ULTRAFILTRACJA JAKO TECHNIKA ODBIAŁCZANIA PRÓBKI

Transkrypt

1 ULTRAFILTRACJA JAKO TECHNIKA ODBIAŁCZANIA PRÓBKI Instrukcja do ćwiczeń opracowana w Katedrze Chemii Środowiska Uniwersytetu Łódzkiego. 1. Wprowadzenie Próbki biologiczne, do których zaliczamy materiał pochodzenia roślinnego i zwierzęcego, jak również wszelkiego rodzaju produkty żywnościowe, w tym surowy materiał z produkcji rolnej i wysoko przetworzone produkty spożywcze, oraz płyny biologiczne takie jak krew, czy ślina, stanowią częste obiekty badań analitycznych. Jednym z głównych, wielkocząsteczkowych składników próbek biologicznych są białka. Z punktu widzenia procedury przygotowania próbki do analizy ich obecność w próbce przysparza najwięcej kłopotów i wymaga zastosowania odpowiednich technik umożliwiających ich wyodrębnienie. Jest to szczególnie istotne w przypadku oznaczania związków niskocząsteczkowych techniką wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Wprowadzenie białek, np. do systemu HPLC, lub do kolumny chromatograficznej nieprzystosowanej do ich rozdzielania, powoduje szybki spadek sprawności kolumny i wzrost oporu, oraz wiąże się z podwyższeniem ciśnienia fazy ruchomej w układzie chromatograficznym. Wyjątek stanowią specjalne kolumny chromatograficzne, na które można nanosić rozcieńczone próbki zawierające białka. W związku z zagrożeniem uszkodzenia kolumny chromatograficznej próbki biologiczne powinny być pozbawione białek, przed ich końcową analizą. Popularną metodą oddzielenia białek od analitu jest ich wytrącanie, przy zastosowaniu odpowiednich odczynników lub temperatury. Po wytrąceniu białka, próbkę poddaje się sączeniu lub wirowaniu. Niestety ten sposób powoduje często znaczne rozcieńczenie próbki. Alternatywną metodą jest ultrafiltracja - wirowanie płynnego materiału biologicznego na odpowiednich filtrach membranowych typu cut off, pozwalających na oddzielenie białka od innych małocząsteczkowych składników próbki. Zaliczana jest ona do techniki, które umożliwiają zatężanie analitów lub ich oddzielenie od pozostałych składników próbki bez konieczności dostarczenia ciepła, czyli technik membranowych. W procesie filtracji cząstki są rozdzielane na podstawie wielkości oraz kształtu molekuł z wykorzystaniem ciśnienia oraz specjalnie zaprojektowanych membran półprzepuszczalnych. W procesie ultrafiltracji duże cząsteczki zostają zatrzymywane przez membranę o określonej wielkości porów, z kolei cząsteczki rozpuszczalnika wraz ze 1

2 składnikami o mniejszych rozmiarach cząsteczek przechodzą przez nią. Ultrafiltracja jest procesem rozdzielania wykorzystującym membranę, której pory charakteryzują się wielkością w zakresie 0,1 0,001 mikrona. Najczęściej w trakcie przeprowadzania ultrafiltracji z roztworu usuwane są cząsteczki o dużej masie molekularnej, cząsteczki koloidalne oraz organiczne i nieorganiczne polimery. Cząsteczki organiczne o niskiej masie molekularnej oraz jony, takie jak: sodowy, wapniowy, magnezowy, chlorkowy oraz siarczanowy przenikają przez membranę (Rys. 1). Rys. 1. Rozdzielanie różnej wielkości składników próbki za pomocą membrany podczas filtracji próbki. Membrany wykorzystywane do oddzielania białek najczęściej wykonane są z materiałów ceramicznych lub syntetycznych polimerów, takich jak polisulfon, teflon, czy octan celulozy. Materiały te nie są cytotoksyczne, ani też w żaden inny sposób nie wpływają na filtrowany roztwór. Ściany membran filtrów charakteryzują się anizotropową strukturą, tzn. kanały porów rozszerzają się od powierzchni membrany w głąb jej struktury. Dzięki temu cząsteczki, które są zatrzymywane przez daną membranę, zatrzymują się na jej powierzchni i nie zapychają światła kapilar w jej wnętrzu. Siłą napędową procesu ultrafiltracji jest różnica ciśnień hydrostatycznych po obu stronach przegrody, rzędu 0,05-0,5 MPa. Ultrafiltracja jest wykorzystywana m. in. do: - oddzielania cząstek koloidalnych od reszty zawiesiny, - oddzielania cząstek o danym rozmiarze od cząstek o innych rozmiarach, - określenia dystrybucji cząsteczek o różnych wymiarach w systemie koloidalnym poprzez wykorzystanie filtrów z gradientem rozmiarów porów. W procedurach przygotowania próbek do analizy doskonale sprawdza się jako technika odbiałczania próbki. W tym celu stosuje się filtry membranowe, zwane cut off. 2

3 Filtry te zbudowane są z filtra, do którego wprowadzana jest próbka, probówki, w której zbierany jest przesącz oraz korka przyłączonego do filtra, zabezpieczającego przez wylaniem się lub wyparowaniem próbki (Rys.2). Korek Filtr z membraną Probówka na filtrat Rys. 2. Budowa filtra typu cut off. Do najczęściej analizowanych płynów ustrojowych bogatych w białka należą krew i ślina. Ślina to płyn ustrojowy wydzielany przede wszystkim przez ślinianki przyuszne, podżuchwowe i przyjęzykowe. Takie czynniki jak: płeć, wiek, czy rodzaj bodźca wzbudzającego pracę ślinianek determinują ilość i skład wydzielanej śliny. Głównym składnikiem śliny jest woda, która stanowi niemal 99,5% całości. Na pozostałe 0,5% składają się składniki nieorganiczne (0,2%), oraz organiczne (0,3%), martwe - resztki pokarmowe, złuszczony nabłonek, martwe komórki układu odpornościowego, oraz żywe - bakterie, wirusy i grzyby wraz z ich metabolitami. Ciekły stan skupienia próbki oraz łatwość jej pobrania powoduję, że ślina jest materiałem stosunkowo łatwym do badań. Pobieranie próbek śliny nie należy do procedur skomplikowanych. Przed pobraniem próbki śliny należy przepłukać jamę ustną ciepłą wodą, a następnie pozwolić na swobodne ściekanie 6-8 ml próbki bezpośrednio do próbówki. Ze śliną częściowo wydalane są z organizmu substancje organiczne, nieorganiczne, jak również leki. Przyczyną niewielkiego zastosowania śliny jako materiału biologicznego w analizie toksykologicznej jest zmienna wartość podziału stężenia leku pomiędzy ślinę i surowicę. Stężenie leku w ślinie jest odzwierciedleniem stężenia w surowicy części leku nie związanego z białkiem. Do substancji szkodliwych oznaczanych w próbkach śliny zaliczamy leki takie jak: penicylina, streptomycyna, kwas salicylowy, a także etanol, nikotynę, pestycydy oraz metale ciężkie, w tym rtęć, kadm, ołów i stront. 3

4 W ślinie oznaczać można również zawartości aminokwasów tiolowych, w tym zawartość homocysteiny (Rys. 3), której nadmiar we krwi uszkadza naczynia krwionośne i powoduje zaburzenia krzepliwości krwi. Rys. 3. Wzór strukturalny homocysteiny. 2. Odczynniki i aparatura -Packard 1100 z detektorem FLD -1 ( mm, 5 μm), Phenomenex filtry Vivaspin 30 kda wirówka laboratoryjna firmy Hetich rozpuszczalniki i roztwory do przygotowania fazy ruchomej (acetonitryl, 0,1 M NaOH oraz 0,01 M OPA) roztwór standardowy homocysteiny 2 M bufor fosforanowy, ph=7,8 na Wymagane środki ostrożności Identyfikacja zagrożeń (Klasyfikacja zgodnie z dyrektywami UE 67/548/EWG lub 1999/45/WE): Wodorotlenek sodu - C Produkt żrący R35 Acetonitryl - F Produkt wysoce łatwopalny R11, T Produkt toksyczny R23/24/25, R39/23/24/25 Aldehyd ftalowy - T, N Produkt toksyczny, Produkt niebezpieczny dla środowiska R25, R34, R43, R50 4

5 - w razie kontaktu ze skórą: spłukać dużą ilością wody. - w razie kontaktu z oczami: przepłukać dużą ilością wody, przy szeroko otwartej powiece. - jeżeli osoba poszkodowana oddycha, przenieść na świeże powietrze. Jeżeli osoba poszkodowana nie oddycha, zastosować sztuczne oddychanie. Zasięgnąć porady medycznej. - w przypadku wystąpienia podrażnień skontaktować się z lekarzem. - w razie spożycia: przepłukać usta wodą. 3. Wykonanie ćwiczenia Celem ćwiczenia jest zastosowanie techniki ultrafiltracji do odbiałczenia próbki na etapie jej przygotowania do oznaczenia homocysteiny w ślinie człowieka Przygotowanie układu chromatograficznego do pracy. Warunki chromatograficzne: -1 ( mm, 5 μm), Phenomenex tonitryl, 70% 0,1 M NaOH + 0,01 M OPA /min ex=370 nm, λem=480 nm, wzmocnienie (gain)=14 µl Schemat postępowania: włączenie chromatografu cieczowego (postępować zgodnie ze wskazówkami prowadzącego ćwiczenia oraz instrukcją od chromatografu) podłączenie kolumny do chromatografu (postępować zgodnie ze wskazówkami prowadzącego ćwiczenia) i jej uruchomienie kondycjonowanie kolumny chromatograficznej ustawienie parametrów metody i sekwencji wykonanie analiz wymycie roztworu NaOH oraz OPA z kolumny, umycie kolumny chromatograficznej i przygotowanie do dłuższego przechowywania 5

6 3.2. Przygotowanie próbek do krzywej kalibracyjnej z roztworu standardowego homocysteiny o stężeniu 0,1 mol/l w dwóch powtórzeniach Przygotowanie serii roztworów w kolbkach o pojemności 5 ml, w których końcowe stężenie homocysteiny wynosi: 10; 15; 20; 30 nmol/ml. Szereg rozcieńczeń roztworu macierzystego homocysteiny wykorzystywanych do sporządzenia krzywej kalibracyjnej przygotować na podstawie przeprowadzonych samodzielnie obliczeń. Pobranie i przygotowanie próbki do analizy: do 7 probówek polipropylenowych o pojemności 3 ml pobrać próbki śliny odpipetować 2 ml śliny pełnej do probówek typu ependorf o pojemności 2 ml próbki śliny pełnej odwirować przy g przez 15 minut w temperaturze 4ºC otrzymany supernatant poddać dalszym etapom przygotowania próbki do analizy. Kalibracja 400 µl supernatantu śliny 10 µl H2O lub roztworu standardu homocysteiny o stężeniu 10; 15; 20; 30 nmol/ml Próbkę poddać ultrafiltracji na filtrach Vivaspin 500, PES MWCO 30 kda (4ºC, 10 minut, g). Próbki badane 400 µl supernatantu śliny 10 µl H2O Próbkę poddać ultrafiltracji na filtrach Vivaspin 500, PES MWCO 30 kda (4ºC, 10 minut, g). Uzyskany filtrat przenieść do fiolek stożkowych i podać analizie chromatograficznej. 6

7 Po każdym wirowaniu wszystkie filtry dokładnie umyć. W tym celu na filtry wprowadzić po 400 µl wody i odwirować (4ºC, 10 minut, g). Czynność powtórzyć 3-krotnie. 4. Opracowanie wyników 1. Przygotować wstęp teoretyczny. 2. Wykreślić krzywą kalibracyjną wykorzystując wysokości sygnałów analitycznych (pików) odczytanych z chromatogramów uzyskanych podczas analizy HPLC. Wyniki kalibracji metody przedstawić w formie tabeli według poniższego schematu: Stężenie Średnia wysokość Średnie uzyskane SD RSD Odzysk Hcy piku stężenie Hcy [nmol/ml] [%F] [nmol/ml] [nmol/ml] [%] [%] Wykorzystując równanie krzywej kalibracyjnej wyznaczyć zawartości homocysteiny w badanych próbkach śliny. 4. Wyciągnąć wnioski z przeprowadzonego eksperymentu. Literatura L. Kłyszejko-Stefanowicz, Ćwiczenia z biochemii PWN, Warszawa, P. Stepnowski, E. Synak, B. Szafranek, Z. Kaczyński, Skrypt dla studentów Techniki separacyjne, Wydawnictwo Uniwersytetu Gdańskiego, Gdańsk