PL B1. BAVARIAN NORDIC A/S, Kvistgaard, DK , DK, PA

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP01/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO02/42480 (13) B1 (51) Int.Cl. C12N 15/863 ( ) C12N 15/39 ( ) C12N 7/04 ( ) C12N 5/10 ( ) A61K 39/285 ( ) A61K 48/00 ( ) (54) Zmodyfikowany wirus krowianki szczepu Ankara MVA-BN i jego pochodna, genom i zawierające je kompozycja farmaceutyczna, zwłaszcza szczepionka oraz ich zastosowania (30) Pierwszeństwo: , DK, PA (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 20/04 (73) Uprawniony z patentu: BAVARIAN NORDIC A/S, Kvistgaard, DK (72) Twórca(y) wynalazku: PAUL CHAPLIN, Monachium, DE PAUL HOWLEY, Martinsried, DE CHRISTINE MEISINGER, Gröbenzell, DE (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 08/12 (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Rafał Witek WTS RZECZNICY PATENTOWI-WITEK CZERNICKI ŚNIEŻKO Spółka Partnerska

2 2 PL B1 Opis wynalazku Niniejszy wynalazek dotyczy atenuowanego wirusa, wywodzącego od zmodyfikowanego wirusa krowianki Ankara, charakteryzującego się brakiem zdolności reproduktywnej replikacji w ludzkich liniach komórkowych. W zgłoszeniu opisano rekombinowane wirusy pochodzące od wspomnianego wirusa oraz zastosowanie wirusa lub jego rekombinowanych pochodnych jako leku lub szczepionki. Ponadto, przedstawiono sposób wywołania odpowiedzi immunologicznej, nawet u pacjentów o upośledzonej odporności, pacjentów wykazujących wcześniej odporność na wirus szczepionki lub pacjentów poddanych terapii przeciwwirusowej. Stan techniki Zmodyfikowany wirus krowianki Ankara (MVA) jest spokrewniony z wirusem krowianki, należącym do rodzaju Orthopoxvirus rodziny Poxviridae. MVA otrzymano w wyniku 516 pasaży szczepu Ankara wirusa krowianki (CVA) w fibroblastach embrionów kurcząt (praca przeglądowa Mayr, A. i wsp., Infection 3,6-14 [1975]). W następstwie tego typu, długotrwałych pasaży, uzyskany wirus MVA utracił około 31 kilozasad z sekwencji genomowej, zatem, został opisany jako silnie specyficzny wobec komórek gospodarza ograniczonych do komórek ptasich (Meyer, H. i wsp., J. Gen.Virol. 72, [1991]). Na przykładzie różnych moldeli zwierzęcych wykazano, że otrzymany MVA był silnie wirulentny (Mayr, A. & Danner, K. [1978], Dev.Biol.Stand.41: ). Ponadto, wspomniany szczep MVA poddano próbom klinicznym, stosując go jako szczepionkę do immunizacji przeciwko ospie ludzkiej (Mayr i wsp., Zbl.Bakt.Hyg. I, Abt.Org.B 167, [1987], Stickl i wsp., Dtsch.med.Wschr.99, [1974]). Badaniami tymi objęto ponad 120,000 osób, w tym pacjentów grupy wysokiego ryzyka, i stwierdzono, że w porównaniu ze szczepionkami opartymi na krowiance, MVA posiadał zmniejszoną zjadliwość lub zakaźność, natomiast utrzymywał wysoki poziom immunogenności. W ostatnich latach MVA uzyskiwany był i stosowany jako wektor wirusowy w ekspresji rekombinowanego genu lub jako rekombinowana szczepionka (Sutter, G. i wsp. [1994], Vaccine 12: ). W związku z powyższym, zadziwiający jest fakt, że nawet, jeżeli Mayr i wsp. w latach 1970-tych wykazali, że MVA jest silnie atenuowany i awirulentny wobec ludzi i ssaków, na podstawie kilku ostatnich obserwacji (Blanchard i wsp., 1998, J.Gen.Virol. 79, ; Carrol & Moss, 1997, Virology 238, ; Altenberger, US Patent 5, 185, 146; Ambrosini i wsp., 1999, J.Neurosci. Res. 55(5), 569) stwierdzono, że MVA nie jest w pełni atenuowany u ludzi i w ludzkich liniach komórkowych, ponieważ w komórkach tych może zachodzić resztkowa replikacja. Podsumowano, że przedstawione we wspomnianych publikacjach wyniki uzyskano z użyciem różnych szczepów MVA, a zatem zastosowano istotnie różne wirusy o odmiennych właściwościach, szczególnie dotyczących wzrostu w różnych liniach komórkowych. Za wskaźnik atenuacji wirusa uznano właściwości jego wzrostu. Ogólnie, przyjmuje się szczep wirusa za atenuowany, jeżeli utracił on zdolność reproduktywnej replikacji w komórkach gospodarza, lub też zdolność ta została zredukowana. Powyżej wspomniana obserwacja, świadcząca, że MVA nie jest całkowicie pozbawiony zdolności do replikacji u ludzi i w komórkach ssaczych, stawia pod znakiem zapytania całkowite bezpieczeństwo stosowania MVA jako szczepionki dla ludzi lub jako wektora rekombinacyjnych szczepionek. Szczególnie, niezmiernie ważna w przypadku szczepionki, jak i rekombinowanej szczepionki, jest równowaga pomiędzy skutecznością a bezpieczeństwem wektora wirusowego szczepionki. Przedmiot wynalazku Celem wynalazku jest odkrycie nowych szczepów wirusa o zwiększonym bezpieczeństwie, odpowiednich do prowadzenia produkcji bezpiecznych produktów, takich jak szczepionki lub leki. Ponadto, kolejnym celem jest zapewnienie środków do udoskonalania istniejących systemów szczepienia. Przedmiotem wynalazku jest zmodyfikowany wirus krowianki szczepu Ankara MVA-BN zdeponowanego w Europejskiej Kolekcji Kultur Komórkowych (ECACC), Salisbury (UK), pod numerem V , charakteryzujący się tym, że: (i) jest zdolny do reproduktywnej replikacji w fibroblastach embrionu kurcząt (CEF) oraz w linii komórek nerki młodego chomika BHK i jest niezdolny do reproduktywnej replikacji w liniach komórek ludzkich, (ii) jest niezdolny do replikacji in vivo w organizmie myszy o silnie upośledzonej odporności. Korzystnie, linie komórek ludzkich stanowią: linia komórkowa ludzkiego kostniakomięsaka kości 143B, ludzka linia komórkowa keratynocytów HaCat oraz linia komórkowa ludzkiego gruczolakoraka szyjki macicy HeLa. Korzystnie, mysz o silnie upośledzonej odporności jest niezdolna do produkcji

