(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP03/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP03/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO04/ (13) B1 (51) Int.Cl. C07K 14/03 ( ) A61K 39/12 ( ) C07K 14/18 ( ) C12N 5/10 ( ) C12N 5/07 ( ) A61K 39/29 ( ) (54) Koński herpeswirus (EHV), zastosowanie EHV, sposób otrzymywania rekombinowanego EHV i preparat szczepionki oraz linia komórkowa (30) Pierwszeństwo: , DE, (73) Uprawniony z patentu: Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH, Ingelheim am Rhein, DE (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 22/05 (72) Twórca(y) wynalazku: ANTONIE NEUBAUER, Monachium, DE CHRISTINA ZIEGLER, Monachium, DE (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 04/11 (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Mirosława Ważyńska PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Wynalazek dotyczy zdrowia zwierząt, a w szczególności końskich herpeswirusów (EHV), w których nieobecny jest gen kodujący białko gm i, które są wolne od elementów heterologicznych. Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie EHV, preparat szczepionki oraz linia komórkowa do profilaktyki i leczenia infekcji związanych z EHV. Wynalazek dotyczy również kombinacji wirusów EHV-1 i EHV-4, w których nieobecny jest gen kodujący białko gm i, które są wolne od elementów heterologicznych. Koński herpeswirus 1 (EHV-1), przedstawiciel Alphaherpesvirinae, jest główną przyczyną poronień indukowanych wirusami u koni i powoduje choroby układu oddechowego i choroby neurologiczne. Koński herpeswirus 4 (EHV-4) może również indukować objawy ze strony układu oddechowego, poronienia bądź zaburzenia neurologiczne. Pełna sekwencja DNA obu gatunków (EHV-1: szczep Ab4p; EHV-4: szczep NS80567) została już określona (Telford, E.A.R. i in., 1992; Telford, E. A.R. i in., 1998). Jednakże, tylko kilka genów i produktów genowych scharakteryzowano w odniesieniu do ich związku z właściwościami zjadliwości i immunogenności EHV. Glikoproteiny herpeswirusowe są w bardzo znaczącym stopniu zaangażowane we wczesnych etapach infekcji, w uwalnianiu wirionów z komórki i w bezpośrednim, komórka do komórki, rozprzestrzenianiu wirionów przez fuzje sąsiadujących komórek. Dotychczas, zidentyfikowano 11 glikoprotein kodowanych przez wirusa opryszczki pospolitej typu 1 (HSV-1) i oznaczono je, jako gb, gc, gd, ge, gg, gh, gl, gj, gk, gl i gm. Mutanty HSV-1 pozbawione gc, ge, gg, gl, gj i gm są zdolne do życia, wskazując, że geny te są zbędne do replikacji w hodowanych komórkach. Porównanie sekwencji nukleotydowych HSV-1 i końskiego herpeswirusa 1 ujawniło, że wszystkie znane glikoproteiny HSV-1 są zachowane w EHV-1. Zgodnie z aktualną nomenklaturą, glikoproteiny te oznacza się nazwami ich homologów HSV-1. Wiadomo, że gc, ge i gl EHV-1 nie są zasadnicze dla wzrostu w hodowlach komórkowych, podczas gdy gb i gd są zasadnicze dla wzrostu wirusa w hodowanych komórkach. Udział innych glikoprotein EHV-1 w replikacji w hodowanych komórkach nie jest znany (Flowers, C.C. i in., 1992). Analizy: transkrypcyjna i białkowa wykazały, że białka gb, gc, gd, gg, gh i gk ulegają ekspresji w komórkach zainfekowanych EHV-1. Glikoproteina gm (kodowana przez gen UL10 [Baines, J.D. i in., 1991; Baines, J.D. i in., 1993]) jest jedyną niezasadniczą glikoproteina, co do której donosi się, że jest zachowana we wszystkich podrodzinach herpeswirusowych i opisano ją dla ludzkiego i mysiego wirusa cytomegalii, przedstawicieli Gammaherpesvirinae EHV-2, herpeswirusa Saimiri oraz wirusa Epsteina-Barr. Podobnie jak wiele glikoprotein herpeswirusowych, gm HSV-1 występuje w wirionach i błonach zainfekowanych komórek. Mutanty HSV-1 pozbawione jedynie gm rosną w układach hodowli komórkowych, do mian zmniejszonych w przybliżeniu 10-krotnie w porównaniu z mianami osiąganymi przez wirusa typu dzikiego i wykazują zmniejszoną zjadliwość w modelu mysim (Baines, J.D. i in., 1991; MacLean, C. A. i in., 1993). Homolog gm EHV-1 (gp21/22a, określany odtąd gm EHV-1) po raz pierwszy został opisany przez Allena i Yeargan (Allen, G.P. i in., 1987) i wykazano, że jest on głównym składnikiem otoczki wirusowej. Dalsze badania ujawniły, że gen 52, gen homologiczny do UL10 HSV-1, koduje 450-aminokwasowy polipeptyd gm EHV-1 (Pilling, A. i in., 1994; Telford, E.A.R. i in., 1992). gm EHV-1 stanowi złożone hydrofobowe białko, które zawiera osiem przewidzianych domen transbłonowych i, jak wiadomo, jest obecne w zainfekowanych komórkach i w oczyszczonych wirionach tak jak białko M r (Pilling, A., 1994; Telford, E.A.R. i in., 1992). Do kontrolowania infekcji EHV-1, stosowano dwa różne podejścia. Po pierwsze, opracowano modyfikowane żywe szczepionki (MLVs) obejmujące szczep RacH (Mayr, A. i in., 1968; Hübert, P. H. i in., 1996), który jest szeroko stosowany w Europie i w Stanach Zjednoczonych Ameryki. Po drugie, inaktywowane szczepionki i szczepionki podjednostkowe oparte na uzyskiwanych drogą rekombinacyjnej ekspresji glikoproteinach wirusowych, takich jak glikoproteiny (g) B, C, D i H, które indukują częściową ochronę przed następnie wywoływaną infekcją EHV-1 w modelu mysim. Szczepionki podjednostkowe, zawierające glikoproteiny np. gb, gc, gd i gh jedynie słabo chronią przed ponowną infekcją (Awan i in., 1990, Osterrieder i in., 1995, Tewari i in., 1994, Stokes i in., 1996). Przedmiotem wynalazku jest koński herpeswirus (EHV), w którym nieobecne jest białko gm, a w którym EHV jest wolny od elementów heterologicznych. Korzystnie usunięto gen kodujący dla białka gm. EHV otrzymuje się go sposobem obejmującym etapy: a) izolowania EHV typu dzikiego, b) przygotowywania plazmidu kodującego gen gm EHV, ewentualnie z sekwencjami flankującymi, c) wytwarzania komplementującej linii komórkowej, w której zachodzi ekspresja gm lub jego części,

3 PL B1 3 d) przygotowywania wirusa EH zawierającego wstawkę kasetki kodującej GFP w jego sekwencji kodującej gm przez ko-transfekcję komplementującej linii komórkowej z etapu b) kwasem nukleinowym EHV i plazmidem kodującym gm, który jest przerwany wstawką kasetki kodującej GFP, e) delecji kasetki kodującej GFP i f) selekcji pod względem klonów EHV, z których z powodzeniem usunięto kasetkę kodującą GFP. Korzystnie EHV według wynalazku stanowi EHV-1. W EHV-1 korzystnie usunięto bp otwartej ramki odczytu gm lub usunięto całą sekwencję kodującą gm, za wyjątkiem bp sekwencji kodującej część C-końcową i za wyjątkiem bp sekwencji kodującej część N-końcową. W EHV-1 według wynalazku korzystnie usunięto nukleotydy do sekwencji kodującej gm, przy czym pozycje nukleotydów odpowiadają pozycjom nukleotydów sekwencji EHV według Telforda (1992) lub usunięto nukleotydy do sekwencji kodującej gm, przy czym pozycje nukleotydów odpowiadają pozycjom nukleotydów sekwencji EHV według Telforda (1992) lub usunięto całą sekwencję kodującą gm, za wyjątkiem 184 bp sekwencji kodującej część C-końcową i za wyjątkiem 209 bp sekwencji kodującej część N-końcową lub usunięto nukleotydy do sekwencji kodującej gm, przy czym pozycje nukleotydów