Ł I M E T O DY Badaiem objęto 275 dzieci z wstępym rozpozaiem ostrej białaczki, diagozowaych w Katedrze i Kliice Pediatrii, Hematologii i Okologii Dziecięcej w Zabrzu w latach , w wieku 0,5 16 lat, w tym 119 dziewczyek i 156 chłopców. Materiałem był szpik kosty lub krew obwodowa zawierające ie miej iż 80 komórek blastyczych (zliczoe w preparacie barwioym metodą May-Gruwalda-Giemsy). Aalizę wykoao przed upływem 3 godzi od mometu pobraia materiału badawczego. W badaiach zastosowao metodę zakowaia pełej krwi lub szpiku z lizą erytrocytów. Baday materiał ikubowao w temperaturze pokojowej, bez dostępu światła przez 30 mi z określoymi przeciwciałami mookloalymi sprzężoymi z fluorochromami: izotiocyjaiamem fluoresceiy (FITC), fikoerytryą (PE) oraz peridiiochlorofilem (PerCP). Atygey cytoplazmatycze: MPO i TdT, barwioo po uprzedim wybarwieiu determiat powierzchiowych, utrwaleiu komórek i permabilizacji błoy komórkowej. W barwieiu a obecość MPO do permabilizacji użyto zestawu odczyików Itrastai firmy Dako, zaś dla TdT płyu lizującego firmy Becto Dickiso. Używao zestawów przeciwciał dla astępujących determiat powierzchiowych: CD1a, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD10, CD13, CD14, CD15, CD19, CD20, CD22, CD33, CD34, CD38, CD45, CD117, HLA-DR, oraz cytoplazmatyczych: MPO, TdT (Becto Dickiso oraz Dako). Jako kotroli tła używao zawiesiy komórek z mieszaią mysich immuoglobuli odpowiediej klasy IgG1(FITC), IgG2(PE), IgG2a(PerCP). Do kalibracji cytometru stosowao kalibrator Cali- BRITE TM 3 (Becto Dickiso). Po zakończeiu ikubacji erytrocyty lizowao przy użyciu FACS Lysig Solutio (Becto Dickiso). Po dwukrotym przepłukaiu w buforze PBS, zakowae komórki wprowadzoo do cytometru przepływowego FACSca, rejestrując każdorazowo ie miej iż komórek. Parametry fizycze komórek oraz obecość i itesywość fluorescecji aalizowao za pomocą programu Cell Quest (Becto Dickiso). Aaliza obejmowała oceę populacji komórkowych pod względem wielkości (parametr FSC), struktury powierzchi (parametr SSC), obecości determiaty CD45 i selekcji populacji zawierających komórki białaczkowe. Za występowaie daej determiaty przyjęto wartość > 20 komórek badaej populacji. Poadto w aalizie uwzględioo występowaie a powierzchi komórek determiat z iej liii komórkowej koekspresja. W Y N I K I Grupa pacjetów z ostrymi białaczkami obejmuje 275 przypadków (w okresie ). Największą grupę, aż 70,55, staowi tu białaczka prekursorowa z liii limfocyta B. Natomiast liczby przypadków z T-ALL (14,91) i AML (14,55) są do siebie zbliżoe. Liczbę zachorowań oraz odsetek poszczególych typów białaczek przedstawia tabela II. Tabela II. Liczba przypadków i odsetek poszczególych typów białaczek włączoych do aalizy Table II. Number of casus ad the percetage of particular leukemia types icluded i the aalysis Typ białaczki Liczba przypadków Prekursorowa B-ALL ,55 T-ALL 41 14,91 AML 40 14,55 B I A Ł AC Z K A P R E K U R S O R O WA B - A L L Najczęstszą koekspresję staowiła ekspresja determiat charakterystyczych dla liii mieloidalej: CD13, CD33, CD15, które obserwowao w 28,7 przypadów spośród badaych. Koekspresję atygeów z liii limfocyta T zaotowao tylko w pojedyczych przypadkach, były to determiaty: CD1a, CD2, CD4, CD5, CD7, występujące w 4,5 wszystkich przypadków prekursorowej białaczki z liii limfocyta B. Rodzaj koekspresji, liczbę przypadków oraz odsetek ALL z liii limfocyta B przedstawioo w tabeli III. 23