3 PL B1 3 dojrzałych komórek B i T. Korzystnie, mysz o silnie upośledzonej odporności jest transgeniczną myszą AGR129. Korzystnie Wirus MVA-BN lub jego pochodna według wynalazku charakteryzuje się tym, że został on oczyszczony jako klon. Równie korzystnie, zawiera przynajmniej jedną sekwencję heterologicznego kwasu nukleinowego. Korzystnie, wspomniana sekwencja heterologicznego kwasu nukleinowego wybrana jest z sekwencji kodujących przynajmniej jeden antygen, epitop antygenowy i/lub składnik terapeutyczny. Korzystnie epitopy antygenowe pochodzą z wirusa grypy, z wirusów wybranych z rodziny Flavivirus, Paramyxovirus, Hepatitis - wirusów opryszczki, ludzkiego wirusa braku odporności lub z wirusów powodujących gorączkę krwotoczną. Korzystnie sekwencja heterologicznego kwasu nukleinowego jest genem nef. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest genom określonego powyżej wirusa MVA-BN lub jego pochodnej według wynalazku. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna charakteryzująca się tym, że zawiera określonego powyżej wirusa MVA-BN lub jego pochodną według wynalazku i/lub genom według wynalazku określony powyżej oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, rozcieńczalnik i/lub substancję dodatkową. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest szczepionka charakteryzująca się tym, że zawiera określonego powyżej wirusa MVA-BN lub jego pochodną według wynalazku i/lub genom według wynalazku określony powyżej. Korzystnie kompozycja farmaceutyczna lub szczepionka według wynalazku zawierają przynajmniej 102 TCID50 (dawka infekcyjna hodowli komórkowej) wirusa MVA-BN lub jego pochodnej. Korzystnie określone powyżej: wirus MVA-BN lub jego pochodna, genom, kompozycja lub szczepionka według wynalazku są przeznaczone do oddziaływania na, korzystnie indukowania, odpowiedzi immunologicznej w organizmie żywego zwierzęcia lub człowieka. Równie korzystnie określone powyżej: wirus MVA-BN lub jego pochodna, genom, kompozycja lub szczepionka według wynalazku są przeznaczone do szczepienia zwierzęcia lub człowieka przeciwko chorobie wywoływanej przez ludzkie wirusy z grupy ospy. W szczególności, chorobą wywoływaną przez ludzkie wirusy z grupy ospy jest ospa wietrzna, natomiast zwierzę lub człowiek posiada upośledzoną odporność lub istniejącą wcześniej odporność na wirusy ospy. Zgodnie z kolejnym wariantem wynalazku, zwierzę lub człowiek jest poddawany terapii antywirusowej, przy czym korzystnie terapia antywirusowa jest terapią antyretrowirusową. Równie korzystnie określone powyżej: wirus MVA-BN lub jego pochodna, lub genom są przeznaczone do wprowadzania homologicznej lub heterologicznej sekwencji kwasu nukleinowego do komórek docelowych. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie określonych powyżej: wirusa MVA-BN lub jego pochodnej i/lub genomu według wynalazku do wytwarzania leku lub szczepionki. Korzystnie lek lub szczepionka są przeznaczone do podawania w celu wywoływania odpowiedzi immunologicznej u zwierzęcia lub człowieka. Równie korzystnie, lek lub szczepionka są przeciwko chorobie wywoływanej przez ludzkie wirusy z grupy ospy, przy czym w szczególności chorobą wywoływaną przez ludzkie wirusy z grupy ospy jest ospa wietrzna. Równie korzystnie lek lub szczepionka zawiera przynajmniej 102 TCID50 (dawka infekcyjna hodowli komórkowej) wirusa MVA-BN lub jego pochodnej, przy czym w szczególności wirus MVA-BN lub jego pochodna są przeznaczone do wytwarzania leku do podawania w terapeutycznie skutecznych ilościach w pierwszym szczepieniu ( szczepienie podstawowe ) i w drugim szczepieniu ( szczepienie przypominające ). W szczególności zwierzę lub człowiek posiada upośledzoną odporność lub istniejącą wcześniej odporność na wirusy ospy. Korzystnie zwierzę lub człowiek jest poddawany terapii antywirusowej, przy czym szczególnie korzystnie terapia antywirusowa jest terapią antyretrowirusową. Korzystnie wirus MVA-BN lub jego pochodna według wynalazku określone powyżej są przeznaczone jako adiuwant. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie wirusa MVA-BN lub jego pochodnej według wynalazku określonych powyżej jako adiuwanta. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wprowadzenia sekwencji homologicznego i/lub heterologicznego kwasu nukleinowego do komórek docelowych in vitro charakteryzujący się tym, że obejmuje infekcję komórek docelowych wirusem MVA-BN lub jego pochodną według wynalazku określonych powyżej albo transfekcję komórki docelowej genomem według wynalazku określonym powyżej.

4 4 PL B1 Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania peptydu lub białka charakteryzujący się tym, że obejmuje a) infekcję komórek gospodarza wirusem MVA-BN lub jego pochodną według wynalazku określonych powyżej, b) hodowlę zainfekowanych komórek gospodarza w odpowiednich warunkach oraz c) izolację i/lub wzbogacenie peptydu i/lub białka wyprodukowanych przez wspomnianą komórkę gospodarza. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania wirusa MVA-BN lub jego pochodnej charakteryzujący się tym, że obejmuj e a) infekcję komórek gospodarza wirusem MVA-BN lub jego pochodną według wynalazku określonych powyżej, b) hodowlę zainfekowanych komórek gospodarza w odpowiednich warunkach oraz c) izolację i/lub wzbogacenie wirusa MVA-BN lub jego pochodnej wyprodukowanych przez wspomnianą komórkę gospodarza. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest komórka, korzystnie komórka ludzka, charakteryzująca się tym, że zawiera wirusa MVA-BN lub jego pochodną według wynalazku określone powyżej albo genom według wynalazku określony powyżej. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zestaw do szczepienia podstawowego/przypominającego charakteryzujący się tym, że zawiera wirusa MVA-BN lub jego pochodną według wynalazku określone powyżej, kompozycję według wynalazku określoną powyżej, szczepionkę według wynalazku określoną powyżej do pierwszego szczepienia ( szczepienia podstawowego ) w pierwszej fiolce/pojemniku i do drugiego szczepienia ( szczepienia przypominającego ) w drugiej fiolce/pojemniku. Szczegółowy opis korzystnych realizacji wynalazku W celu osiągnięcia wspomnianych celów opisano nowe wirusy krowianki, zdolne do reproduktywnej replikacji w innych niż ludzkie komórkach i liniach komórkowych, szczególnie w fibroblastach embrionu kurcząt (CEF) i linii komórek nerki młodego chomika BHK (ECACC ), lecz nie wykazujące zdolności reproduktywnej replikacji w ludzkich liniach komórkowych. Znane szczepy krowianki ulegają reproduktywnej replikacji w przynajmniej kilku ludzkich liniach komórkowych, szczególnie linii komórkowej ludzkich keratynocytów HaCat (Boukamp i wsp., 1988, J.Cell Biol. 106 (3): ). Przypuszcza się, że replikacja w linii komórkowej HaCat zachodzi in vivo, szczególnie w przypadku replikacji in vivo u ludzi. W istocie, w części zawierającej przykłady wykazano, że wszystkie testowane, znane szczepy krowianki, które wykazują szczątkową replikację produktywną w HaCat również replikują in vivo. Zatem, korzystna realizacja wynalazku dotyczy wirusów krowianki, które nie ulegają reproduktywnej replikacji w ludzkiej linii komórek HaCat. Szczególnie korzystna realizacja wynalazku związana jest ze szczepami wirusa krowianki nie zdolnymi do reproduktywnej replikacji w żadnej z następujących ludzkich linii komórkowych: ludzka linia komórek gruczolakoraka szyjki macicy HeLa (ATCC