odpowiadają pozycjom nukleotydów sekwencji EHV według Telforda (1992). Korzystnie EHV-1 jest wariantem rekombinacyjnym opartym na szczepie RacH EHV-1. EHV-1 stanowi korzystnie izolat HAgM-w, zdeponowany w ECACC/CAMR 16 października 2002 roku pod numerem dostępu Wariantem EHV jest też EHV-4. Korzystnie w EHV-4 usunięto bp otwartej ramki odczytu gm lub usunięto całą sekwencję kodującą gm, za wyjątkiem 0-50 bp sekwencji kodującej część C-końcową i za wyjątkiem bp sekwencji kodującej część N-końcową lub usunięto nukleotydy do sekwencji kodującej gm, przy czym pozycje nukleotydów odpowiadają pozycjom nukleotydów sekwencji EHV według Telforda (1998) lub usunięto nukleotydy do sekwencji kodującej gm, przy czym pozycje nukleotydów odpowiadają pozycjom nukleotydów sekwencji EHV według Telforda (1998) lub. usunięto całą sekwencję kodującą gm, za wyjątkiem 34 bp sekwencji kodującej część C-końcową i za wyjątkiem 209 bp sekwencji kodującej część N-końcową lub usunięto nukleotydy do sekwencji kodującej gm, przy czym pozycje nukleotydów odpowiadają pozycjom nukleotydów sekwencji EHV według Telforda (1998). EHV-4 korzystnie stanowi izolat E4AgM-w, zdeponowany w ECACC/CAMR 14 stycznia 2003 roku pod numerem dostępu Przedmiotem wynalazku jest także kwas nukleinowy, który koduje EHV według wynalazku. Innym przedmiotem wynalazku jest preparat szczepionki, który zawiera EHV lub co najmniej jednego EHV-1 i jednego EHV-4. Preparat szczepionki zawiera korzystnie kwas nukleinowy. Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie EHV lub co najmniej jednego EHV- i jednego EHV-4 i kwasu nukleinowego do wytwarzania leku do profilaktyki i/lub leczenia infekcji związanych z EHV. Przedmiotem wynalazku jest również sposób otrzymywania rekombinowanego EHV obejmujący etapy a) izolowania EHV typu dzikiego, b) przygotowywania plazmidu kodującego gen gm EHV, ewentualnie z sekwencjami flankującymi, c) wytwarzania komplementującej linii komórkowej, w której zachodzi ekspresja gm lub jego części, d) przygotowywania wirusa EH zawierającego wstawkę kasetki kodującej GFP w jego sekwencji kodującej gm przez kotransfekcję komplementującej linii komórkowej z etapu b) kwasem nukleinowym EHV i plazmidem kodującym gm, który jest przerwany wstawką kasetki kodującej GFP, e) delecji kasetki kodującej GFP i f) selekcji pod względem klonów EHV, z których z powodzeniem usunięto kasetkę kodującą GFP. Poza tym, przedmiotem wynalazku jest też linia komórkowa komplementująca gm linia VERO GM, zdeponowana w ECACC/CAMR 28 stycznia 2003 roku pod numerem dostępu Technicznym problemem leżącym u podstaw tego wynalazku było dostarczenie ulepszonych szczepionek, które chronią lepiej przed infekcją EHV niż wcześniej znane szczepionki. Legenda do figur Fig. 1: Wytwarzanie gm negatywnego wirusa RacH EHV-1 bez obcych sekwencji (HΔgM-w)

4 4 PL B1 Figura przedstawia mapę wirusów i plazmidów stosowanych do konstruowania HΔgM-w. Pierwszą generację wirusa HΔgM skonstruowano wcześniej przez wstawienie albo kasetki ekspresyjnej lacz Escherichia coli (HΔgM-lacZ), albo kasetki ekspresyjnej białka o zielonej fluorescencji (GFP) (HΔgM-GFP). Przedstawiono mapę BamHI szczepu RacH EHV-1 (A) i fragment BamHI-HindIII zawierający gm-orf powiększono pokazując organizację genomową regionu (B). gm-negatywny wirus, HΔgM-GFP zawiera kasetkę ekspresyjną GFP, zastępującą główną część genu gm EHV-1. Przedstawiono (C) sondę specyficzną wobec GFP, którą stosowano w blottach Souterna. Plazmid BH3.1 zawiera będący przedmiotem zainteresowania fragment BamHI-Hindlll EHV-1 i stosowano go do konstruowania plazmidu pxubaxa. Po kotransfekcji DNA HΔgM-GFP z plazmidem pxubaxa otrzymano HΔgM-w (D). Miejsca restrykcyjne: BamHI - B, Hindlll - H, SphI - S, HincII - Hc, Apal - A, Pstl - P. Fig. 2: Blott Southerna wirusa EHV-1 z delecją gm bez obcych sekwencji (HΔgM-w). DNA RacH, HΔgM-GFP i HAgM-w trawiono BamHI, Hindlll lub Pstl i analizowano stosując sondę specyficzną wobec GFP (GFP) lub fragment BamHI-Hindlll pbh3.1 (pbh3.1). Hybrydy DNA wykrywano przez chemoluminescencję stosując CSPD. Wielkości mas cząsteczkowych markerów (Biolabs) podano w kbp na lewym marginesie. Strzałka wskazuje ledwie widoczną specyficzną hybrydę. Fig. 3: Wytwarzanie gm negatywnego wirusa EHV-4 bez obcych sekwencji (E4ΔgM-w) Na tej figurze przedstawiono mapę BamHI szczepu NS80567 EHV-4. Powiększony fragment BamHI-e obejmuje ORF gm i sąsiadujące ORF (A). Przedstawiono konstrukty plazmidów i miejsca przyłączania starterów (B). Plazmid pgm4gfp+ stosowano do wytwarzania E4ΔgM-GFP, EHV-4 pozytywnego pod względem GFP i negatywnego pod względem gm (B,C). Rekombinacja DNA E4ΔgM- -GFP albo z plazmidem pgm4r (B), zawierającym bp sekwencji EHV-4 obejmującej ORF gm, dała w wyniku E4RgM, naprawionego pod względem gm EHV-4 (A), albo z plazmidem pgm4w (B) dała E4ΔgM-w, EHV-4 negatywnego pod względem GFP i gm (D). Miejsca restrykcyjne: BamHI -B, Pstl -P, EcoRI -E, Sali - Sa, Mlul -M, AsnI - As, EcoRV - EV. Fig. 4: Blott Southerna wirusa EHV-4 z delecją gm bez obcych sekwencji (E4ΔgM-w) DNA EHV-4, E4RgM, E4ΔgM-w i E4ΔgM-GFP trawiono, jak wskazano, Pstl, EcoRV lub Hindlll i fragmenty DNA przenoszono metodą blottingu na membranę nylonową. Równoległe membrany poddawano hybrydyzacji albo z sekwencjami specyficznymi wobec GFP, albo z sondą, nazywaną gm3.1, zawierającą sekwencje specyficzne dla EHV-4 wzięte z plazmidu pgm4r (fig. 3). Hybrydy DNA wykrywano przez chemoluminescencję stosując CSPD. Wielkości mas cząsteczkowych markerów (Biolabs) podano w kbp. Fig. 5: Charakterystyka wzrostu wirusa EHV-4 z delecją gm, E4ΔgM-w. Komórki infekowano różnymi (jak wymieniono w ramce) wirusami z MOI wynoszącym 2. Kinetyki wzrostu wirusa przedstawiono, jako miana wirusa określane w supernatantach zainfekowanych komórek (aktywność zewnątrzkomórkowa) lub w zainfekowanych komórkach (aktywność wewnątrzkomórkowa) w odpowiednich wskazanych punktach czasowych. Przedstawiono średnie z dwóch pojedynczych doświadczeń, odchylenia standardowe pokazano, jako słupki błędów. Fig. 6: Wielkości łysinek E4ΔgM-w Komórki Vero lub Vero-gM w 6-studzienkowych płytkach infekowano 50 pfu albo EHV-4, E4RgM, E4ΔgM-GFP albo E4ΔgM-w. Określano maksymalną średnicę 150 odpowiadających łysinek i średnie wielkości łysinek podawano w %, w stosunku do wielkości łysinek typu dzikiego, które przedstawiano, jako 100%. Odchylenia standardowe pokazano, jako słupki błędów (A). Łysinki wybarwiano przez immunofluorescencję pośrednią (skierowane przeciw gd przeciwciało monoklonalne 20C4, 1:1000) w czwartym dniu po zainfekowaniu i analizowano w Axioscope (x 100, Zeiss, Niemcy). Obrazy skanowano i poddawano obróbce cyfrowej (B). Fig. 7: Penetracja wirusa EHV-4 do komórek Vero Penetracja EHV-4, E4RgM, E4ΔgM-w i E4ΔgM-GFP, wytworzonych na niekomplementujących komórkach Vero (A) i na komplementujących komórkach Vero-gM (B), do komórek Vero. W podanych