5 Tabela III. Rodzaje koekspresji, liczba i odsetek przypadków ALL z liii limfocyta B Table III. Types of coexpressio, umber ad percetage of ALL cases from B lymphocyte lie B-ALL Z koekspresją atygeów z liii limfocyta T Z koekspresją atygeów mieloidalych Atyge Liczba przypadków CD7 3 1,5 CD2 3 1,5 CD4 1 0,5 CD1a 1 0,5 CD5 1 0,5 CD ,2 CD ,7 CD15 9 4,6 CD13/CD ,7 Ogółem 4,5 28,2 B I A Ł AC Z K I T- A L L W T-ALL koekspresje z iych liii komórkowych zaotowao w 26,8 przypadków, z czego większość dotyczyła atygeów mieloidalych: CD13, CD33 oraz CD14. Koekspresję atygeu CD19 odotowao jedyie w 3 przypadkach. Rodzaj koekspresji, liczbę przypadków oraz odsetek ALL z liii limfocyta T przedstawioo w tabeli IV. Tabela IV. Rodzaje koekspresji, liczba przypadków i ich odsetek dla ALL z liii limfocyta T Table IV. Types of coexpressio, umber ad percetage of ALL cases from T lymphocyte lie T-ALL Atyge Liczba przypadków Z koekspresją atygeów z liii limfocyta B CD19 3 7,3 Z koekspresją atygeów mieloidalych CD ,0 CD33 4 9,7 CD14 1 2,4 O S T R A B I A Ł AC Z K A N I E L I M F O B L A S T Y C Z N A W AML stwierdzoo iewielką liczbę przypadków, gdzie a komórkach białaczkowych stwierdzoo koekspresję atygeów z iych liii komórkowych. Wykryto koekspresję CD19, CD2 i CD 4. Szczegółowe dae przedstawioo w tabeli V. Tabela V. Rodzaje koekspresji, liczba przypadków i ich odsetek dla AML Table V. Types of coexpressio, umber ad percetage of AML AML Atyge Liczba przypadków Ogółem Z koekspresją atygeów z liii limfocyta B CD19 3 7,5 7,5 Z koekspresją atygeów z liii limfocyta T CD2 5 12,0 CD4 2 5,0 17,0 24

6 OSTRE BIA ACZKI U DZIECI DY S K U S J A Immuofeotypizacja z zastosowaiem odpowiediego paelu przeciwciał mookloalych skierowaych przeciwko atygeom leukocytów jest iezbędym arzędziem w badaiu szpiku i krwi obwodowej, gdzie w krótkim czasie możliwe jest określeie typu komórek i stadium, a którym uległy oe trasformacji owotworowej. Ujawia się także feotypy ietypowe, jak: brak ekspresji jedej z charakterystyczych determiat (feotyp iepeły), obecość atygeów iych liii komórkowych, p. CD19 a komórkach białaczki AML, CD33 a blastach w commo ALL czy CD13 a blastach ALL-T (koekspresja) oraz asychroiczej ekspresji determiat [9,10]. Komórki białaczkowe, których immuofeotyp odbiegał od ich odpowiedików z prawidłowej otogeezy, były coraz częściej obserwowae w miarę rozwoju cytometrii przepływowej. Nieobecość charakterystyczej determiaty lub występowaie determiat dodatkowych, cechujących ie liie sugerowały zaburzeia w geomie komórek i określoo je immuofeotypami ietypowymi [11]. Tę grupę białaczek moża podzielić a białaczki limfoblastycze z ekspresją atygeu mieloidalego (ALL+My), białaczki limfoblastycze z ekspresją atygeu iego iż opisaa liia (ALL+Ly) oraz ostre białaczki szpikowe z ekspresją atygeów limfoidalych (AML+Ly) [12]. Koekspresja atygeów z iych liii komórkowych jest spotykaa u dorosłych oraz 5 35 dzieci z ALL [12,13]. Przedmiotem badań było określeie częstości występowaia koekspresji a komórkach białaczkowych w grupie dzieci z ALL i AML. U 70,7 dzieci w aalizowaej populacji postawioo diagozę ALL z prekursorów limfocyta B, 15 to ALL z liii limfocyta T, pozostałe 14,5 to AML. Wyiki te są zbieże z wartościami podawaymi w piśmieictwie [14], ieco miejszy (53) odsetek ALL z limfocyta B wykazao w badaiach retrospektywych przeprowadzoych przez Wąsik i wsp. [10]. Podawaa częstość występowaia ALL+My mieści się w szerokim zakresie 5 50 [11]. Pituch-Noworolska [1] odotowała 25,1 przypadków, zbliżoy odsetek podaje Tog (26,6) [15], Üal podaje 13,8 [14], atomiast w grupie dzieci objętych iiejszym badaiem było to 28,9. Sugerowao brak zaczeia progostyczego związaego z obecością atygeów mieloidalych a komórkach owotworowych w ALL, jedak jest to powiązae z określoymi geetyczymi zaburzeiami. Dodatkową ekspresję atygeów limfoidalych AML stwierdza się w przypadków, w przeprowadzoej aalizie koekspresję taką wykazao w 24,5 przypadków. Trzeba pamiętać o tym, że AML u dzieci staowi wszystkich ostrych białaczek u dzieci, w aszych badaiach te odsetek wyosił 14,55 [1,14]. Obecość koekspresji atygeów z iych liii komórkowych