Nr CCL-2), ludzka linia komórek nerki embrionu 293 (ECACC Nr ), ludzka linia komórkowa kostniakomięsaka kości 143B (ECACC Nr ) i linia komórkowa HaCat. Wzrost lub amplifikacja/replikacja wirusa wyrażane są zazwyczaj przez stosunek wirusa otrzymanego z zainfekowanej komórki (ilość otrzymana) do ilości pierwotnie użytej w pierwszym miejscu do infekcji komórek (ilość dostarczona) ( stosunek amplifikacji ). Stosunek 1 między wartością otrzymaną a dostarczoną definiuje poziom amplifikacji, dla którego ilość otrzymanego z zainfekowanych komórek wirusa jest taka sama jak ilość użyta początkowo do infekcji komórek. Stan ten świadczy o tym, że zainfekowane komórki są podatne na infekcję wirusową i reprodukcję wirusa. Stosunek amplifikacji mniejszy od 1, tj. obniżenie amplifikacji poniżej poziomu wartości dostarczonej jest wskaźnikiem braku replikacji reproduktywnej, a zatem, wskazuje na atenuację wirusa. Zatem, szczególnie interesujące dla Wynalazców było zidentyfikowanie i ostatecznie, wyizolowanie szczepu, wykazującego stosunek amplifikacji mniejszy niż 1 w kilku ludzkich liniach komórkowych, szczególnie we wszystkich liniach komórkowych 143B, HeLa, 293 i HaCat. Zatem, sformułowanie niezdolny do reproduktywnej replikacji oznacza, że wirus według wynalazku wykazuje stosunek amplifikacji mniejszy od 1 w ludzkich liniach komórkowych, takich jak linie komórkowe: 293 (ECACC Nr ), 143B (ECACC Nr ), HeLa (ATCC Nr CCL-2) oraz HaCat (Boukamp i wsp., 1988, J.Cell Biol. 106 (3): ), w warunkach przedstawionych w przykładzie 1 niniejszego opisu dla kilku specyficznych szczepów MVA. Korzystnie, stosunek amplifikacji

5 PL B1 5 wirusa według wynalazku wynosi 0.8 lub mniej, w każdej z powyższych ludzkich linii komórkowych HeLa, HaCat czy 143B. Wykazano szczegółowo w Przykładzie 1 oraz Tabeli 1, że wirusy stanowiące korzystną realizację niniejszego wynalazku nie ulegają reproduktywnej replikacji w żadnej z linii komórek 143B, HeLa czy HaCat. Szczep stanowiący szczególną realizację niniejszego wynalazku, zastosowany w przykładach, został zdeponowany w Europejskiej Kolekcji Kultur Komórkowych pod numerem V Szczep ten nazwano w opisie MVA-BN. Znane szczepy MVA wykazują szczątkową replikację w przynajmniej jednej z badanych ludzkich linii komórkowych (Figura 1, Przykład 1). Wszystkie znane szczepy krowianki ulegają, przynajmniej w pewnym stopniu, replikacji w linii komórkowej HaCat, natomiast szczepy MVA ujawnione w wynalazku, szczególnie MVA-BN, nie podlegają produktywnej replikacji w komórkach HaCat. Bardziej szczegółowo, MVA-BN wykazuje stosunek amplifikacji 0.05 do 0.2 w ludzkiej linii komórek nerki embrionu 293 (ECACC Nr ). W ludzkiej linii komórek kostniakomięsaka kości 143B (ECACC Nr ) stosunek obejmuje przedział 0.0 do 0.6. W przypadku ludzkiej linii komórek gruczolakoraka szyjki macicy HeLa (ATCC Nr CCL-2) i ludzkiej linii komórek keratynocytów HaCat (Boukamp i wsp. 1988, J.Cell Biol.-106 (3): ) stosunek amplifikacji mieści się w zakresie, odpowiednio, 0.04 do 0.8 i 0.02 do 0.8. MVA-BN wykazywał stosunek amplifikacji 0.01 do 0.06 w komórkach nerki afrykańskiej małpy zielonej (CV1:ATTC Nr CCL-70). Zatem, MVA-BN, który jest prototypowym szczepem według wynalazku, nie replikuje produktywnie w żadnej z testowanych linii komórek ludzkich. Stosunek amplifikacji dla MVA-BN jest ewidentnie wyższy od 1 w fibroblastach embrionów kurcząt (CEF: hodowle podstawowe) lub w linii komórek nerki chomika BHK (ATTC Nr CRL-1632). Jak podkreślono wyżej, stosunek większy niż 1 wskazuje na replikację reproduktywną, ze względu na to, że ilość wirusa otrzymanego z zainfekowanych komórek jest większa niż ilość wirusa użyta do zainfekowania komórek. Zatem, wirus może być łatwo propagowany i powielany (amplifikowany) w hodowlach podstawowych CEF przy stosunku wyższym niż 500, lub też w komórkach BHK przy stosunku wyższym niż 50. W szczególnej realizacji niniejszego wynalazku, wynalazek ujawnia pochodne wirusa, zdeponowanego pod numerem ECACC V Pochodne wirusa zdeponowanego pod numerem ECACC V odnoszą się do wirusów wykazujących istotnie takie same właściwości replikacyjne jak zdeponowany szczep, lecz charakteryzujące się różnicami w jednej lub kilku częściach swojego genomu. Wirusy, posiadające takie same właściwości replikacyjne jak zdeponowany wirus, są wirusami ulegającymi replikacji w podobnym stosunku replikacji jak zdeponowany szczep, w komórkach CEF i linii komórkowej BHK, HeLa, HaCat oraz 143B i ulegającymi replikacji in vivo podobnej do określonej w modelu transgenicznej myszy AGR129 (patrz, poniżej). W korzystnej realizacji, szczepy wirusa krowianki, szczególnie MVA-BN i jego pochodne, charakteryzują się brakiem replikacji in vivo. W rozumieniu niniejszego wynalazku brak replikacji in vivo odnosi się do wirusów nie ulegających replikacji u ludzi i w mysim modelu, omówionym niżej. Brak replikacji in vivo może być korzystnie określony u myszy, niezdolnych do produkowania dojrzałych komórek B i T. Przykładem takiej myszy jest model transgenicznej myszy AGR129 (otrzymany z Mark Sutter, Institute of Virology, University of Zurich, Zurich, Szwajcaria). Wspomniany szczep myszy posiada ukierunkowane uszkodzenia genów w genie receptora IFN I typu (IFN- / ) i typu II (IFN- ) oraz w RAG. Z powodu wspomnianych uszkodzeń, myszy te nie posiadają układu IFN i nie są zdolne do produkowania dojrzałych komórek B i T, i jako takie, wykazują poważne upośledzenie odporności i dużą wrażliwość wobec replikującego wirusa. Zamiast myszy AGR129, możliwe jest zastosowanie jakiegokolwiek innego szczepu myszy, niezdolnego do produkcji dojrzałych komórek B i T, a zatem o silnie upośledzonej odporności i wysoko podatnego wobec replikującego wirusa. W szczególności, wirusy ujawnione w wynalazku nie zabijają myszy AGR129 w okresie przynajmniej 45 dni, korzystniej, przynajmniej 60 dni, najkorzystniej 90 dni po infekcji myszy dawką 10 7 pfu wirusa, podawaną dootrzewnowe. Korzystnie, wirusy wykazujące brak replikacji in vivo charakteryzują się ponadto tym, że nie jest możliwe uzyskanie żadnego wirusa z narządów lub tkanek myszy AGR129 po 45 dniach, korzystnie 60 dniach i najkorzystniej 90 dniach po infekcji myszy dawką 10 7 pfu wirusa podaną dootrzewnowe. Szczegółowe informacje na temat badań obejmujących infekcję myszy AGR129 i analiz, zastosowanych do określenia czy możliwe jest uzyskanie wirusa z narządów i tkanek zainfekowanej myszy, zamieszczono w części zawierającej przykłady.

6 6 PL B1 W korzystnej realizacji, szczepy wirusa krowianki, w szczególności MVA-BN i jego pochodne, charakteryzują się wyższą immunogennością w porównaniu ze znanym szczepem MVA 575, określoną na podstawie analizy mysiego modelu letalnej infekcji. Szczegóły wspomnianego eksperymentu przedstawiono w zamieszczonym poniżej przykładzie 2. W skrócie, w modelu tym, niezaszczepione myszy umierają po zainfekowaniu replikacyjnie kompetentnymi szczepami krowianki, takimi jak szczep Western Reserve L929 TK+ lub IHD-J. Infekcja replikacyjnie kompetentnymi wirusami krowianki określana jest jako infekcja w odniesieniu do modelu infekcji letalnej. Cztery dni po infekcji, myszy zazwyczaj uśmiercano i określano miano wirusa w jajnikach przy użyciu standardowej metody płytkowej (analiza łysinek) z wykorzystaniem komórek VERO (więcej szczegółów zamieszczono w części zawierającej przykłady). Określano miano wirusa dla niezaszczepionych myszy i dla myszy szczepionych wirusami krowianki stanowiącymi realizację wynalazku. Bardziej szczegółowo, wirusy według wynalazku charakteryzują się w tym teście, tym, że po szczepieniu 10 2 TCID 50 /ml wirusa według wynalazku, miano wirusa w jajnikach zostało zredukowane o przynajmniej 70%, korzystnie przynajmniej 80%, bardziej korzystnie przynajmniej 90% w porównaniu z myszami niezaszczepionymi. W korzystnej realizacji, wirusy krowianki, szczególnie MVA-BN i jego pochodne, są użyteczne w immunizacji przy podaniu podstawowym/przypominającym szczepionki. Istnieją liczne raporty, wskazujące, że system szczepienia podstawowego/przypominającego z zastosowaniem MVA jako wektora dostarczającego indukuje niską odpowiedź immunologiczną i jest gorszy od systemu obejmującego szczepienie podstawowe DNA i przypominające MVA (Schneider i wsp., 1998, Nat.Med.4; ). We wszystkich tych badaniach zastosowane szczepy MVA były odmienne od wirusów krowianki według niniejszego wynalazku. W celu wyjaśnienia słabej odpowiedzi immunologicznej, w przypadku zastosowania MVA w podaniu podstawowym i przypominającym, przypuszczano, że wyprodukowane przy podstawowym podaniu przeciwciała wobec MVA neutralizowały MVA podane podczas drugiej immunizacji, uniemożliwiając skuteczne wzmocnienie odpowiedzi immunologicznej. Przeciwnie, doniesiono, że system szczepienia podstawowego DNA/przypominającego MVA był lepszy w generowaniu silnej odpowiedzi, ponieważ system ten łączył zdolność DNA do skutecznej podstawowej odpowiedzi immunologicznej z właściwościami MVA do wzmocnienia tej odpowiedzi przy braku istniejącej wcześniej odporności na MVA. Innymi słowy, jeżeli istniejąca wcześniej odporność na MVA i/lub krowiankę zapobiega wzmocnieniu odpowiedzi immunologicznej, zastosowanie MVA jako szczepionki lub leku może mieć ograniczoną skuteczność, szczególnie w przypadku zaszczepionych przeciwko ospie. Jednakże, zgodnie z kolejną realizacją, wirus krowianki, szczególnie MVA-BN i jego pochodne, jak również odpowiadające im wirusy rekombinowane posiadające sekwencje heterologiczne, mogą być zastosowane do uzyskania skutecznej podstawowej, a następnie przypominającej (wzmacniającej) odpowiedzi immunologicznej u natywnych zwierząt, jak i zwierząt posiadających istniejącą wcześniej odporność na wirusy ospy. Zatem, ujawniony wirus krowianki indukuje przynajmniej istotnie ten sam poziom odporności w systemie szczepienia podstawowego wirusem krowianki/przypominającego wirusem krowianki, w porównaniu z systemem szczepienia podstawowego DNA/przypominającego wirusem krowianki. Przyjęto, że wirus krowianki powoduje indukcję przynajmniej istotnie tego samego poziomu odporności w systemie szczepienia podstawowego wirusem krowianki/przypominającego wirusem krowianki, jak w systemie szczepienia podstawowego DNA/przypominającego wirusem krowianki, jeżeli odpowiedź CTL, mierzona w jednej z dwóch poniższych analiz ( analizie 1 i analizie 2 ), korzystnie w obu analizach, jest przynajmniej taka sama w systemie szczepienia podstawowego wirusem krowianki/przypominającego wirusem krowianki, jak w systemie szczepienia podstawowego z użyciem DNA/przypominającego z wirusem krowianki. Korzystniej, odpowiedź CTL po podaniu szczepienia podstawowego z wirusem krowianki/przypominającego z wirusem krowianki jest wyższa w przynajmniej jednej z analiz, od uzyskanej w systemie szczepienia podstawowego z DNA/przypominającego z wirusem krowianki. Najkorzystniej, odpowiedź CTL jest wyższa w obu następujących analizach. Analiza 1: W celu szczepienia podstawowego wirusem krowianki/przypominającego wirusem krowianki, 6-8 tygodniowe myszy BALB/c (H-2d) immunizowano wstępnie poprzez dożylne podanie 10 7 TCID 50 wirusa krowianki stanowiącego korzystną realizację wynalazku, ekspresjonującego politop murynowy, zgodnie z opisem Thomson i wsp., 1988, J.Immunol.160, 1717 oraz poddawano immunizacji przypominającej stosując taką samą dawkę wirusa, podawaną w taki sam sposób trzy tygodnie później. W tym celu niezbędne było otrzymanie rekombinowanego wirusa krowianki ekspresjonującego wspomniany politop. Sposoby uzyskiwania rekombinowanych wirusów są znane specjalistom

7 PL B1 7 w dziedzinie i zostały przedstawione szczegółowo poniżej. W systemie szczepienia podstawowego z DNA/przypominającego z wirusem krowianki, szczepienie podstawowe dokonywane jest drogą domięśniowego wstrzyknięcia myszy 50 g DNA ekspresjonującego taki sam antygen jak wirus krowianki; podanie przypominające wirusa krowianki następuje dokładnie taką samą drogą jak podawanie podstawowe wirusa krowianki/przypominające wirusa krowianki. Plazmid DNA ekspresjonujący politop został również opisany w załączonej tytułem referencji publikacji wg Thomson i wsp. W obu systemach, rozwinięcie odpowiedzi immunologicznej CTL na epitopy SYIPSAEKI, RPQASGVYM i/lub YPHFMPTNL określane jest dwa tygodnie po podaniu przypominającym. Określenie odpowiedzi CTL jest korzystnie dokonywane przy użyciu analizy ELISPOT, opisanej przez Schneider i wsp., 1998, Nat.Med.4, , jak podkreślono poniżej, w części zawierającej przykłady, i dla jednego specyficznego wirusa według niniejszego wynalazku. Wirus stanowiący przykładową realizację wynalazku charakteryzował się w eksperymencie, tym, że odpowiedź immunologiczna, oceniana na podstawie ilości komórek produkujących IFN- /10 6 komórek śledziony (patrz również część eksperymentalna), wobec wspomnianych powyżej epitopów, indukowana podaniem podstawowym wirusa krowianki/przypominającym wirusa krowianki była istotnie taka sama, korzystnie przynajmniej taka sama, jak indukowana przez podanie podstawowe DNA/przypominające wirusa krowianki. Analiza 2: Analiza ta częściowo odpowiada analizie 1. Jednakże, zamiast zastosowania podawania i.v TCID 50 wirusa krowianki, jak w analizie 1, w 2 analizie, podawane jest podskórnie w podstawowej immunizacji i w immunizacji przypominającej 10 8 TCID 50 wirusa krowianki stanowiącego przykładową realizację wynalazku. Wirus stanowiący przykładową realizację wynalazku, charakteryzował się omawianym w eksperymencie tym, że odpowiedź immunologiczna CTL na wymienione powyżej epitopy, indukowana przez podanie podstawowe wirusa krowianki/przypominające wirusa krowianki była istotnie taka sama, korzystnie, przynajmniej taka