5 PL B1 5 punktach czasowych określano wydajność penetracji, jako procent liczby łysinek obecnych po traktowaniu cytrynianem w stosunku do liczby łysinek obecnych po traktowaniu kontrolnym. Podano średnie z dwóch niezależnych doświadczeń. Odchylenia standardowe pokazano, jako słupki błędów. Fig. 8: Sekwencje starterów do PCR i położenie produktów amplifikacji w genomie EHV-4. Sekwencje przedstawiające miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne wydrukowane wytłuszczone i wymieniono odpowiednie enzymy. Produkty PCR wstawiono do podanych wektorów otrzymując, jak wskazano, plazmidy pcgm4, pgm4r, pgm4dell i pgm4del2. Położenie fragmentu w obrębie genomu EHV-4 podano w stosunku do sekwencji określonej przez Telforda i in. (1998). Fig. 9: Analiza metodą blottingu Western surowic końskich Lizaty linii komórkowej ccgm i komórek Rkl3, w których zachodzi ekspresja gm EHV-1, ogrzewano albo w ciągu 2 minut w temperaturze 56 C (1,2), albo w ciągu 5 minut w temperaturze 95 C (3) (gm jest wysoce hydrofobowa i wiadomo, że ulega agregacji po gotowaniu, tak więc nie wchodzi do żelu rozdzielającego). Identyczne blotty inkubowano z różnymi surowicami końskimi (1:3000) lub surowicą króliczą skierowaną przeciw gm. Strzałki wskazują reaktywność specyficzną wobec gm w próbkach poddawanych i niepoddawanych gotowaniu. Neutralizujące miana testowe (NT) podano dla surowic, które otrzymano z wirusologicznej jednostki diagnostycznej. Fig. 10: (A) Porównanie gm EHV-1 z gm EHV-4 z wykorzystaniem przeciwciała poliklonalnego skierowanego przeciw gm EHV-1. Komórki infekowano wskazanymi wirusami (MOI od 0,5 do 1) i w podanych punktach czasowych po infekcji przygotowywano lizaty komórkowe. Wiriony EHV-1 lub -4 oczyszczano przez powtarzane wirowania w sacharozie (30%) i ponownie zawieszano w PBS. Próbki mieszano z buforem zawierającym 5% 2-merkaptoetanol, a następnie ogrzewano do temperatury 99 C przez 5 minut albo pozostawiano w temperaturze 4 C. Białka rozdzielano przez SDS-10% PAGE i przenoszono metodą blottingu na sączki nitrocelulozowe. Wiążące przeciwciała uwidaczniano stosując koniugat peroksydazy i immunoglobuliny G (IgG) skierowanej przeciw przeciwciałom króliczym (Sigma), a następnie wykrywanie ECLTM (Pharmacia-Amersham). (B) Wiriony oczyszczano z komórek Edmin337 zainfekowanych EHV-4, E4ΔgM-w, E4ΔgM-GFP i E4RgM i poddawano analizie metodą blottingu Western, jak opisano w (A). Następnie porównywano reaktywność gb wirionów z reaktywnością gm wykorzystując przeciwciało monoklonalne 3F6, skierowane przeciw gb EHV-1 lub przeciwciało poliklonalne skierowane przeciw gm EHV-1. Definicje terminów stosowanych we opisie Przed przedstawieniem rozwiązań według wynalazku, trzeba powiedzieć, że stosowane w opisie i zastrzeżeniach, formy w liczbie pojedynczej obejmują odniesienia do liczby mnogiej, o ile z kontekstu wyraźnie nie wynika inaczej. A zatem, odniesienie do wirusa EHV obejmuje wiele takich wirusów EHV, obejmując również wszystkie podgatunki, takie jak EHV 1, 4 i inne, odniesienie do komórki jest odniesieniem do jednej lub więcej komórek oraz ich równoważników znanych specjalistom w tej dziedzinie, i tak dalej. O ile nie zdefiniowano inaczej, wszystkie terminy techniczne i naukowe stosowane w opisie mają takie samo znaczenie jak jest to powszechnie rozumiane przez specjalistę w dziedzinie wynalazku. Chociaż w praktyce i w testowaniu wynalazku można stosować dowolne materiały i metody podobne lub równoważne do tych opisanych zostaną teraz omówione korzystne metody, urządzenia i materiały. Wszystkie wymienione publikacje włączono do opisu poprzez odwoływanie się w celu opisanie i ujawnienia linii komórkowych, wektorów oraz metodologii przedstawianych w publikacjach, które można wykorzystywać w związku z wynalazkiem. Termin EHV odnosi się do wszystkich końskich herpeswirusów, takich jak gatunki EHV-1 i EHV-4, w obrębie rodziny Alphaherpesvirinae. Wszystkie terminy EH-wirus, wirus EH, wirus EHV, EHV-wirus i EHV odnoszą się do końskich herpeswirusów. Zjadliwość: Zjadliwość odnosi się do wirusa EH zdolnego do namnażania w docelowym gatunku gospodarza (tj. koniach) z możliwością indukowania subklinicznej i klinicznej choroby, charakteryzującej się objawami ze strony układu oddechowego, poronieniami lub zaburzeniami neurologicznymi. Przykładami zjadliwych EHV są wirusy typu dzikiego indukujące silne objawy kliniczne. Przykładami czynników zjadliwości są hemolizyny (lizujące krwinki czerwone) lub adhezyny (białka, dzięki którym patogen może przylegać do gospodarza i rozpoczynać kolonizację lub inwazję). Bardziej

6 6 PL B1 szczegółowo, zjadliwość oznacza, że produkt genu gm, główny składnik otoczki wirusowej, umożliwia wirusowi penetrację gospodarza i bierze udział w rozprzestrzenianie się komórka-komórka. Atenuacja: Atenuowany wirus EH, odnosi się do infekcyjnego EHV, który nie powoduje subklinicznej bądź klinicznej choroby związanej z EHV. W szczególności, zgodnie z wynalazkiem, takie atenuowane wirusy EH są EHV, które mogą replikować i nie mogą przeprowadzać ekspresji gm. Funkcjonalny wariant wirusa EH według wynalazku jest wirusem EHV, który wykazuje aktywność biologiczną (albo funkcjonalną albo strukturalną), zasadniczo podobną do EHV według wynalazku. Termin funkcjonalny wariant obejmuje również fragment, funkcjonalny wariant, wariant oparty na degeneracji kodu kwasu nukleinowego lub pochodną chemiczną. Taki funkcjonalny wariant np. może nieść jedną lub wiele zmian, delecji lub insercji kwasu nukleinowego. Zmiany te, delecje i insercje mogą stanowić 10% całkowitej sekwencji. Wariant funkcjonalny, co najmniej częściowo zachowuje swoją aktywność biologiczną, np. funkcjonowanie, jako klon infekcyjny lub szczep szczepionkowy lub nawet wykazuje ulepszoną aktywność biologiczną. Wariant oparty na degeneracyjnej naturze kodu genetycznego jest wariantem wynikającym z faktu, że pewne aminokwasy mogą być kodowane przez kilka różnych tripletów nukleotydowych. Wariant, co najmniej częściowo zachowuje swoją aktywność biologiczną lub nawet wykazuje ulepszoną aktywność biologiczną. Cząsteczka fuzyjna może być cząsteczką DNA lub infekcyjnym wirusem EHV według wynalazku tworzącym fuzję z np. cząsteczką reporterową, taką jak znacznik promieniotwórczy, cząsteczką chemiczną, taką jak znacznik fluorescencyjny lub dowolną inną cząsteczką znaną w nauce. Pochodną chemiczną jest cząsteczka DNA lub infekcyjny klon EHV według wynalazku zmodyfikowany chemicznie lub zawierający dodatkowe reszty chemiczne, normalnie niestanowiące części cząsteczki. Takie reszty mogą poprawiać rozpuszczalność, absorpcję, czas biologicznego półtrwania cząsteczki itd. Cząsteczka jest zasadniczo podobna do innej cząsteczki, jeśli obie cząsteczki posiadają zasadniczo podobne sekwencje nukleotydowe lub aktywność biologiczną. A zatem, pod warunkiem, że dwie cząsteczki wykazują podobną aktywność, uważa się je za warianty, ponieważ termin ten stosuje się, jeśli sekwencja nukleotydowa nie jest identyczna i dwie cząsteczki, które posiadają podobną sekwencję nukleotydową uważa się za warianty, ponieważ termin ten stosuje się w opisie nawet, jeśli ich aktywność biologiczna nie jest identyczna. Termin szczepionka odnosi się do kompozycji farmaceutycznej, zawierającej, co najmniej jeden aktywny immunologicznie składnik, który indukuje odpowiedź immunologiczną u zwierzęcia i ewentualnie, ale nie koniecznie, jeden lub więcej dodatkowych składników, które wzmacniają aktywność immunologiczną składnika aktywnego. Szczepionka może dodatkowo zawierać składniki typowe dla kompozycji farmaceutycznych. Aktywny immunologicznie składnik szczepionki może zawierać kompletne cząstki wirusowe albo w ich oryginalnej postaci albo w postaci atenuowanych cząstek w tak zwanej zmodyfikowanej żywej szczepionce (MLV) lub cząstki inaktywowane odpowiednimi metodami w tak zwanej zabitej szczepionce (KV). W innej postaci immunologicznie aktywny składnik szczepionki może zawierać odpowiednie elementy organizmów (szczepionki podjednostkowe), przy czym te elementy są wytwarzane albo poprzez niszczenie całych cząstek albo przez hodowle wzrostowe zawierające takie cząstki i, ewentualnie, następne etapy oczyszczania dające w wyniku pożądaną(ne) strukturę(ry) albo sposoby syntetyczne, obejmujące odpowiednie manipulacje przez zastosowanie właściwych układów opartych, na przykład, na bakteriach, owadach, ssakach lub innych gatunkach i, ewentualnie, dalsze procedury izolacji i oczyszczania albo przez indukowanie procesów syntetycznych, w zwierzęciu potrzebującym szczepionki, przez bezpośrednie wprowadzenie materiału genetycznego z wykorzystaniem odpowiednich kompozycji farmaceutycznych (szczepienie polinukleotydami). Szczepionka może zawierać jeden lub jednocześnie więcej niż jeden z opisanych elementów. Termin szczepionka jest szczepionką do stosowania weterynaryjnego, zawierająca substancje antygenowe i podaje się ją w celu indukowania specyficznej i czynnej odporności przeciw chorobie wywoływanej przez EHV. Szczepionka EHV według wynalazku nadaje odporność czynną, która może być przenoszona biernie przez przeciwciała matczyne przeciw immunogenom, która ona zawiera i czasami również przeciw organizmom zbliżonym antygenowe Dodatkowymi składnikami do wzmacniania odpowiedzi immunologicznej są składniki powszechnie określane, jako adiuwanty, jak np. wodorotlenek glinu, olej mineralny lub inne oleje, bądź cząsteczki pomocnicze dodawane do szczepionki lub wytwarzane przez organizm po odpowiedniej

7 PL B1 7 indukcji przez takie dodatkowe składniki, takie jak, ale bez ograniczeń, interferony, interleukiny lub czynniki wzrostowe. Kompozycja szczepionki lub kompozycja farmaceutyczna zasadniczo składa się z jednego lub więcej składników zdolnych do modyfikowania fizjologicznych, np. immunologicznych, funkcji organizmu, do którego jest podawana lub organizmów żyjących w lub na organizmie. Termin obejmuje, ale bez ograniczeń, antybiotyki lub leki przeciwpasożytnicze, jak również inne składniki powszechnie stosowane do osiągania pewnych innych celów takich jak, ale bez ograniczeń, cechy przetwarzania, jałowość, stabilność, łatwość podawania kompozycji przez dojelitowe i pozajelitowe drogi, takie jak droga doustna, donosowa, dożylna, domięśniowa, podskórna, śródskórna lub inne odpowiednie drogi, tolerancja po podawaniu, właściwości kontrolowanego uwalniania. Wynalazku dokonano pomimo trudności i przekonania panującego w nauce, że końskiego herpeswirusa nie można wytworzyć, jako wolnego od obcych sekwencji. Stosując metody według wynalazku, dostarcza się wirusy EH o lepszej, jakości do stosowania w szczepionkach. Centralną sekwencję kodującą dla białka gm wyeliminowano w ten sposób, że pozostałe karboksy-końcowe sekwencje gm znajdują się w innej ramce odczytu, niż sekwencje amino-końcowe. Sąsiadujący gen dla zasadniczego homologu białka UL9 (gen 53), jego orientacja i fakt, że zachodzi na gen kodujący białko gm, wymaga, aby minimalna sekwencja nukleotydowa genu dla gm została zachowana dla umożliwienia ekspresji genu 53 i dzięki temu zachowaniu żywotności wirusa. Dlatego też, EHV według wynalazku dotyczy EHV, które charakteryzują się tym, że gen kodujący dla białka gm usuwa się tak, aby nie wpływać na ekspresję genu kodującego homolog UL9 (genu 53). Termin nie wpływać nie wiąże się z pewnymi ilościowymi lub jakościowymi właściwościami UL9, ale po prostu oznacza, że na ekspresję genu nie wpływa się tak długo, jak białko ulega ekspresji w wirusie i jest obecne w ilości zasadniczo wystarczającej dla żywotności wirusa. Istniejąca w nauce od dawna potrzeba szczepionki zawierającej zrekombinowanego końskiego herpeswirusa 4 została zaspokojona przez twórców wynalazku, którzy pokonali dotychczasowe trudności istniejące w nauce. Wirusy EHV-1 i EHV-4 według wynalazku można korzystnie stosować, na przykład, w szczepionce. Wynalazek dotyczy końskiego herpeswirusa (EHV), w którym gen kodujący białko gm, i w konsekwencji samo gm jest nieobecne, a EHV jest wolny od elementów heterologicznych. Wolny od elementów heterologicznych oznacza, że żadne obce sekwencje, tj. żadne sekwencje nie EHV, takie jak kasetki kodujące lacz lub GFP, nie są obecne w sekwencji kodującej wirusa według wynalazku (tak zwanego białego klonu ). A zatem, EHV według wynalazku jest całkowicie kodowany przez sekwencje EHV. EHV według wynalazku jest wolny od elementów bakteryjnych lub kwasów nukleinowych kodujących elementy bakteryjne. Ponadto, wyeliminowano prawie całą sekwencję kodującą dla białka gm i w konsekwencji kodowane białko gm. A zatem, korzystnie, EHV według wynalazku charakteryzuje się tym, że białko gm jest nieobecne w wyniku delecji genu kodującego dla białka gm. Jednakże, gen kodujący białko gm jest nieobecny również wymaga, aby minimum sekwencji gm pozostało tak, że co najmniej nadal obecna jest sekwencja zachodząca na gen 53; pozostałe sekwencje gm można wydeletować ( infra). Wszystko to można osiągnąć za pomocą technik biologii molekularnej (infra) tak, że wytwarza się rekombinowany EHV. Stosowanie lacz jako markera udanej delecji genu gm EHV-1 lub 4 nie prowadzi do udanego wytwarzania wirusów według wynalazku (przykład 1, 2). Dlatego też twórcy opracowali sposób otrzymywania wirusa. Skonstruowano wirusa EHV, w którym wydeletowano gen gm przez wstawienie kasetki zawierającej marker GFP. Podejście to niespodziewanie umożliwiło różnicowanie pomiędzy wirusem z wstawką (zielono fluoryzujące łysinki) i łysinkami nowych rekombinantów (łysinki niefluoryzujące). lacz jest znany specjalistom jako gen kodujący β-galaktozydazę. GFP odnosi się do białka zielono fluoryzującego (GFP) i wytwarzanego przez bioluminoscencyjną meduzę (Chalfie i in., 1994). Komplementująca linia komórkowa odnosi się do linii komórkowej, w której wprowadza się gen normalnie niewystępujący w genomie linii komórkowej i ulega on konstytutywnej ekspresji. Użyteczne linie komórkowe obejmują, bez ograniczeń, linię komórek nerki królika Rkl3, linię komórek cc (Seyboldt i in., 2000) lub linię komórek Vero (nr katalogowy ATCC CRL-1586), tak jak klon 1008, jak również ujawniono w przykładach 1 i 2 oraz inne linie komórkowe znane specjalistom. Zazwyczaj można przeprowadzać selekcję pod kątem klonów komórek zdolnych do ekspresji tego dodatkowego białka.

8 8 PL B1 Ta linia komórkowa przeprowadza ekspresję genu, który wydeletowano z wirusa, komplementując ten brak i umożliwiając wzrost wirusa po delecji genu. Standardowe metody biologii molekularnej wykorzystujące enzymy restrykcyjne, ligacje, PCR, transfekcje itd. są znane w nauce (np. Sambrook i in. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nowy Jork). Korzystnie, taki EHV według wynalazku stanowi EHV-1. Korzystnie, gdy EHV-1 usunięto bp z 1332 bp otwartej ramki odczytu gma a jeszcze korzystniej gdy EHV-4 wydeletowano bp otwartej ramki odczytu gm czy bp otwartej ramki odczytu gm (960, 961, 962, 963, 964, 965, 966, 967, 968, 969 lub 970 bp). Najkorzystniej, EHV-1 według wynalazku charakteryzuje się tym, że wydeletowano 962 bp otwartej ramki odczytu gm. EHV-1 według wynalazku charakteryzuje się tym, że usunięto sekwencję kodującą dla gm, za wyjątkiem par zasad (bp) sekwencji kodującej, kodującej C-końcową część gm i bp sekwencji kodującej, kodującej N-końcową część gm. W korzystnym rozwiązaniu, wydeletowana jest sekwencja kodująca gm, pozostały tylko nukleotydy do sekwencji kodującej C-końcową część gm oraz nukleotydy do sekwencji kodującej N-końcową część gm. A zatem, korzystniejszy jest EHV-1 według wynalazku, charakteryzujący się tym, że wydeletowano nukleotydy do (kodujące część rdzenia gm) (numeracja zgodna z Telford, 1992). W podanych zakresach, wydeletowana może być dowolna liczba nukleotydów. A zatem, zgodnie z wynalazkiem, delecje mogą rozpoczynać się nie wcześniej niż od pozycji nukleotydowej 93268, ale muszą się zaczynać przy pozycji Delecją może się kończyć już przy pozycji 94222, ale nie później niż przy pozycji A zatem, korzystny EHV-1 według wynalazku charakteryzuje się tym, że wydeletowano nukleotydy od pozycji, odpowiadającej pozycjom według Telforda (1992), do sekwencji kodującej gm. Wszelkie kombinacje pozostają w zakresie wynalazku, tak jak do 94312, do itd. Jeszcze korzystniej, EHV-1 według wynalazku charakteryzuje się tym, że wydeletowano sekwencję kodującą dla gm, za wyjątkiem bp sekwencji kodującej, kodującej C-końcową część gm oraz bp sekwencji kodującej, kodującej N-końcową część gm. W tym korzystniejszym rozwiązaniu, wydeletowano sekwencję kodującą gm, pozostały tylko nukleotydy do sekwencji kodującej C-końcową część gm oraz nukleotydy do sekwencji kodującej N-końcową część gm. A zatem, korzystniejszy EHV-1 według wynalazku charakteryzuje się tym, że wydeletowano nukleotydy od pozycji do (kodujące część rdzenia gm), (numeracja według Telforda, 1992). Równie korzystnie, EHV-1 według wynalazku charakteryzuje się tym, że wydeletowano sekwencję kodującą dla gm, za wyjątkiem 180 do 190 (180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190) bp sekwencji kodującej, kodującej część C-końcową sekwencji kodującej gm oraz 200 do 210 (200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210) bp sekwencji kodującej, kodującej część N-końcową gm. W korzystniejszym rozwiązaniu, wydeletowano sekwencję kodującą gm, pozostały tylko nukleotydy (93297, 93298, , 93300, 93301, 93302, 92303, 93304, 93305, 93306, 93307) sekwencji kodującej C-końcową część gm oraz nukleotydy do (94263, 94264, 94265, 94266, 94267, 94268, 94269, 94270, 94271, 94272, 94273) sekwencji kodującej, kodującej N-końcową część gm. A zatem, w korzystniejszym EHV-1 wydeletowano nukleotydy od pozycji do (kodujące część rdzenia gm), (numeracja według Telforda, 1992). Oznacza to, że dowolne nukleotydy w obrębie pozostałych nukleotydów można wydeletować zgodnie z wynalazkiem, np. nukleotydy lub lub lub ich dowolne kombinacje. Najkorzystniejszy EHV-1 według wynalazku charakteryzuje się tym, że wydeletowano sekwencję kodującą dla gm, za wyjątkiem 184 bp sekwencji kodującej, kodującej C-końcową część sekwencji kodującej gm oraz 209 bp sekwencji kodującej, kodującej N-końcową część gm. W tym najkorzystniejszym rozwiązaniu, wydeletowano sekwencję kodującą gm, pozostały jedynie nukleotydy sekwencji kodującej C-końcową część gm i nukleotydy sekwencji kodującej, kodującej N-końcową część gm. A zatem, najkorzystniejszy jest EHV-1 według wynalazku, w którym wydeletowano nukleotydy do (kodujące część rdzenia gm) (numeracja według Telforda, 1992). W tym najkorzystniejszym rozwiązaniu, wydeletowano 962 nukleotydy sekwencji kodującej gm. Opisano to w przykładzie 1.

9 PL B1 9 Również korzystniejszy jest EHV-1 charakteryzujący się tym, że wydeletowano z niego gm oraz, że jest on wolny od elementów heterologicznych i jest wariantem rekombinacyjnym opartym na szczepie wybranym z grupy składającej się z AB69 (ATCC VR2581), mutanta Ts EHV-1 ECACC V , KyA, KyD, Abl, Ab4, RacH, RacLll lub RacM EhV-l i nie posiada żadnych elementów heterologicznych, takich jak elementy GFP lub lacz. Również korzystniej, EHV-1 według wynalazku charakteryzuje się tym, że wydeletowano z niego gm i jest od wolny od elementów heterologicznych, takich jak elementy GFP lub lacz i jest wariantem rekombinacyjnym opartym na szczepie RacH EHV-1. Najkorzystniej, EHV-1 według wynalazku charakteryzuje się tym, że wydeletowano z niego gm i jest od wolny od elementów heterologicznych, takich jak elementy GFP lub lacz i jest izolatem HΔgM-w warianta rekombinacyjnego opartego na RacH, jak ujawniono w przykładzie 1. Izolat HΔgM-w EHV-1 według wynalazku zdeponowano w Centrę for Applied Microbiology and Research (CAMR) and European Collection of Celi Cultures (ECACC), Salisbury, Witshire, SP4 OJG, Wielka Brytania, jako depozyt patentowy na warunkach Porozumienia Budapesztańskiego. Data depozytu 16 października 2002 roku, wstępne określenie identyfikacyjne to H-delta-gMw, a numer dostępu nadany w międzynarodowym depozycie ECACC/CAMR to Również korzystny jest EHV-1 posiadający wszystkie charakterystyczne cechy identyfikacyjne zdeponowanego EHV-1. Wszystkie wcześniej wymienione EHV-1 posiadają lepsze właściwości w porównaniu z wirusami z elementami heterologicznymi, takimi jak GFP. EHV-1 według wynalazku wykazuje korzystną wyższą infekcyjność pozakomórkową niż wirusy nadal zawierające elementy heterologiczne. Przykładowo przedstawiono to na figurze 5 (np. pomiędzy 4 a 12 godziną). Do czasu kiedy powstał wynalazek, nikt nie potrafił utworzyć rekombinowanego wirusa EHV-4, którego można by stosować jako szczepionkę. EhV-l i EHV-4 są homologiczne i pewnym stopniu wykazują reaktywność krzyżową. Jednakże, w nauce od dawna istnieje zapotrzebowanie na atenuowane wirusy EHV-4, ponieważ okazało się, że EHV-1 nie zapewnia odpowiedniej ochrony przeciw infekcjom EHV-4. A zatem, EHV według wynalazku stanowi EHV-4. Korzystniej, EHV-4 według wynalazku charakteryzuje się tym, że wydeletowano bp z 1332 bp otwartej ramki odczytu gm. Jeszcze korzystniej, EHV-4 według wynalazku charakteryzuje się tym, że wydeletowano bp otwartej ramki odczytu gm. Również korzystniej, EHV-1 według wynalazku charakteryzuje się tym, że wydeletowano bp otwartej ramki odczytu gm (1110, 1111, 1112, 1113, 1114 lub 1115 bp). Najkorzystniej, EHV-1 według wynalazku charakteryzuje się tym, że wydeletowano 1110 bp otwartej ramki odczytu gm. Korzystniej, EHV-4 według wynalazku charakteryzuje się tym, że wydeletowano sekwencję kodującą dla gm, za wyjątkiem 0-50 par zasad (bp) sekwencji kodującej, kodującej C-końcową część gm oraz bp sekwencji kodującej, kodującej N-końcową część gm. W tym korzystniejszym rozwiązaniu, wydeletowano sekwencję kodującą gm, pozostały tylko nukleotydy do sekwencji kodującej C-końcową część gm oraz nukleotydy do sekwencji kodującej, kodującej N-końcową część gm. A zatem, korzystniejszy jest EHV-4 według wynalazku charakteryzujący się tym, że wydeletowano nukleotydy do (kodujące część rdzenia gm) (numeracja według Telforda, 1998). W podanych zakresach, wydeletowana może być dowolna liczba nukleotydów. A zatem, zgodnie z wynalazkiem, delecje