ie jest uważaa obecie za zjawisko istote kliiczie [16], jedak idetyfikacja atygeów pochodzących z iych liii komórkowych a komórkach blastyczych staowi ceą iformację dla kliicysty w oceie remisji i poszukiwaia choroby resztkowej (MRD miimal residual disease). Oszacowaie MRD po chemioterapii oraz we wczesym okresie regeeracji szpiku po przeszczepie jest trude. Zastosowaie zalazła tu strategia wykorzystująca ilościowe różice w ekspresji atygeów liiowych a blastach białaczkowych. Aaliza feotypu i ekspresji poszczególych determiat komórek białaczkowych w chwili rozpozaia, idywidualie dla każdego pacjeta, pomaga w moitorowaiu MRD poprzez aalizę porówawczą [17]. W N I O S K I 1. W ostrej białaczce limfoblastyczej z liii limfocyta B oraz liii limfocyta T ajczęstszą formę ietypowego immuofeotypu staowiła koekspresja atygeów mieloidalych CD13, CD15, CD W białaczce ielimfoblastyczej odotowao więcej koekspresji atygeów z liii limfocyta T w porówaiu z atygeami z liii limfocyta B. 3. Obecość ietypowych immuofeotypów staowi swoisty dla pacjeta marker diagostyczy, pozwalający moitorować osiągaie remisji w trakcie leczeia oraz idetyfikować białaczkowe acieczeie płyu mózgowo-rdzeiowego. 25

7 P I Ś M I E N N I C T W O 1. Pituch-Noworolska A. Właściwości biologiczej i wrażliwość a leczeie idukcyje komórek rozrostowych o ietypowym immuofeotypie w ostrych białaczkach u dzieci. Folia Med. Cracov. 2001; 42: Pui Ch., Evas W.E. Acute lymphoblastic leukemia. N. Egl. J. Med. 1998; 339: Seferyńska I., Orłowska E., Ejduk A. i wsp. Epidemiologia zachorowań a ostre białaczki u ludzi dorosłych w Polsce w latach Post. Nauk. Med. 2007; 20: Krasowska I., Urba M., Żak J., Iwaszkiewicz-Pawłowska A., Wysocka J. Klasyfikacja ostrych białaczek u dzieci w oparciu o oceę immuofeotypową. Nowa Pediatr. 2000; 2: Żydowicz G., Mazur B. Immuofeotyp komórek w prawidłowej hematopoezie. Post. Biol. Komórki 2008; 35, supl. 24: Zola H., Swart B., Nicholso I. et al. CD molecules 2005: huma cell differetiatio molecules. Blood 2005; 106, 9: Kussick S., Fromm J., Rossii A. et al. Four-color flow cytometry shows strog cocordace with boe marrow morphology ad cytogeetics i the evaluatio for myelodysplasia. Am. J. Cli. Pathol. 2005; 124: Balaa-Nowak A., Zdziłowska E. Cytometria przepływowa w diagostyce immuofeotypowej ostrych białaczek. Post. Biol. Komórki 2008; 35, supl. 24: Pituch-Noworolska A., Kowalczyk J. The frequecy ad characteristics of aberrat immuopheotypes i acute lymphoblastic leukaemia (ALL) i childre a multiceter study. Acta Hematol. Pol. 2010; 41: Wąsik M., Błocka M., Górska E., Potapińska O., Demkow U. Algorytm feotypowaia blastów w ostrych białaczkach dziecięcych (streszczeie). Diag. Lab. 2007; 43(3): Podstawy hematologii. Red. A. Dmoszyńska, T. Robak. Wydawictwo Czelej. Lubli Jemal A., Siegel R., Ward E., Murray T., Xu J., Thu M.J. Statystyka owotworów. Okol. Dypl. 2007; 4, 2: Pui Ch., Behm F., Sigh B. et al. Myeloid-associated atige expressio lacks Progostic value i childhood Acute Lymphoblastic Leukemia treated with itesive multiaget chemotherapy. Blood 1990; 75(1): Üal S., Ceti M., Tucer M., Gümrük F., Yetgi. The progostic impact of myeloid atige expressio i pediatric acute lymphoblastic leukemia patiets. Turk. J. Pediatr. 2008; 50: Tog H., Zhag J., LU C., Liu Z., Zheg Y. Immuopheoptypic, cytogeetic ad cliical features of 113 acute lymphoblastic leukemia patiets i Chia. A. Acad. Med. Sigapore 2010; 39: Szczepański T., Orfăo A., va der Velde V., Sa Miguel J., va Doge J. Miimal residual disease i leukaemia patiets. Lacet 2001; 2: Dworzak M., Gaipa G., Ratei R. et al. Stadardizatio of flow cytometric miimal residual disease evaluatio i acute lymphoblastic leukemia: multicetric assessmet is feasible. Cytometry B Cli. Cytom. 2008; 74, 6: