Przykładowe ćwiczenia z wybranych technik chemii białek

Transkrypt

1 Rozdział 11 Przykładowe ćwiczenia z wybranych technik chemii białek Spektrofotometryczne oznaczanie stęŝenia białek Szybką (bezpośredni odczyt), prostą (bez konieczności dodawania odczynników) i niedestrukcyjną (całkowity odzysk białka) metodą oznaczania stęŝenia białek w roztworach jest pomiar absorbancji w zakresie ultrafioletu (UV). Pomiarów dokonuje się w tzw. bliskim (280 nm) lub dalekim ultrafiolecie (205 nm). W pierwszym przypadku wykorzystujemy fakt istnienia w białkach aminokwasów aromatycznych, głównie tryptofanu oraz tyrozyny i w mniejszym stopniu cysteiny. Teoretyczną zaleŝność wartości absorbancji danego białka od ilości powyŝszych reszt moŝna przedstawić równaniem: A [1 mg/ml] = (5550n Trp n Tyr + 125n Cys )/M, gdzie n odpowiada ilości reszt odpowiednich aminokwasów, M to masa molowa białka, zaś 5550, 1490 i 125 są wartościami współczynników absorbcji danych aminokwasów przy 280 nm. W powyŝszym wzorze nie uwzględniono reszt fenyloalaniny ze względu na zbyt niski udział tego aminokwasu w ogólnej absorbancji białka dla tej długości fali. Fałdowanie białek często w znacznym stopniu wpływa na własności absorbcyjne reszt aminokwasowych i dlatego teŝ przedstawiona zaleŝność ma charakter teoretyczny i kaŝde białko posiada indywidualny, praktycznie wyznaczony współczynnik absorbcji, charakterystyczny dla danego ph i siły jonowej. Warto teŝ pamiętać, Ŝe współczynniki absorbcji są najczęściej podawane w trzech jednostkach stęŝeniowych: jak wyŝej w mg/ml lub teŝ g/100g roztworu (procentowy współczynnik absorbcji, A 1% 1cm ) albo w mol/litr (molowy współczynnik absorbcji, ε). Większość białek ma przy długości fali 280 nm współczynnik absorbcji w zakresie dla stęŝenia 1 mg/ml. Absorbancja roztworów białek w dalekim ultrafiolecie wynika z silnego absorbowania przez wiązanie peptydowe światła o długości fali 190 nm. PoniewaŜ pomiar absorbancji przy tej długości fali sprawia trudności techniczne (odpowiedni materiał konstrukcyjny kuwety, konieczność prowadzenia pomiarów w gazie obojętnym), w praktyce dokonuje się pomiarów przy mniej kłopotliwej długości 205 nm. Większość białek posiada przy stęŝeniu 1 mg/ml wartość absorbancji przy 205 nm rzędu i dlatego teŝ pomiar stęŝenia białka przy tej długości fali jest bardzo czuły. NaleŜy pamiętać jednak, Ŝe nie jest to pomiar selektywny tylko na wiązanie peptydowe poniewaŝ takie aminokwasy jak Trp, Phe, Tyr, His, Cys, Met i

2 Arg posiadają teŝ znaczący udział w absorbancji przy 205 nm. Ograniczeniem jest równieŝ to, Ŝe pomiar absorbancji przy 205 nm nakłada wymagania odnośnie składu roztworów w których białka są rozpuszczone, wiele pospolitych buforów jak np. octan, cytrynian czy mrówczan istotnie absorbują światło przy tej długości fali. Szczególnym przypadkiem białek, których nie moŝna oznaczać drogą pomiaru absorbancji w ultrafiolecie są białka barwne, zawierające chromofory. Takie ugrupowania chemiczne w ogromnej większości bardzo intensywnie absorbują światło w zakresie