mogą rozpoczynać się nie wcześniej niż od pozycji nukleotydowej 92681, ale muszą się zaczynać przy pozycji Delecją może się kończyć już przy pozycji 93765, ale nie później niż przy pozycji A zatem, korzystnie, EHV-4 charakteryzuje się tym, że wydeletowano nukleotydy od pozycji, odpowiadającej pozycjom według Telforda (1998), do sekwencji kodującej gm. Wszelkie kombinacje pozostają w zakresie wynalazku, tak jak do 93801, do i tak dalej. Jeszcze korzystniej, EHV-4 według wynalazku charakteryzuje się tym, że wydeletowano sekwencję kodującą dla gm, za wyjątkiem bp sekwencji kodującej, kodującej C-końcową część gm oraz bp sekwencji kodującej, kodującej N-końcową część gm. W tym korzystniejszym rozwiązaniu, wydeletowano sekwencję kodującą gm, pozostały tylko nukleotydy do sekwencji kodującej C-końcową część gm oraz nukleotydy do sekwencji kodującej, kodującej N-końcową część gm. A zatem, korzystniejszy jest EHV-4 według wynalazku charakteryzujący się tym, że wydeletowano nukleotydy do (kodujące część rdzenia gm) (numeracja według Telforda, 1998). Również korzystniej, EHV-4 według wynalazku charakteryzuje się tym, że wydeletowano sekwencję kodującą dla gm, za wyjątkiem 30 do 40 (30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 lub 40) bp

10 10 PL B1 sekwencji kodującej, kodującej C-końcową część sekwencji kodującej gm oraz 200 do 210 (200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209 lub 210) bp sekwencji kodującej, kodującej N-końcową część gm. W tym korzystniejszym rozwiązaniu, wydeletowano sekwencję kodującą gm, pozostały tylko nukleotydy do (92710, 92711, 92712, 92713, 92714, 92715, 92716, 92717, 92718, 92719, 92720) sekwencji kodującej C-końcową część gm oraz nukleotydy do (93824, 93825, 93826, 93827, 93828, 93829, 93830, 93831, 93832, 93833, 93834) sekwencji kodującej, kodującej N-końcową część gm. A zatem, korzystniejszy jest EHV-4 według wynalazku charakteryzujący się tym, że wydeletowano nukleotydy do (kodujące część rdzenia gm) (numeracja według Telforda, 1998). Oznacza to, że dowolne nukleotydy w obrębie powyżej wymienionych pozostałych nukleotydów można wydeletować zgodnie z wynalazkiem, np. nukleotydy lub lub lub ich dowolne kombinacje. Najkorzystniej, EHV-4 według wynalazku charakteryzuje się tym, że wydeletowano sekwencję kodującą dla gm, za wyjątkiem 34 bp sekwencji kodującej, kodującej C-końcową część sekwencji kodującej gm oraz 209 bp sekwencji kodującej, kodującej N-końcową część gm. W tym najkorzystniejszym rozwiązaniu, wydeletowano sekwencję kodującą gm, pozostały jedynie nukleotydy sekwencji kodującej C-końcową część gm i nukleotydy sekwencji kodującej, kodującej N-końcową część gm. A zatem, najkorzystniejszy jest EHV-4 według wynalazku, który charakteryzuje się tym, że wydeletowano nukleotydy do (kodujące część rdzenia gm) (numeracja według Telforda, 1998). W tym najkorzystniejszym rozwiązaniu, wydeletowano 1110 nukleotydów sekwencji kodującej gm. Opisano to w przykładzie 2. Również korzystniej, EHV-4 według wynalazku charakteryzuje się tym, że wydeletowano z niego gm oraz, że jest on wolny od elementów heterologicznych, takich jak elementy GFP lub lacz, i jest wariantem rekombinacyjnym opartym na szczepie MSV Lot EHV-4. Najkorzystniej, EHV-4 według wynalazku charakteryzuje się tym, że wydeletowano z niego gm i jest od wolny od elementów heterologicznych, takich jak elementy GFP lub lacz i opiera się na szczepie MSV Lot i izolacie E4AgM-4, jak ujawniono w przykładzie 2. HΔgM-w EHV-1 według wynalazku zdeponowano w Centrę for Applied Microbiology and Research (CAMR) and European Collection of Celi Cultures (ECACC), Salisbury, Witshire, SP4 OJG, Wielka Brytania, jako depozyt patentowy na warunkach Porozumienia Budapesztańskiego. Data depozytu 14 stycznia 2003 roku, wstępne określenie identyfikacyjne to EHV-4, numer dostępu nadany w międzynarodowym depozycie ECACC/CAMR Również korzystny jest EHV-4 posiadający wszystkie charakterystyczne cechy identyfikacyjne zdeponowanego EHV-4. Wszystkie wcześniej EHV-4 posiadają lepsze właściwości w porównaniu z wirusami znanymi z wcześniejszych prac, ponieważ w nauce nie było żadnych dostępnych rekombinowanych EHV-4. Ponadto, EHV-4 według wynalazku wykazuje korzystną wyższą infekcyjność pozakomórkową niż wirusy nadal zawierające elementy heterologiczne, takie jak GFP. Przykładowo przedstawiono to na fig. 10 (np. w 24 godzinie). Innym ważnym elementem wynalazku jest kwas nukleinowy kodujący EHV. Specjaliści mogą łatwo określić odpowiadającą sekwencję za pomocą znanych w nauce standardowych metod biologii molekularnej. Szczególnie trudne w nauce było otrzymanie EHV według wynalazku. Twórcy wynalazku skonstruowali gm negatywne wirusy EHV, wprowadzając gen markerowy (lacz) do genu gm. Kiedy próbowano usunąć tę kasetkę, w obydwu mutantach EHV-1 i EHV-4, wytworzonych przez insercję lacz, wszystkie klony będąc fenotypowo negatywne pod względem lacz nadal zawierały kasetkę lacz. Dlatego też twórcy wynalazku opracowali sposób otrzymywania wirusów. Skonstruowano wirusa EH, w którym wydeletowano gen gm przez insercję kasetki zawierającej marker GFP. Niespodziewanie, to podejście umożliwiło różnicowanie pomiędzy wirusem z wstawką (zielono fluoryzujące łysinki) i łysinkami nowych rekombinantów (łysinki niefluoryzujące). Pokonując trudności istniejące w tej dziedzinie, twórcy wynalazku wytworzyli także linię komórek Vero (w oparciu o klon 1008 komórki Vero), w którym konstytutywnie zachodzi ekspresja EHV4-gM. Wspomnianą linię komórkową utworzono przez transfekcję odpowiedniego genu gm i następnie selekcję pod kątem komórek Vero, w których zachodzi ekspresja gm. Tylko komórki umożliwiły autorom wynalazku replikację wirusa EHV4 negatywnego pod względem gm. Linię komórek Vero komplementującą gm, według wynalazku, zdeponowano w Centrę for Applied Microbiology and Research (CAMR) and European Collection of Celi Cultures (ECACC), Salisbury, Witshire, SP4 OJG, Wielka Brytania, jako depozyt patentowy na warunkach Porozumienia Budapesztańskiego. Data depozytu 28 stycznia 2003 roku, wstępne określenie identyfikacyjne to VERO

11 PL B1 11 GM, numer dostępu nadany w międzynarodowym depozycie ECACC/CAMR Również korzystne są linie komórkowe posiadające wszystkie charakterystyczne cechy identyfikacyjne zdeponowanej linii komórkowej VERO GM. Jak ujawniono dla EHV-1, stosowanie lacz jako markera zamiast GFP nie doprowadziło również w EHV-4 do udanego utworzenia wirusów według wynalazku (nie ograniczająco w przykładzie 2). Komórki lacz-pozytywne wybarwiały się na ogół mniej intensywnie na komórkach Vero, niż na komórkach Rkl3 i było je przez to trudniej identyfikować a układ EHV-4 replikował wolniej niż EHV-1 i dawał mniej czasu pomiędzy identyfikacją a izolacją zdolnego do życia potomstwa wirusa. Dlatego też, wykorzystywanie GFP stanowi jedyną drogę do otrzymywania wirusa EHV-4. Procedurę przeprowadzano jak opisano dla EHV-1 i niespodziewanie prowadziła ona również do udanej identyfikacji wirusa EHV-4 z delecją gm dzięki identyfikacji fluoryzujących łysinek. Izolację EHV typu dzikiego przeprowadza się przez zbieranie tkanki płuc przy sekcji zwłok zwierząt podejrzanych o chorobę wywołaną EHV i izolowanie EHV z komórek tkanki, w znany w nauce sposób. Kompletną sekwencję genomu EHV 1 opublikowali Telford i in. (1992). Podobnie, kompletną sekwencję genomu EHV-4 opublikowali Telford i in. (1998). Amplifikacja przez PCR sekwencji DNA przy wykorzystaniu specyficznych starterów wiążących się z komplementarnymi niciami docelowego DNA flankującego odcinek DNA będący przedmiotem zainteresowania stanowi standardową metodę biologii molekularnej. Metody ligacji odpowiednich sekwencji DNA z plazmidami odpowiednimi dla zamierzonych konstrukcji, transfekcji DNA do komórek eukariotycznych, analiz przez blotting Southern i Western, ukierunkowanego wycinania fragmentów DNA za pomocą enzymów restrykcyjnych oraz selekcji linii komórkowej, w której zachodzi ekspresja pożądanych genów heterologicznych lub plazmidów niosących pożądany gen bądź wirusa, z którego wydeletowano pewien gen są znane specjalistom. Standardowe metody biologii molekularnej, takie jak techniki wymienione powyżej, są znane specjalistom, a można je również znaleźć np. w Sambrook i in. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nowy Jork i Bertram, S. i Gassen, H.G. Gentechnische Methoden, G. Fischer Verlag, Stuttgart, Nowy Jork, 1991). Delecja oznacza usunięcie jednego lub kilku nukleotydów bądź aminokwasów. Innym ważnym rozwiązaniem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna lub szczepionka, zawierająca EHV według wynalazku, ewentualnie, w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem lub zaróbką. Również ważną częścią wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca kwas nukleinowy według wynalazku. Korzystnie, szczepionka według wynalazku dotyczy szczepionki jak zdefiniowano powyżej. Termin żywa szczepionka odnosi się do szczepionki zawierającej cząstki zdolne do replikacji, w szczególności, aktywny pod względem replikacji składnik wirusowy. Korzystnie, szczepionka według wynalazku zawiera EHV-1 z delecją gm, w połączeniu z EHV-4 z delecją gm lub ewentualnie inną grupą antygenową i, ewentualnie, farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub zaróbkę. Szczepionkę można podawać, jako szczepionkę łączoną w tym samym czasie. Najkorzystniej, atenuowany EHV-1 według wynalazku można podawać najpierw, a następnie trzy do czterech tygodni później można podawać atenuowany EHV-4. Również najkorzystniej, atenuowany EHV-1 można podawać w kombinacji z atenuowanym EHV-4 zgodnie z typowym schematem szczepienia, gdzie podaje się dwa lub trzy podstawowe szczepienia. Typowy schemat szczepienia przy stosowaniu takiej szczepionki obejmuje dwa szczepienia w odstępie 4 tygodni (szczepienia podstawowe), a następnie regularne szczepienia przypominające, co sześć miesięcy. Jednakże, dowolną ze szczepionek według wynalazku można również podawać w innych odstępach, np. co trzy miesiące. Specjalista może wybrać jak rozdzielić podawanie na dwa lub więcej zastosowań, które mogą następować w krótkim czasie jedno po drugim lub w pewnych wcześniej określonych zakresach odstępów. Korzystnie, takie odstępy mogą być następujące: 1 immunizacja, 2 immunizacja w przybliżeniu 4 tygodnie później i ewentualnie 3 immunizacja 5-6 miesięcy później. W zależności od pożądanego czasu i skuteczności leczenia, szczepionki można podawać raz lub kilka razy, również sporadycznie. Szczepionki według wynalazku można podawać klaczy przed rozmnażaniem i ponownie - podczas ciąży, aby zapobiegać poronieniom związanym z EHV. Inne konie można szczepić np. raz na rok. Źrebięta można szczepić krótko po urodzeniu. Szczepionki według wynalazku można podawać różnymi drogami podawania znanymi specjalistom, szczególnie przez iniekcję dożylną lub bezpośrednią iniekcję do tkanek docelowych. Do stosowania ogólnoustrojowego, korzystne są drogi: dożylna, donaczyniowa, domięśniowa, dotętnicza, dootrzewnowa, doustna lub do śluzówkowa (np. iniekcja lub aerozol donosowy lub do układu

12 12 PL B1 oddechowego). Bardziej miejscowe stosowanie można osiągnąć podskórnie, śródskórnie, do płuc lub bezpośrednio do lub w pobliże leczonej tkanki (tkanki łącznej, kostnej, mięśniowej, nerwowej, nabłonkowej). Kompozycję szczepionki według wynalazku można również podawać przez wszczep lub doustnie. Najkorzystniejsze jest podawanie domięśniowe. Do przygotowywania odpowiednich preparatów szczepionek do opisanego stosowania specjalista można zastosować iniekcyjne, fizjologicznie dopuszczalne, jałowe roztwory. Do przygotowywania gotowych do stosowania roztworów do iniekcji lub infuzji pozajelitowych, łatwo dostępne są wodne roztwory izotoniczne, takie jak np. sól fizjologiczna lub odpowiadające roztwory białek osocza. Preparaty szczepionek mogą występować, jako liofilizaty lub preparaty suche, które można rekonstytuować w jałowych warunkach znanymi roztworami iniekcyjnymi bezpośrednio przed użyciem, np. jako zestaw części. Ostateczny preparat szczepionki według wynalazku przygotowuje się do iniekcji, infuzji lub perfuzji przez zmieszanie oczyszczonego wirusa według wynalazku z jałowym fizjologicznie dopuszczalnym roztworem, który może być uzupełniony znanymi substancjami nośnikowymi i/lub zaróbką. Stosowane dawki każdego z wirusów EHV według wynalazku obecne z preparacie szczepionki korzystnie mogą wynosić pomiędzy 10 4 a 10 8 TCID 50 /na zwierzę, pomiędzy 10 5 a 107 TCID 50 /na zwierzę, najkorzystniej 10 6 TCID 50 /na zwierzę. Wynalazek ponadto dotyczy zastosowania EHV w wytwarzaniu leku do profilaktyki i/lub leczenia stanów związanych z EHV. Wynalazek dotyczy też stosowania kwasu nukleinowego w wytwarzaniu leku do profilaktyki i/lub leczenia stanów związanych z EHV. Wynalazek ujawnia sposoby profilaktyki i/lub leczenia zwierzęcia, charakteryzujące się tym, że zwierzęciu podaje się kompozycję farmaceutyczną według wynalazku i monitoruje sukces terapeutyczny. Opisano sposób leczenia zainfekowanych EHV koni za pomocą EHV z delecją gm, w którym atenuowane EHV lub kompozycję szczepionki podaje się potrzebującemu tego koniowi w odpowiedniej dawce (wiadomo specjaliście) i monitoruje się zmniejszenia objawów związanych z EHV, takich jak wiremia i leukopenia i/lub kaszel i/lub gorączka i/lub wydzieliny z nosa i/lub biegunka i/lub depresja i/lub poronienia. Leczenie korzystnie można powtarzać. A zatem, ujawnienie dotyczy profilaktyki i/lub leczenia zwierzęcia - podaje się kompozycję farmaceutyczną według wynalazku i monitoruje się sukces terapeutyczny. Leczenie można przeprowadzać jak ujawniono dla kompozycji szczepionki. Opisano korzystny sposób wykrywania przeciwciał skierowanych przeciw specyficznym strukturom infekujących EHV-1 lub EHV-4 oraz sposób różnicowania metodami immunologicznymi infekcji typu dzikiego od obecności EHV-1 lub EHV-4 z delecją gm. Metody immunologiczne są znane specjaliście w tej dziedzinie i obejmują, ale nie ograniczają się do testów ELISA (enzymatycznych oznaczeń immunosorpcyjnych) lub kanapkowych testów ELISA, hybrydyzacji plazmowej, immunoblottingu, oznaczeń radioimmunologicznych (RIA), opartych na dyfuzji testów Ouchterlony'ego, immunofluorescencyjnych oznaczeń rakietkowych lub blottingu Western. Przykłady metod immunologicznych opisano np. w: An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, Holandia (1986); Bullock i in., Techniques in Immunocytochemistry, Academic Press, Orlando, FL tom 1 (1982), tom 2 (1983), tom 3 (1985); Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology; Elsevier Science Publishers, Amsterdam, Holandia (1985). W teście ELISA można stosować, ale bez ograniczania się, immobilizowany na plastykowej powierzchni odpowiedniej do analizy ELISA produkt genu gm lub część produktu genu gm lub dowolny inny produkt genu wirusa EH 1 lub wirusa EH 4. Test ELISA według wynalazku obejmuje, ale nie jest ograniczony do etapów: a) immobilizowania produktu genu gm lub jego fragmentu na nośniku plastykowym b) przemywania nośnika plastykowego odpowiednim buforem do przemywania (np. PBS- -Tween) c) dodawania próbek do wybranych studzienek i inkubowania płytek ELISA zgodnie z wystandaryzowanymi metodami d) przemywania studzienek płytki ELISA i dodawania przeciwciała sprzężonego z enzymem takim jak HRP (peroksydaza chrzanowa) wykrywania związanego koniugatu przeciwciało/hrp przez dodawanie odpowiedniego substratu, a następnie fotometryczny odczyt gęstości optycznej pojedynczych studzienek. Odpowiednie przeciwciała, np. przeciwciała królicze skierowane przeciw końskiej Ig, są znane w tej dziedzinie.