sama, jak indukowana przez podanie podstawowe z DNA/przypominające z wirusem krowianki. Odpowiedź oceniana była na podstawie ilości komórek produkujących IFN- /10 6 komórek śledziony (patrz, również część eksperymentalna). Siła odpowiedzi CTL, mierzona w jednej z przedstawionych wyżej analiz odpowiadała poziomowi ochrony. Zatem, wirusy według wynalazku są szczególnie odpowiednie do zastosowania w szczepieniu. Reasumując, wirus krowianki stanowiącego przykładową realizację wynalazku charakteryzuje się posiadaniem przynajmniej jednej z następujących właściwości: (i) zdolność reproduktywnej replikacji w fibroblastach embrionów kurcząt (CEF) oraz w linii komórkowej BHK, lecz przy tym brak zdolności reproduktywnej replikacji w ludzkiej linii komórkowej HaCat, (ii) brak replikacji in vivo, (iii) indukcja wyższej immunogenności w porównaniu ze znanym szczepem MVA 575 (ECACC V ) w modelu letalnej infekcji i/lub (iv) indukcja przynajmniej istotnie takiego samego poziomu odporności w systemie szczepienia podstawowego wirusem krowianki/przypominającego wirusem krowianki, jak w systemie szczepienia podstawowego z DNA/przypominającego z wirusem krowianki. Korzystnie, wirus krowianki stanowiący przykładową realizację wynalazku posiada przynajmniej dwie z wyżej wymienionych cech, korzystniej przynajmniej trzy z wyżej wymienionych cech. Najkorzystniej, wirusy krowianki posiadają wszystkie wyżej wymienione cechy. W kolejnej realizacji, wynalazek dotyczy zestawu do szczepienia, obejmującego wirus według niniejszego wynalazku do pierwszego szczepienia ( podstawowego ) w pierwszej fiolce/pojemniku oraz do drugiego szczepienia ( przypominającego ) w drugiej fiolce/pojemniku. Wirus może być nierekombinowanym wirusem krowianki, tj. wirusem krowianki nie zawierającym heterologicznych sekwencji nukleotydów. Przykładem takiego wirusa krowianki jest MVA-BN i jego pochodne. Alternatywnie, wirus może być rekombinowanym wirusem krowianki, zawierającym dodatkowe sekwencje nukleotydowe, heterologiczne dla wirusa krowianki. Jak podkreślono w każdej z części opisu, sekwencje heterologiczne mogą kodować epitopy, które indukują odpowiedź układu odpornościowego. Zatem, możliwe jest zastosowanie rekombinowanego wirusa krowianki do szczepienia przeciwko białkom lub czynnikom obejmującym wspomniany epitop. Wirusy mogą być otrzymywane zgodnie ze szczegółowym opisem zamieszczonym poniżej. Ilość wirusa, która może być użyta do każdego szczepienia została zdefiniowana powyżej. Dla specjalistów w dziedzinie oczywiste jest uzyskanie wirusów krowianki posiadających przynajmniej jedną z następujących właściwości:

8 8 PL B1 - zdolność reproduktywnej replikacji w fibroblastach embrionów kurcząt (CEF) oraz w linii komórek nerki młodych chomików BHK, lecz jednoczesny brak zdolności reproduktywnej replikacji w ludzkiej linii komórkowej keratynocytów HaCat, - brak replikacji in vivo, - indukcja wyższej immunogenności w porównaniu ze znanym szczepem MVA 575 (ECACC V ) w modelu infekcji letalnej oraz/lub - indukcja przynajmniej istotnie takiego samego poziomu odporności w systemie szczepienia podstawowego wirusem krowianki/przypominającego wirusem krowianki, jak w przypadku systemu szczepienia podstawowego z DNA/przypominającego z wirusem krowianki. Proces otrzymywania takiego wirusa może obejmować następujące etapy: (i) wprowadzenie znanego szczepu wirusa krowianki, korzystnie MVA 574 lub MVA 575 (ECACC V ) do innych niż ludzkie komórek, w których wirus jest w stanie ulegać reproduktywnej replikacji, przy czym różne niż ludzkie komórki są korzystnie wybrane spośród komórek CEF i linii komórek BHK, (ii) izolacja/wzbogacenie cząsteczek wirusa z tych komórek i (iii) analiza pozwalająca na określenie czy uzyskany tak wirus posiada przynajmniej jedną ze zdefiniowanych powyżej, pożądanych właściwości biologicznych, przy czym powyższe etapy mogą być dowolnie powtarzane, aż do momentu otrzymania wirusa o pożądanych cechach replikacyjnych. Wynalazek dotyczy ponadto wirusów otrzymanych w wyniku metody według niniejszego wynalazku. Sposoby określania pożądanych właściwości biologicznych zostały wyjaśnione w kolejnych częściach niniejszego opisu. Stosując wspomnianą metodę Wynalazcy zidentyfikowali i wyizolowali w kilku etapach oczyszczania klonu szczep stanowiący przykładową realizację wynalazku, poczynając od pasażu izolatu MVA 575 (MVA 575). Otrzymany w ten sposób nowy szczep odpowiada wspomnianemu uprzednio szczepowi o numerze przyjęcia ECACC V Właściwości wzrostu wirusów krowianki stanowiących przykładową realizację niniejszego wynalazku, szczególnie wzrost MVA-BN, wskazuje, że szczepy te są znacznie lepsze od jakichkolwiek innych, dotychczas scharakteryzowanych izolatów MVA pod względem atenuacji w ludzkich liniach komórkowych i braku replikacji in vivo. Szczepy te są, zatem, idealnymi kandydatami do rozwijania bezpiecznych produktów, takich jak szczepionki lub leki, co zostanie opisane poniżej w dalszej części wynalazku. W jednej z realizacji, wirus stanowiący przykładową realizację wynalazku, w szczególności MVA-BN i jego pochodne, zastosowany został jako szczepionka przeciwko chorobie wywołanej przez wirusa ospy ludzkiej, takiej jak ospa. W kolejnej realizacji, wirus stanowiący przykładową realizację wynalazku może być rekombinowany, tj., może ekspresjonować geny heterologiczne, jak, np., antygeny lub epitopy heterologiczne dla wirusa, a zatem może być użyteczny jako szczepionka do indukcji odpowiedzi immunologicznej przeciwko heterologicznym antygenom lub epitopom. Termin odpowiedź immunologiczna oznacza reakcję układu immunologicznego, na obcą substancję lub mikroorganizm, który dostał się do organizmu. Zgodnie z definicją, odpowiedź immunologiczna jest podzielona na reakcję swoistą i nieswoistą, jednakże obie reakcje są ściśle powiązane. Nieswoista odpowiedź immunologiczna jest natychmiastową obroną przeciwko szerokiemu spektrum obcych substancji i czynników infekcyjnych. Swoista odpowiedź immunologiczna jest obroną wzbudzoną po fazie lag, gdy organizm jest zainfekowany substancją po raz pierwszy. Swoista odpowiedź immunologiczna jest bardzo skuteczna i odpowiada za fakt ochrony przed specyficzną infekcją osobnika po przebyciu swoistej infekcji. Zatem, druga infekcja tym samym lub bardzo podobnym czynnikiem infekcyjnym, powoduje znacznie bardziej łagodne symptomy lub ich całkowity brak, ze względu na już istniejącą wcześniej odporność na ten czynnik. Taka odpowiednio, odporność i pamięć immunologiczna pozostaje przez dłuższy czas, w pewnych przypadkach nawet przez całe życie. Zgodnie z powyższym, indukcja pamięci immunologicznej może być użyta i zastosowana w szczepieniach. Układ immunologiczny oznacza złożony organ, włączony w odpowiedź organizmu przeciwko obcym substancjom i mikroorganizmom. Układ immunologiczny obejmuje część komórkową, zawierającą kilka typów komórek, takich jak, np., limfocyty i inne komórki pochodzące z komórek białych krwinek oraz humoralną część, zawierającą małe peptydy i czynniki dopełniacza. Szczepienie oznacza, że organizm jest wzbudzany czynnikiem infekcyjnym, np., w atenuowanej lub inaktywowanej postaci wspomnianego czynnika infekcyjnego, w celu indukcji odporności swoistej.

9 PL B1 9 Termin szczepienie odnosi się również do wzbudzenia organizmu rekombinowanymi wirusami krowianki według niniejszego wynalazku, w szczególności rekombinowanym MVA-BN i jego pochodnymi, ekspresjonującymi antygeny lub epitopy, heterologiczne dla wirusa. Przykłady takich epitopów podano w pozostałej części opisu, obejmują one, np., epitopy z białek pochodzących od innych wirusów, takich jak wirus Dengue, wirusa zapalenia wątroby C, HIV lub epitopów pochodzących z białek włączonych w rozwój guzów i nowotworów. Po podaniu rekombinowanego wirusa krowianki, w organizmie ekspresjonowane są epitopy prezentowane układowi immunologicznemu i może być indukowana swoista odpowiedź immunologiczna przeciwko tym epitopom. Organizm, zatem, jest immunizowany przeciwko czynnikowi/białku zawierającemu kodowany przez rekombinowany wirus krowianki epitop. Odporność oznacza częściową lub całkowitą ochronę organizmu przeciwko chorobie wywołanej przez czynnik infekcyjny, uzyskaną poprzez skuteczną eliminację postępującej infekcji wywołanej przez wspomniany czynnik infekcyjny lub jego charakterystyczną część. Odporność opiera się na istnieniu, indukcji i aktywacji wyspecjalizowanych komórek układu immunologicznego. Jak wspomniano wyżej, w jednej z realizacji wynalazku, rekombinowane wirusy stanowiącego przykładową realizację wynalazku, w szczególności rekombinowany MVA-BN i jego pochodne, zawierają przynajmniej jedną heterologiczną sekwencję kwasu nukleinowego. Termin heterologiczny stosowany jest tu dla jakiejkolwiek kombinacji sekwencji kwasu nukleinowego, która nie występuje w wirusie w naturze. Tego typu wirus jest również zwany wirusem rekombinowanym. Zgodnie z kolejną realizacją niniejszego wynalazku, sekwencje heterologiczne są korzystnie epitopami antygenów, wybranymi z jakiegokolwiek źródła innego niż krowianka. Najkorzystniej, wspomniany rekombinowany wirus ekspresjonuje jeden lub więcej antygenowych epitopów z Plasmodium falciparum, Mycobacteria, wirusa grypy, z wirusów wybranych z rodziny Flavivirus, Paramyxovirus, Hepatitis - wirusów opryszczki, ludzkiego wirusa braku odporności lub z wirusów powodujących gorączkę krwotoczną, takich jak Hantavirus lub Filovirus, tj., wirus Ebola lub Marburg. Według jeszcze innej realizacji, lecz również w nawiązaniu do wspomnianej wyżej selekcji epitopów antygenowych, sekwencje heterologiczne mogą zostać wybrane z innego źródła wirusów ospy lub krowianki. Takie sekwencje wirusowe mogą być zastosowane do modyfikacji spektrum gospodarza lub immunogenności wirusa. W innej realizacji wirus według wynalazku może kodować heterologiczny gen/kwas nukleinowy ekspresjonujący składnik terapeutyczny. Składnik terapeutyczny kodowany przez heterologiczny kwas nukleinowy w wirusie może być, np., terapeutycznym kwasem nukleinowym, takim jak antysensowny kwas nukleinowy lub peptyd lub białko o pożądanej aktywności biologicznej. Według kolejnej, korzystnej realizacji, ekspresja sekwencji heterologicznego kwasu nukleinowego jest korzystnie, lecz nie wyłącznie, pod kontrolą transkrypcyjną promotora wirusa ospy, korzystniej, promotora wirusa krowianki. Zgodnie z jeszcze inną realizacją, insercja sekwencji heterologicznego kwasu nukleinowego jest dokonywana korzystnie w nieistotnym regionie genomu wirusa. W innej realizacji wynalazku, sekwencja heterologicznego kwasu nukleinowego wstawiana jest w występującym naturalnie miejscu delecji genomu wirusa MVA (ujawnionym w PCT/EP96/02926). Sposoby insercji sekwencji heterologicznych do genomu wirusa ospy znane są specjalistom w dziedzinie. Według kolejnej, korzystnej realizacji, wynalazek dotyczy również genomu wirusa, jego rekombinantów lub części funkcjonalnych. Takie sekwencje wirusowe mogą być użyte do identyfikacji lub izolacji wirusa lub jego rekombinantów, np., poprzez zastosowane PCR, technik hybrydyzacyjnych lub analizy ELISA. Ponadto, takie sekwencje wirusowe mogą być ekspresjonowane z wektora ekspresji w celu uzyskania kodowanych białek lub peptydów, które następnie mogą uzupełniać mutanty delecyjne wirusa, nie posiadające sekwencji wirusowej zawartej w wektorze ekspresji. Rekombinowany wirus według niniejszego wynalazku może być wykorzystany do wprowadzenia sekwencji heterologicznego kwasu nukleinowego do komórki docelowej, wspomniana sekwencja może być homologiczna lub heterologiczną dla komórki docelowej. Wprowadzenie sekwencji heterologicznego kwasu nukleinowego do komórki docelowej może mieć na celu uzyskanie heterologicznych peptydów lub polipeptydów i/lub całkowitych wirusów kodowanych przez tą sekwencję in vitro. Sposób ten obejmuje infekcję komórki gospodarza rekombinowanym MVA, hodowlę zainfekowanych komórek gospodarza w odpowiednich warunkach oraz izolację i/lub wzbogacenie peptydu, białka i/lub wirusa wyprodukowanego przez wspomniane komórki gospodarza. Ponadto, sposób wprowadzenia homologicznej lub heterologicznej sekwencji do komórek może być zastosowany w terapii in vitro i korzystnie in vivo. W przypadku terapii in vitro, wyizolowane

10 10 PL B1 komórki, które wcześniej (ex vivo) zainfekowano wirusem, podawane są żywemu zwierzęciu w celu wywołania odpowiedzi immunologicznej. W terapii in vivo, wirus lub jego rekombinanty są podawane bezpośrednio do organizmu żywego zwierzęcia w celu wywołania odpowiedzi immunologicznej. W tym przypadku, komórki otaczające miejsce inokulacji są bezpośrednio infekowane in vivo przez wirusa lub jego rekombinantów według wynalazku. Ze względu na to, że wirus według wynalazku ma silnie ograniczony wzrost w komórkach ludzkich i małpich, a zatem jest silnie atenuowany, jest idealny do traktowania nim szerokiego spektrum ssaków, włączając ludzi. Zatem, niniejszy wynalazek obejmuje również kompozycję farmaceutyczną i szczepionkę, np., do indukcji odpowiedzi immunologicznej w żywym organizmie zwierzęcia, włączając ludzi. Wirus według wynalazku jest ponadto bezpieczny w zastosowaniu w jakiejkolwiek innej terapii genowej. Kompozycja farmaceutyczna może ogólnie obejmować jeden lub więcej farmaceutycznie dopuszczalnych i/lub zalecanych nośników, dodatków, antybiotyków, konserwantów, adiuwantów, rozcieńczalników i/lub substancji stabilizujących. Taką substancją może być woda, solanka, glicerol, etanol, czynniki nawilżające lub emulsyfikatory, substancje buforujące ph itp. Odpowiednie nośniki są zazwyczaj duże, wolno metabolizowane cząsteczki, tak jak białka, polisacharydy, kwasy polimlekowe, kwasy poliglikolowe, polimerowe aminokwasy, kopolimery aminokwasowe, agregaty lipidowe itp. W celu przygotowania szczepionki, wirus lub jego rekombinanty według wynalazku są zamieniane w fizjologicznie przyswajaną postać. Może to być dokonane w oparciu o doświadczenie w otrzymywaniu szczepionek wirusa ospy, stosowanych w szczepieniu przeciwko ospie (wg opisu Stickl, H i wsp. [1974] Dtsch.med.Wschr. 99, ). Na przykład, oczyszczony wirus przechowywany jest w -80 C, o mianie 5x10 8 TCID 50 /ml, przygotowany w około 10 mm Tris, 140 mm NaCl, w ph 7.4. Do przygotowania dawki szczepionki, np., cząsteczek wirusa jest liofilizowanych w 100 ml buforowanej fosforanem solanki (PBS), w obecności 2% peptonu i 1% ludzkiej albuminy w ampułkach, korzystnie w szklanych ampułkach. Alternatywnie, dawka szczepionki może być otrzymana w wyniku stopniowego zamrażania-suszenia wirusa w formulacji. Formulacja ta może zawierać dodatkowe składniki, takie jak mannitol, dekstran, cukier, glicynę, laktozę lub poliwinylopirolidon lub inne dodatki, takie jak przeciwutleniacze lub obojętny gaz, stabilizatory lub białka rekombinowane (np., ludzka albumina krwi), odpowiednie do podawania in vivo. Szklane ampułki są następnie zamykane i mogą być przechowywane między 4 C a temperaturą pokojową przez kilka miesięcy. Jednakże, dopóki nie ma żadnej potrzeby, ampułka przechowywana jest korzystnie w temperaturze poniżej -20 C. Do szczepienia lub leczenia, liofilizat może być rozpuszczony w 0.1 do 0.5 ml wodnego roztworu, korzystnie roztworu soli fizjologicznej lub buforze Tris i podawany układowo lub miejscowo, tj., pozajelitowe, domięśniowo lub jakąkolwiek inną drogą podawania znaną specjalistom w dziedzinie. Sposób podawania, dawka i ilość podawania może być optymalnie dobrana przez specjalistów w dziedzinie, w powszechnie znany sposób. Ponadto, według kolejnej realizacji, wirus według niniejszego wynalazku jest szczególnie użyteczny w indukowaniu odpowiedzi immunologicznej u zwierząt o upośledzonej odporności, np., małp (CD4<400 l krwi) zainfekowanych SIV lub ludzi z niedoborem odporności. Termin upośledzenie (niedobór) odporności oznacza stan układu immunologicznego osobnika, wykazujący jedynie niepełną odpowiedź immunologiczną lub posiadający obniżoną skuteczność obrony przeciwko czynnikom infekcyjnym. Bardzo interesujące jest odkrycie, według innej realizacji, że wirus według niniejszego wynalazku może powodować wzmocnienie odpowiedzi immunologicznej u zwierząt lub ludzi o upośledzonej odporności (z niedoborem), nawet w obecności istniejącej wcześniej u tych zwierząt lub ludzi odporności na wirusy ospy. Szczególnie interesujące jest, że wirus według niniejszego wynalazku może wzmacniać odpowiedź immunologiczną również u zwierząt lub ludzi przechodzących terapię przeciwwirusową, np., terapię przeciwretrowirusową. Terapia antywirusowa obejmuje działanie terapeutyczne mające na celu wyeliminowanie lub zahamowanie infekcji wirusowej, włączając, np., (i) zastosowanie analogów nukleotydów, (ii) zastosowanie inhibitorów wirusowej aktywności enzymatycznej lub składania wirusa lub (iii) zastosowanie cytokin wpływających na odpowiedź immunologiczną gospodarza. Według innej realizacji, szczepionka jest szczególnie, lecz nie wyłącznie, możliwa do zastosowania w dziedzinie weterynarii, np., do immunizacji przeciwko infekcji ospy zwierzęcej. U małych zwierząt, inokulacja w celu immunizacji jest dokonywana korzystnie pozajelitowe lub nosowo, podczas gdy u większych zwierząt lub ludzi preferowane jest szczepienie podskórnie, domięśniowe lub ustne.

11 PL B1 11 Wynalazcy odkryli, że już porcja szczepionki zawierająca skuteczną dawkę jedynie 10 2 TCID 50 (dawka infekcyjna hodowli tkankowej) wirusa według wynalazku, jest wystarczająca do indukcji pełnej odporności przeciwko infekcji dzikiego typu wirusa krowianki u myszy. Jest to szczególnie zaskakujące ze względu na to, że można było oczekiwać, że tak silnie atenuowany wirus według wynalazku, mógłby wywołać negatywny skutek, a zatem, obniżyć immunogenność. Takie oczekiwanie oparte było na przekonaniu, że do indukcji odpowiedzi immunologicznej epitopy antygenne muszą być prezentowane układowi immunologicznemu w wystarczającej ilości. Wirus silnie atenuowany, a zatem, nie replikujący, może jedynie prezentować niewielką ilość antygennych epitopów, tzn., tyle ile sam zawiera. Ta ilość antygenu, przenoszona przez cząsteczki wirusa, nie była uważana za wystarczającą do indukcji silnej odpowiedzi immunologicznej. Jednakże, wirus według wynalazku, stymuluje nawet przy bardzo niskiej skutecznej dawce jedynie 10 2 TCID 50 silną i ochronną odpowiedź immunologiczną w modelu infekcji myszy/krowianką. Wirus według niniejszego wynalazku wykazuje, zatem nieoczekiwaną, a nawet zwiększoną immunogenność w porównaniu z innymi, scharakteryzowanymi dotychczas szczepami MVA. Tak silna immunogenność czyni wirus według wynalazku i jakąkolwiek, pochodzącą od niego szczepionkę, szczególnie użytecznymi do zastosowania u zwierząt lub ludzi o upośledzonej odporności. Według jeszcze innej realizacji wynalazku, wirus zastosowany jest jako adiuwant. W niniejszym opisie adiuwant określa wzmacniacz swoistej odpowiedzi immunologicznej w szczepionkach. Zastosowanie wirusa jako adiuwanta oznacza włączenie wirusa do istniejącej wcześniej szczepionki w celu dodatkowej stymulacji układu immunologicznego pacjenta otrzymującego szczepionkę. Efekt immunizacji wywołanej przez epitop antygenowy w większości szczepionek jest często wzmacniany poprzez dodatek tzw. adiuwanta. Adiuwant współstymuluje układ immunologiczny poprzez wywołanie silniejszej swoistej reakcji immunologicznej przeciwko epitopowi antygennemu szczepionki. Stymulacja ta może być regulowana przez czynniki nieswoistego układu immunologicznego, takie jak interferony i interleukiny. W związku z tym, w dalszej realizacji wynalazku, wirus stosowany jest wobec ssaków, włączając ludzi do aktywacji, podtrzymywania lub zahamowania układu immunologicznego, i korzystnie, do aktywacji odpowiedzi immunologicznej przeciwko jakiemukolwiek antygennemu czynnikowi determinującemu. Wirus również może być użyty do wspomagania układu immunologicznego w sytuacji zwiększonej wrażliwości na infekcje, takiej jak w przypadku stresu. Wirus zastosowany jako adiuwant może być wirusem nierekombinowanym, tj., wirusem, który nie zawiera heterologicznego DNA w swoim genomie. Przykładem tego typu wirusa jest MVA-BN. Alternatywnie, wirus użyty jako adiuwant jest wirusem rekombinowanym, posiadającym w swoim genomie sekwencje heterologicznego DNA, które