ultrafioletu, całkowicie tłumiąc własności absorbcyjne łańcucha polipeptydowego. StęŜenie tych białek mierzy się wówczas przy długościach fal charakterystycznych dla absorbcji chromoforu, często w świetle widzialnym. Trzeba jednak pamiętać, Ŝe współczynnik absorbcji wielu chromoforów nie jest zmienny i często zaleŝy od stopnia utlenienia, ph czy siły jonowej. Przykładowym białkiem rozpatrywanym na niniejszych ćwiczeniach będzie cytochrom c. W białku tym redukcja i utlenianie Ŝelaza hemowego (Fe 3+ + e - Fe 2+ ) prowadzi do zmian w widmie absorbcyjnym. Ilościowe oznaczenie zawartości cytochromu polega na pomiarze absorbancji roztworów zarówno formy zredukowanej jak i utlenionej przy 550 nm. Ilość cytochromu oblicza się wykorzystując róŝnicę zmierzonych wartości absorbancji Pomiar stęŝenia albuminy wołowej Wykonanie Do kuwety kwarcowej odmierzyć 970 µl 10 mm buforu fosforanowego ph 7,4 i 30,8 µl roztworu albuminy wołowej (BSA) o stęŝeniu 32,5 mg/2 ml. Wymieszać i zmierzyć absorbancję przy 280 nm względem wody. Kuwetę przepłukać woda, odmierzyć 800 µl buforu fosforanowego jak wyŝej, dodać 50 µl roztworu albuminy o nieznanym stęŝeniu i ponownie zmierzyć absorbancję. Opracowanie wyników BSA zawiera 2 reszty tryptofanu, 20 reszt tyrozyny oraz 35 reszt cysteiny. Na podstawie tych wartości obliczyć teoretyczny współczynnik absorbcji procentowej A 1% 1cm (masa molowa BSA wynosi 68 kda). Następnie na podstawie wyniku pomiaru absorbancji preparatu BSA o znanym stęŝeniu obliczyć współczynnik doświadczalny. Porównać obie wartości z literaturowym procentowym współczynnikiem doświadczalnym wyznaczonym wagowo i wynoszącym 6,14. Przedyskutować rozbieŝności. Na podstawie wyniku pomiaru absorbancji nieznanej próbki obliczyć stęŝenie BSA w badanym roztworze w jednostkach mg/ml.

3 Pomiar stęŝenia cytochromu c Wykonanie 1. Wykreślenie widma absorbcyjnego Do kuwety plastikowej odmierzyć 1 ml 0,1 M buforu fosforanowego ph 7,4, dopełnić wodą do 3 ml po czym dodać kilka kryształków ditionianu sodu Na 2 S 2 O 4 i na tak przygotowanej ślepej wykalibrować spektrofotometr. Próbkę pomiarową przygotować identycznie, dodając dodatkowo 0,1 ml roztworu cytochromu c o stęŝeniu 20 mg/ml i odpowiednio zmniejszając objętość dodawanej wody. Po wymieszaniu wykreślić widmo absorbcyjne w zakresie nm. Z wykresu odczytać połoŝenie i wartość szczytowej absorbancji formy zredukowanej cytochromu. 2. Oznaczenie stęŝenia cytochromu c Przygotować próbę ślepą odmierzając do kuwety 1 ml buforu fosforanowego, 0,1 ml 0.01 M roztworu K 3 Fe(CN) 6 i 1,9 ml wody. Nastawić spektrofotometr na maksimum absorbancji zredukowanej formy cytochromu i dokonać zerowania instrumentu. W drugiej kuwecie przygotować identycznie próbkę pomiarową, dodając 50 µl roztworu cytochromu c o nieznanym stęŝeniu i zmniejszając o taką samą objętość ilość dodawanej wody. Po wymieszaniu zmierzyć wartość absorbancji, doprowadzić cytochrom do formy zredukowanej poprzez dodanie kilku kryształków ditionianu sodu i ponownie dokonać pomiaru absorbancji. W celu skontrolowania, czy cytochrom uległ całkowitej redukcji ponownie dodać do obu kuwet ditionianu i dokonać zerowania oraz pomiaru absorbancji. Pomiar nie powiniem wykazać róŝnic. Opracowanie wyników StęŜenie cytochromu c w badanym roztworze obliczyć z następującego wyraŝenia: c [mol/l]= ((A zred - A utl ) * l * f) / ε gdzie: A zred, A utl - wartość absorbancji przy 550 nm form zredukowanej i utlenionej, l - grubość warstwy roztworu w cm, f- współczynnik rozcieńczenia, ε - molowy współczynnik absorbcji równy 2.11*10 4 M -1 cm -1 Wynik podać w mg/ml. Na podstawie wartości maksimum absorbancji zredukowanej

4 formy cytochromu c obliczyć wartość molowego współczynnika absorbcji przy wyznaczonej długości fali. Masa cząsteczkowa cytochromu c wynosi 12, 27 kda Oznaczanie grup aminowych z uŝyciem odczynnika TNBS Kwas 2,4,6-trinitrobenzenosulfonowy (TNBS) reaguje selektywnie z grupami α- i ε- aminowymi białek i peptydów. Podczas przeprowadzanej w zasadowym środowisku reakcji dochodzi do wymiany grup siarczynowych TNBS na oznaczane grupy aminowe. Po reakcji wymiany mieszaninę doprowadza się do ph obojętnego buforem zawierającym nadmiar jonów siarczynowych, które tworzą z powstałymi trinitrofenyloaminami pomarańczowe związki kompleksowe oznaczane spektrofotometrycznie przy 420 nm. NO2 NO 2 :NH 2 R SO 3 - NO2 NO 2 NHR + SO H+ NO 2 NO 2 Grupy trinitrofenylo-α-aminowe i trinitrofenylo-ε-aminowe tworzą kompleksy o współczynnikach absorbcji molowej przy 420 nm odpowiednio i M -1 cm -1. PoniewaŜ zgodnie z prawem Lamberta-Beera współczynniki te są addytywne, to znając ilość odpowiednich grup aminowych w białku czy peptydzie moŝna obliczyć teoretyczną absorbancję molową ich trinitrofenylowych pochodnych, która z kolei po pomiarze absorbancji pozwala na wyznaczenie stęŝenia białka (lub peptydu). TNBS reaguje równieŝ z grupami tiolowymi, lecz ze względu na niską wartość współczynnika absorbancji molowej takiej pochodnej (2 250 M -1 cm -1 ) oraz fakt, Ŝe większość cystein w natywnych białkach występuje w postaci mostków disiarczkowych, pomija się ten składnik przy obliczeniach. Tym niemniej, gdy udział wolnych cystein w oznaczanym białku lub peptydzie jest znaczny naleŝy go oczywiście uwzględnić. Oznaczając przy uŝyciu TNBS grupy aminowe białek lub peptydów o znanej sekwencji moŝemy wyznaczyć ze znaczną dokładnością ich stęŝenie. Metoda te ma równieŝ i zastosowanie w badaniach struktury i dynamiki cząsteczek białkowych. Przykładowo, kreśląc krzywe zaleŝności absorbancji (a tym samym ilości reagujących grup aminowych) od czasu i interpretując kształt tych krzywych metodami matematycznymi jesteśmy w stanie określić

5 dostępność grup aminowych (a więc ich lokalizację na powierzchni lub we wnętrzu cząsteczki białka) oraz zdefiniować istnienie w badanym białku określonych przestrzennie klas grup aminowych. Wykonanie 1. Do sześciu probówek odmierzyć kolejno 7, 10 i 15 µl roztworu lizozymu z jaja kurzego (nawaŝka 14,6 mg/mi) oraz 5, 10 i 15 µl roztworu wołowego chymotrypsynogenu A (nawaŝka 15 mg/mi). KaŜdą probówkę dopełnić wodą do 250 µl. Przygotować dwie próby ślepe zawierające jedynie po 250 µl wody. 2. Do wszystkich probówek dodać po 250 µl buforu boranowego (ph 9,5) i 10 µl roztworu TNBS (1,1 M) i natychmiast wymieszać. 3. Próbki inkubować 15 minut w temperaturze pokojowej. 4. Do wszystkich probówek dodać po 1 ml buforu fosforanowo-siarczynowego (0,1 M kwaśny fosforan sodu z dodatkiem 1,5 mm siarczynu sodu), zamknąć, wymieszać i zmierzyć absorbancję przy 420 nm wszystkich próbek względem wody. Opracowanie wyników 1. Obliczyć teoretyczne współczynniki kompleksów siarczynowych badanych białek. Za absorbancję do obliczeń przyjąć wartości zmierzone pomniejszone o średnią z wartości absorbancji dwóch próbek ślepych. 2. Na podstawie obliczonych współczynników absorbcji molowych lizozymu i chymotrypsynogenu obliczyć średnie stęŝenia białek w molach na litr [M] oraz w miligramach na mililitr [mg/ml]. 3. Przedyskutować moŝliwe przyczyny ewentualnych odstępstw uzyskanych wartości od danych wagowych. Sekwencje białek: Lizozym (14,3 kda): MRSLLILVLCFLPLAALGKVFGRCELAAAMKRHGLDNYRGYSLGNWVCAAKFESNFNTQA TNRNTDGSTDYGILQINSRWWCNDGRTPGSRNLCNIPCSALLSSDITASVNCAKKIVSDG NGMNAWVAWRNRCKGTDVQAWIRGCRL Chymotrypsynogen A (25,5 kda): CGVPAIQPVLSGLSRIVNGEEAVPGSWPWQVSLQDKTGFHFCGGSLINENWVVTAAHCGV TTSDVVVAGEFDQGSSSEKIQKLKIAKVFKNSKYNSLTINNDITLLKLSTAASFSQTVSA VCLPSASDDFAAGTTCVTTGWGLTRYTNANTPDRLQQASLPLLSNTNCKKYWGTKIKDAM

6 ICAGASGVSSCMGDSGGPLVCKKNGAWTLVGIVSWGSSTCSTSTPGVYARVTALVNWVQQ TLAAN Ilościowe oznaczanie grup tiolowych w białkach za pomocą odczynnika Ellmana Odczynnik Ellmana [kwas 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoesowy), w skrócie DTNB] jest najpowszechniej uŝywanym odczynnikiem do oznaczania wolnych grup tiolowych (-SH). Reakcja oznaczania jest czuła, szybka i zarazem bardzo prosta. PoniewaŜ istotne jest, by grupy -SH były w formie zjonizowanej reakcję przeprowadza się w ph lekko zasadowym. DTNB reaguje z taką zjonizowana grupą tworząc tionitrobenzoesową pochodną białka oraz barwny anion tionitrobenzoesowy (TNB) o maksimum absorbcji przy 412 nm. PoniewaŜ na kaŝdą grupę -SH przypada utworzenie jednej cząsteczki kwasu tionitrobenzoesowego to znając absorbcję molową tego związku przy 412 nm ( M -l cm -l ) jesteśmy w stanie wyznaczyć stęŝenie grup -SH w badanym białku przez prosty pomiar spektrofotometryczny. Reakcja z DTNB moŝe być przeprowadzana zarówno w warunkach denaturujących (pozwalając na wyznaczenie całkowitej liczby wolnych grup -SH w białkach) jak i w środowisku nie denaturującym (moŝemy wówczas oszacować liczbę grup tiolowych wyeksponowanych na powierzchni białka). Odczynnik Ellmana moŝna równieŝ wykorzystać do wyznaczenia ilości mostków disiarczkowych w białkach. Reakcja ma wówczas przebieg dwuetapowy. Najpierw DTNB całkowicie utleniamy w roztworze siarczynu sodu do tionitrosulfobenzoesanu (TNSB):

7 Po czym powstały tionitrosulfobenzoesan poddajemy w buforze zawierającym nadmiar jonów siarczynowych reakcji z białkiem zawierającym oznaczane mostki disiarczkowe: Dochodzi wówczas do reakcji analogicznej jak przy oznaczaniu grup -SH: na kaŝdą parę mostków disiarczkowych powstaje jeden anion TNB. Wykonanie 1. Do trzech probówek odmierzyć kolejno po 30, 40 i 50 µl roztworu owalbuminy (nawaŝka 13 mg/ml). Zawartość probówek dopełnić do 1 ml 0,1 M buforem Tris-HCl o ph 8,0. 2. Przygotować trzy analogiczne jak wyŝej próbki, lecz dopełnić je buforem zawierającym dodatkowo 1 % siarczanu dodecylu sodu (SDS). 3. Przygotować próby ślepe zawierające odpowiednio 1 ml buforu bez SDS lub 1 ml buforu z SDS. 4. Do kaŝdej probówki dodać po 40 µl 0,1 M roztworu DTNB, natychmiast wymieszać i inkubować 15 minut w temperaturze pokojowej. 5. Zmierzyć absorbancję próbek przy 412 nm względem odpowiednich prób ślepych. Opracowanie wyników 1. Obliczyć ilość grup -SH przypadających na jedną cząsteczkę natywnej i na jedną cząsteczkę zdenaturowanej owalbuminy. 2. Przedyskutować uzyskane wyniki. Sekwencja białka: Owalbumina (42,75 kda) :

8 GSIGAASMEFCFDVFKELKVHHANENIFYCPIAIMSALAMVYLGAKDSTRTQINKVVRFD KLPGFGDSIEAQCGTSVNVHSSLRDILNQITKPNDVYSFSLASRLYAEERYPILPEYLQC VKELYRGGLEPINFQTAADQARELINSWVESQTNGIIRNVLQPSSVDSQTAMVLVNAIVF KGLWEKAFKDEDTQAMPFRVTEQESKPVQMMYQIGLFRVASMASEKMKILELPFASGTMS MLVLLPDEVSGLEQLESIINFEKLTEWTSSNVMEERKIKVYLPRMKMEEKYNLTSVLMAM GITDVFSSSANLSGISSAESLKISQAVHAAHAEINEAGREVVGSAEAGVDAASVSEEFRA DHPFLFCIKHIATNAVLFFGRCVSP Podkreślone cysteiny 73 i 120 są połączone mostkiem disiarczkowym Ilościowe oznaczanie grup tiolowych w białkach metodą elektroforetyczną Grupy tiolowe w białkach i peptydach moŝna oznaczać równieŝ metodą elektroforetyczną, która w porównaniu do opisanej wyŝej metody z DTND jest od 10 do 100 razy czulsza i nie wymaga zastosowania spektrofotometru. Ponadto metoda elektroforetyczna jest niezastąpiona w przypadku, gdy jest nam potrzebna informacja na temat ilości reszt cysteiny przypadających na cząsteczkę badanego polipeptydu, a równocześnie nie znamy jego masy cząsteczkowej lub teŝ posiadamy preparat o niedokładnie oznaczonym stęŝeniu. Wadą metody elektroforetycznej jest jej praco- i czasochłonność. Metoda polega na poddaniu cystein badanego białka reakcji z mieszaniną kwasu jodooctowego z jodoacetamidem. Kwas jodooctowy modyfikuje grupy SH do kwaśnych grup karboksymetylowych SCH 2 COO -, zaś jodoacetamid przekształca grupy SH w obojętne grupy karboksyamidometylowe SCH 2 CONH 2. Jeśli badany łańcuch polipeptydowy poddamy działaniu nadmiaru mieszaniny kwasu jodooctowego oraz jodoacetamidu, uŝywając róŝnych proporcji tych odczynników względem siebie, to odczynniki te będą konkurowały między sobą w reagowaniu z dostępnymi wolnymi resztami SH. Otrzymamy w rezultacie mieszaninę zmodyfikowanych cząsteczek białka posiadających 0, 1, 2,... i n kwaśnych grup karboksymetylowych oraz n, n-1, n-2,... i 0 obojętnych grup karboksyamidometylowych (gdzie n to liczba wolnych reszt SH w białku). Gdy mieszaninę taką rozdzielimy elektroforetycznie to uzyskamy zespół prąŝków pochodzących od grup cząsteczek róŝnorodnie zmodyfikowanego białka, róŝniących się między sobą kolejno ładunkiem jednego ugrupowania kwaśnego. Liczba prąŝków bezpośrednio obrazuje liczbę wolnych grup tiolowych w badanym łańcuchu polipeptydowym. Metodę w powyŝszym kształcie, przeprowadzaną w natywnych buforach, stosuje się do bezpośredniego określenia liczby dostępnych grup SH w białku. Poprzez odpowiednie modyfikacje moŝna ją jednak rozszerzyć o oznaczanie liczby grup niedostępnych na

9 powierzchni cząsteczki oraz do określenia liczby grup tiolowych zaangaŝowanych w tworzenie mostków disiarczkowych. W pierwszym przypadku po prostu oblicza się róŝnicę w ilości wyznaczonych grup tiolowych dla białka poddawanego reakcji w obecności denaturującego 8 M roztworu mocznika i bez niego. Podobnie, w celu określenia ilości mostków -S-S- reakcje przeprowadza dwukrotnie: raz po uprzedniej redukcją białka i ponownie bez tej redukcji, a następnie oblicza się róŝnice miedzy uzyskanymi liczbami reszt SH, która określao ilości grup zaangaŝowanych w tworzenie wiązań. Przedstawiona poniŝej procedura zawiera opis metody pomiaru całkowitej ilości reszt cysteinowych w cząsteczce białka, czyli obejmuje procedurę jego denaturacji oraz redukcji ewentualnych mostków disiarczkowych. Wykonanie: 1. Denaturacja, redukcja i alkilacja białka: Do probówki zawierającej 200 µg sojowego inhibitora trypsyny (STI) dodać po 10 µl następujących roztworów: 1 M Tris-HCl o ph 8,0; 0,1M EDTA, 1 M ditiotreitiol (DTT). Następnie dodać 1 ml 8 M roztworu mocznika, zawartość probówki wymieszać i inkubować 1 godzinę w temp. 37ºC. Przygotować świeŝe roztwory alkilujące: A: 0,25 M jodoacetamid w 0,25 M Tris-HCl o ph 8,0; B: 0,25 kwas jodooctowy w 0,25 M Tris-HCl o ph 8.0, C: 10 µl A + 10µl B; D: 10 µl A + 30 µl B i E: 10µl A + 90 µl B. Do pięciu kolejnych probówek odpipetować po 10 µl roztworów A do E, dodać po 40 µl roztworu zdenaturowanego i zredukowanego białka, wymieszać i inkubować 15 minut w temp. pokojowej. 2. Analiza elektroforetyczna: Do pięciu probówek ze zmodyfikowanym białkiem dodać po 12,5 µl buforu próbkowego (50 % glicerol w wodzie ze szczyptą błękitu bromofenolowego) i zawartość probówek wymieszać. Przygotować szóstą próbkę zawierającą wszystkie formy zmodyfikowanego białka poprzez zmieszanie ze sobą porcji 8 µl z probówek 1-5. Na kolejne sześć ścieŝek Ŝelu elektroforetycznego nakładać po 40 µl przygotowanych w ten sposób próbek. śel zagęszczający spolimeryzować z buforu zawierającego 0,063 M Tris-HCl o ph 6,8; 2,4 % akrylamidu i 0,075 % bisakrylamidu, zaś Ŝel rozdzielający spolimeryzować z buforu 0,037 M Tris-HCl o ph 8,8; 7,5 % akrylamidu i 0,23 % bisakrylamidu. Do obu Ŝeli dodać przed polimeryzacją mocznik do końcowego stęŝenia 6 M. Elektroforezę prowadzić w buforze