nie istnieją naturalnie obecne w genomie wirusa. W celu zastosowania jako adiuwant, rekombinowany wirusowy DNA wirusa zawiera korzystnie i ekspresjonuje geny, które kodują stymulujące odporność peptydy lub białka, takie jak interleukiny. Według kolejnej realizacji, korzystnie, wirus stosowany jako adiuwant lub dodawany do innej szczepionki jest inaktywowany. Inaktywacja wirusa może być uzyskana, jak wiadomo specjalistom, np. w wyniku ogrzewania lub oddziaływania odczynników chemicznych. Korzystnie, wirus jest inaktywowany przez propriolakton. Zgodnie z tą realizacją wynalazku, inaktywowany wirus może być dodany do szczepionek przeciwko licznym infekcjom lub chorobom proliferacyjnym w celu wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej pacjenta wobec tej choroby. Krótki opis Figur Figura 1: Kinetyka wzrostu różnych szczepów MVA w różnych liniach komórkowych. W części A) wyniki zgrupowano według badanych szczepów MVA, natomiast w części B) wyniki zgrupowano według testowanych linii komórkowych. B) Ilość wirusa uzyskanego z linii komórkowej po czterech dniach (D4) hodowli określano stosując metodę płytkową (analizę łysinek) i wyrażano jako stosunek otrzymanego po 4 dniach wirusa do wyjściowego inokulum w pierwszym dniu (D1). Figura 2: Zapewnienie ochrony przed infekcją letalną krowianka w następstwie szczepienia MVA-BN lub MVA 575. Ochronę mierzono poprzez redukcję miana w jajnikach, określaną 4 dni po zainfekowaniu, przy użyciu standardowej metody płytkowej. Figura 3: Indukcja CTL i ochrona przed infekcją grypy przy użyciu różnych systemów szczepienia podstawowego-przypominającego. 3A: Indukcja odpowiedzi CTL na 4 różne epitopy H-2 d w następstwie szczepienia różnymi kombinacjami szczepionek DNA lub MVA-BN, kodujących politop murynowy. Myszy BALB/c (5 na grupę) szczepiono DNA (domięśniowo) lub MVA-BN (podskórnie) i trzy tygodnie podawano szczepienie przy-

12 12 PL B1 pominające. Odpowiedzi CTL na 4 różne epitopy, kodowane przez szczepionki (TYQRTRALV, grypa; SYIPSAEKI, P.berghei; YPHFMPTNL, Cytomegalowirus; RPQASGVYM, LCV) określono stosując analizę ELISPOT 2 tygodnie po szczepieniach przypominających. 3B: Indukcja odpowiedzi CTL na 4 różne epitopy następujących szczepionek z różnymi kombinacjami DNA lub szczepionek MVA-BN kodujących polipeptyd murynowy. Myszy BALB/c (5 na grupę) zaszczepiano DNA (domięśniowo) lub MVA-BN (dożylnie) i poddawano szczepieniom przypominającym trzy tygodnie później. Odpowiedzi CTL na 4 różne epitopy kodowane przez szczepionki (TYQR- TRALV, grypa; SYIPSAEKI, P.berghei; YPHFMPTNL, Cytomegalowirus; RPQASGVYM, LCV) określono stosując analizę ELISPOT 2 tygodnie po szczepieniach przypominających. 3C: Częstość peptydu i swoistych wobec MVA komórek T, po homologicznym szczepieniu podstawowym/przypominającym przy użyciu optymalnej dawki (1x 10 8 TCID 50 ) rekombinowanego MVA- -BN, podanego podskórnie. Grupy 8 myszy zaszczepiano w dwóch seriach kombinacji, jak wskazano na Figurze. Dwa tygodnie po końcowym szczepieniu mierzono ilość splenocytów swoistych dla peptydu, stosując analizę IFN-gamma ELISPOT. Słupki oznaczają średnią liczbę swoistych punktów plus/minus standardowe odchylenie od średniej. Figura 4: Infekcja SIV małp zaszczepionych MVA-BN nef lub MVA-BN. Figura 5: Przeżywalność zaszczepionych małp w następstwie infekcji SIV. Figura 6: Miano przeciwciał surowicy krwi małp dla MVA-BN. Miano przeciwciał dla każdego zwierzęcia przedstawiono za pomocą różnych kształtów, natomiast miano średnie zilustrowano jako pełne romby. Figura 7: Poziom SIV u małp z obniżoną odpornością (CD<400 ml krwi) w następstwie szczepienia MVA-BN kodującym tat. Małpy otrzymały wcześniej trzy szczepienia MVA-BN lub MVA-BN nef (0, 8, 16 tydzień) i zostały zainfekowane patogennym izolatem SIV (22 tydzień). W 100, 102 i 106 tygodniu (wskazane strzałkami) małpy zaszczepiano MVA-BN tat. Figura 8: Poziom SIV u małp poddanych terapii przeciwretrowirusowej i szczepieniom leczniczym z użyciem MVA-BN. Trzy grupy małp (n=6) infekowano SIV i traktowano codziennie PMPA (wskazano linią czarną). W 10 i 16 tygodniu zwierzęta szczepiono (wskazano strzałkami) mieszaniną rekombinowanego MVA lub roztworem soli fizjologicznej. Figura 9: Odpowiedź humoralną powstała na SIV w następstwie infekcji i szczepień rekombinowanym MVA. Trzy grupy (n=6) małp infekowano patogennym izolatem SIV (tydzień 0), a następnie stosowano terapię antyretrowirusową (PMPA; wskazano pogrubioną linią). Małpy zaszczepiano mieszaniną rekombinowanego MVA lub roztworem soli fizjologicznej w 10 i 16 tygodniu. Przeciwciała na SIV określano stosując lizaty zainfekowanych komórek T jako antygen w standardowym teście ELISA. Figura 10: Odpowiedź humoralną powstała na MVA u zainfekowanych SIV małp poddanych terapii przeciwretrowirusowej. Trzy grupy (n=6) małp infekowano patogennym izolatem SIV (tydzień 0) a następnie stosowano terapię przeciwretrowirusową (PMPA; wskazano pogrubioną linią). Małpy zaszczepiano mieszaniną rekombinowanego MVA lub roztworem soli fizjologicznej w 10 i 16 tygodniu. Przeciwciała na MVA określano stosując standardowy test ELISA dla MVA. Figura 11: Indukcja przeciwciał dla MVA w następstwie szczepienia myszy różnymi szczepionkami przeciwko ospie. Poziom przeciwciał wobec MVA powstałych w wyniku szczepienia MVA-BN (tydzień 0 i 4), porównywano z konwencjonalnymi szczepami krowianki, Elstree i Wyeth, podanymi poprzez ogon i uśmiercenie (tydzień 0), MVA 572 (tydzień 0 14) oraz MVA-BN i MVA 572 podanymi jako szczepionka pre-elstree. MVA 572 został zdeponowany w Europejskiej Kolekcji Zwierzęcych Kultur Komórkowych jako ECACC V Miana określano stosując ELISA i wyliczano metodą regresji liniowej przy użyciu liniowej części wykresu i definiowano jako rozcieńczenie dające optymalną gęstość 0.3. *MVA-BN:MVA-BN jest znacząco (p>0.05) różne od MVA 572 : MVA 572. Przykłady Następujące przykłady ilustrują niniejszy wynalazek. Dla specjalistów w dziedzinie pozostaje zrozumiałe, że załączone przykłady w żaden sposób nie ograniczają do wymienionych w opisie zastosowań sposobów według niniejszego wynalazku. P r z y k ł a d 1 Kinetyka wzrostu nowego szczepu MVA w wybranych liniach komórkowych oraz replikacja In vivo (i) Kinetyka wzrostu w liniach komórkowych W celu scharakteryzowania kinetyki wzrostu nowo wyizolowanego szczepu według niniejszego wynalazku (następnie nazywanego MVA-BN), porównywano kinetykę wzrostu tego nowo wyizolowanego szczepu z kinetyką innych, wcześniej już scharakteryzowanych, szczepów MVA.