10 elektrodowym 0,025 M Tris; 0,192 M glicyna o ph 8,3 w kierunku elektrody dodatniej, przy napięciu 50 V w Ŝelu zagęszczającym i 100 V w Ŝelu rozdzielającym. Po elektroforezie Ŝel barwić 20 minut w 0,025% roztworze Coomassie Brillant Blue G-250 w 3,5% HClO 4. Odbarwiać w 7% kwasie octowym. Ze względu na nietrwałość uzyskanego wybarwienia Ŝelu, jego obraz natychmiast po odbarwieniu przerysować w skali 1:1 na kartce papieru. Opracowanie wyników: STI jest białkiem o masie cząsteczkowej około 18 kda, zawierającym 4 reszty cysteiny. Są one połączone dwoma mostkami disiarczkowymi. Opisać uzyskany obraz elektroforetyczny tego białka: zaznaczyć prąŝki białka całkowicie karboksymetylowanego i karboksyamidometylowanego oraz form pośrednich. Na podstawie uzyskanej ilości prąŝków podać ilość wszystkich reszt cysteinowych w STI. Czy jest ona zgodna z oczekiwaniami? Jeśli nie to podać moŝliwe przyczyny uzyskania takiego nieprawidłowego wyniku. W doświadczeniu uŝyto trzech róŝnych proporcji kwasu jodooctowego do jodoacetamidu. Czy system taki sprawdzi się w przypadku białek zawierających np. kilkanaście cystein? Fragmentacja łańcucha polipeptydowego po resztach tryptofanu za pomocą odczynnika BNPS-skatole W ćwiczeniu przedstawiono przykładową procedurę chemicznej fragmentacji łańcucha polipeptydowego. Podobnych metod opracowano wiele, a ich wspólną cechą jest selektywna modyfikacja określonych łańcuchów bocznych konkretnych aminokwasów prowadząca do zerwania przyległego wiązania peptydowego. Metody chemicznego trawienia róŝnią się oczywiście pomiędzy sobą rodzajem stosowanego do fragmentacji odczynnika, stopniem jego specyficzności w stosunku do danego ugrupowania bocznego aminokwasu, wydajnością trawienia oraz ewentualnym powstawaniem kłopotliwych produktów ubocznych. Trzeba równieŝ zaznaczyć, Ŝe bardzo waŝną cechą przesądzającą o uŝyteczności danej metody chemicznej fragmentacji białek jest pozostawienie po trawieniu N- i C-końcowych aminokwasów wynikowych peptydów w niezmodyfikowanej formie, umoŝliwiającej na przykład ich sekwencjonowanie. Szczególnie uŝytecznymi w chemii białek są odczynniki trawiące łańcuch polipeptydowy po

11 rzadko występujących aminokwasach, dające tym samym długie peptydy. UŜyteczność ta wynika po prostu z braku alternatywnych, wystarczająco specyficznych enzymów proteolitycznych trawiących na długie fragmenty. Jednym z najrzadziej występujących aminokwasów w białkach jest tryptofan a stosunkowo wysoka reaktywność jego pierścienia indolowego stwarza wiele moŝliwości chemicznych modyfikacji prowadzących do rozerwania sąsiadującego wiązania peptydowego. Najczęściej stosowana jest oksydatywna halogenacja pierścienia indolowego za pomocą organicznych odczynników zawierających brom. Przykładem takiego odczynnika jest BNPS-skatole, czyli 3-bromo-3-metylo-2-(2 - nitrofenylosulfofenylo)-indolenina. Odczynnik ten, oraz mechanizm reakcji trawienia został opisany w rozdziale 8 (rys. 8-3 i 8-6). Przy stosowaniu tej metody fragmentacji białka, naleŝy pamiętać, Ŝe jeśli trawiona próbka posiada w swym składzie wiązanie peptydowe Asp-Pro to ze względu na stosowane tutaj długie czasy inkubacji białek w kwaśnym ph moŝe dojść do jego przerwania, poniewaŝ. wiązanie to jest szczególnie wraŝliwe na kwaśną hydrolizę. Wykonanie: 1. Trawienie białka i ekstrakcja produktów ubocznych: Do probówki odmierzyć 250 µl roztworu albuminy wołowej (2 mg/ml) w 80% kwasie octowym. Dodać 1 mg BNPS-skatole, probówkę zamknąć i inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej. Po 1, 5, 10 i 24 godzinach pobierać porcje po 50 µl które natychmiast poddać procedurze usunięcia nadmiaru odczynnika trawiącego oraz usunięcia produktów ubocznych reakcji poprzez ekstrakcję octanem etylu. Ekstrakcję prowadzić w następujący sposób: do 50 µl pobranej frakcji dodać 50 µl wody, wymieszać i dodać 100 µl octanu etylu. Następnie intensywnie wytrząsać do momentu powstania mlecznoŝółtej emulsji i zawiesinę wirować 2 minuty przy x g. Górną warstwę zawierającą produkty uboczne oraz nie przereagowany BNPS-skatol usunąć za pomocą pipety, ponownie dodać 100 µl octanu etylu i operację ekstrakcji powtórzyć. Otrzymane frakcje wodne zawierające strawione białko poddać liofilizacji. 2. Analiza elektroforetyczna uzyskanych peptydów: Zawartość kaŝdej probówki zawierającej zliofilizowane strawione białko rozpuścić w 25 µl wody. Z kaŝdej probówki pobrać po 10 µl roztworu, przenieść do nowej probówki i wymieszać z 30 µl redukującego buforu denaturującego zawierającego SDS. Do piątej

12 probówki dodać 5 µl wyjściowego nie strawionego roztworu BSA (2 mg/ml) i 15 µl buforu denaturujacego, a do szóstej 10 µl handlowej gotowej (zwierającej bufor z SDS) mieszaniny białek-markerów mas cząsteczkowych. Wszystkie probówki gotować 5 minut na łaźni wodnej i nałoŝyć kolejno do studzienek poliakrylamidowego Ŝelu elektroforetycznego SDS-PAGE w układzie Laemliego (patrz: Analiza instrumentalna w biochemii A. Kozik, M. Rąpała-Kozik, I. Guevara-Lora, Seria Wydawnicza IBM UJ, 2001, str ). Elektroforezę prowadzić przy napięciu 100 V do momentu osiągnięcia przez barwnik indykatorowy górnej granicy Ŝelu rozdzielającego i później 200 V do momentu osiągnięcia przez barwnik końca płytki (30-40 minut). Po elektroforezie Ŝel barwić 20 minut w 0,025% roztworze Coomassie Brillant Blue G-250 w 3.5% HClO 4. Odbarwiać w 7% kwasie octowym. Ze względu na nietrwałość uzyskanego wybarwienia Ŝelu jego obraz natychmiast po odbarwieniu przerysować w skali 1:1 na kartce papieru. Opracowanie wyników: BSA jest białkiem o masie Da liczącym 582 aminokwasy. Zawiera dwie reszty tryptofanylowe w pozycjach 133 i 212. Fragmentacja całego łańcucha po resztach tryptofanu doprowadzi wiec do powstania trzech fragmentów: N-końcowego o masie Da, środkowego o masie Da i C-końcowego o masie Da. W swej sekwencji BSA zawiera równieŝ dwa wiązania peptydowe Asp-Pro: jedno pod koniec wyŝej wymienionego peptydu N-końcowego i drugie pośrodku peptydu C-końcowego. Na podstawie uzyskanego obrazu elektroforetycznego oraz mas cząsteczkowych białek standardowych oszacować w przybliŝeniu masy cząsteczkowe wszystkich prąŝków obecnych w ścieŝkach zawierających strawione białko i dokonać próby ich identyfikacji. Czy wszystkie wiązania peptydowe po resztach tryptofanu zostały strawione? Czy moŝna powiedzieć, Ŝe trawienie było specyficzne? Czy moŝna określić w jakich miejscach cząsteczki białka dochodziło do preferencyjnego trawienia? Jakie moŝna zaproponować sposoby zwiększenia wydajności tej reakcji fragmentacji?