13 PL B1 13 Poniższe przykłady służą dalszej ilustracji. P r z y k ł a d y P r z y k ł a d 1 Izolaty EHV-1 z delecją gm gm negatywne EHV-1 konstruowano albo przez insercję kasetki ekspresyjnej lacz Escherichia coli (HΔgM-lacZ) albo kasetki ekspresyjnej białka o zielonej fluorescencji (GFP) (HΔgM-GFP) zastępując, w ten sposób, 74,5% sekwencji genu gm. Ekspresja białka markerowego ułatwia identyfikację a następnie oczyszczanie rekombinowanego wirusa. Dla uniknięcia obecności jakichkolwiek sekwencji nie EHV-1 w wirusie szczepionkowym zdecydowano się na usunięcie sekwencji genu markerowego i skonstruowanie innej, drugiej generacji gm negatywnych EHV-1, białych HΔgM (HΔgM-w). W tym celu skonstruowano plazmid pxubaxa (fig. 1). Najpierw podjęto próbę rekombinacji sekwencji pxubaxa do wirusa HΔgM-lacZ z markerowym genem lacz. W pierwszym etapie zoptymalizowano metodę transfekcji DNA przy użyciu fosforanu wapnia tak, że po wysianiu supernatantów transfekcyjnych zawierających PFU otrzymano kilka białych łysinek. Następnie, wybrano kilka łysinek do oczyszczania potomnych wirusów i poddawano czterem do pięciu rundom izolowania pojedynczych łysinek. Wielokrotne, izolowane niezależnie, fenotypowo negatywne pod względem lacz populacje wirusa analizowano genotypowo przez blotting Southern i okazało się, że nadal zawierają one sekwencje kasetki lacz. Przewidywano trudności w izolowaniu populacji wirusa prawdziwie negatywnego pod względem lacz z powodu milczącego lacz i to było przyczyną tego, że oczyszczono i analizowano bez powodzenia dużą ilość fenotypowo negatywnych pod względem lacz populacji wirusa. Dlatego też, strategię wytwarzania białego gm-negatywnego wirusa RacH zmieniono przez przejście na kotransfekcję gm-negatywnym EHV-1, który skonstruowano przez insercję kasetki GFP. Wykorzystanie wirusa zdolnego do ekspresji GFP ułatwiło rozróżnienie pomiędzy wirusem z wstawką (zielono fluoryzujące łysinki) i nowych rekombinantów wirusa (łysinki niefluoryzujące), co podwyższyło skuteczność izolacji łysinek fenotypowo negatywnych pod względem GFP. Nie spodziewano się, aby zmiana wstawki gm-negatywnego RacH wpływała na genotyp oczekiwanego rekombinowanego wirusa, ponieważ (i) oba wirusy pierwszej generacji HΔgM są, za wyjątkiem markerów, genetycznie identyczne a (ii) ostateczny genotyp w interesującym regionie zdeterminowany jest przez plazmid rekombinacyjny (pxubaxa). W celu skonstruowania plazmidu pxubaxa (konstrukt konieczny do otrzymania białych gm- -negatywnych EHV-1) fragment Apal - HincII o długości 962 bp z otwartej ramki odczytu gm EHV-1 o długości 1352 bp usunięto z plazmidu pbh3.1 (fig. 1D). Plazmid pbh3.1 zawiera fragment BamHI- -Hindlll EHV-1 otaczający gen gm (Seyboldt i in., 2000). Aby zapobiec ekspresji dowolnych skróconych produktów gm, wybrano endonukleazy restrykcyjne Apal i HincII tak, że po otrzymaniu tępych końców i ligacji pozostała C-końcowa sekwencja gm (183 bp) nie była w tej samej ramce odczytu z pozostałą N-końcową sekwencją (208 bp). Linię komórkową ccgm, w której zachodzi ekspresja gm EHV-1 (Seyboldt i in., 2000, otrzymaną od Dr N. Osterrieder) utrzymywano w minimalnych podłożu podstawowym uzupełnionym 5-10% płodową surowicą cielęcą (Biochrom, naświetlana promieniowaniem γ). Homologiczną rekombinację do EHV-1 osiągnięto przez kotransfekcję za pośrednictwem fosforanu wapnia komórek ccgm 5-10 µg plazmidu pxubaxa (fig. 1D) i 2 µg DNA, odpowiednio, HΔgM-lacZ lub HΔgM-GFP. Przeprowadzona następnie analiza DNA HΔgM-GFP, z wykorzystaniem wyznakowanej digoksygeniną sondy specyficznej wobec fragmentu BamHI-Hindlll plazmidu pbh3.1 (fig. 2), ujawniła na DNA trawionym (i) BamHI fragment bp i bp, (ii) Hindlll fragment bp i 825 bp, (iii) oraz Pstl fragment bp i bp. Stosowane enzymy restrykcyjne (BamHI, Hindlll, Pstl) tną w obrębie sekwencji kasetki markera GFP, zmieniając w ten sposób wzór fragmentu w stosunku do odpowiadającej kasetki markera GFP wolnego DNA. Sonda GFP wiązała się z odpowiednimi pierwszymi fragmentami (i-iii) i nie wykryła sekwencji specyficznych dla GFP na DNA RacH lub HΔgM-w. Na DNA RacH wykryto oczekiwane fragmenty BamHI ( bp), Hindlll ( bp) i Pstl (9.257 bp), których wielkość po usunięciu 962 bp sekwencji gm zmniejszyła się odpowiednio (do: bp, bp i bp; fig. 3B).

14 14 PL B1 Przeprowadzono jednoetapowe oznaczenia kinetyki wzrostu wirusów gm-negatywnych (HΔgMw lub HΔgM-GFP), które skonstruowano, zgodnie z opisem, w legendzie do fig. 1 oraz RacH. Komórki Rkl3 w 24-studzienkowych płytkach infekowano odpowiednimi wirusami przy MOI równym 2. Supernatanty i osady zainfekowanych komórek zbierano oddzielnie w różnych czasach po infekcji (0, 4, 8, 12, 16, 20, 24 godzin po infekcji). Supernatanty oczyszczano od pozostałości komórkowych przez wirowanie przy niskich szybkościach i komórki poddawano zamrażaniu-rozmrażaniu przed oznaczeniem infekcyjności związanej z komórkami. Wszystkie miana wirusów określano indywidualnie na, odpowiednio, komórkach Rkl3 lub ccgm w 24-studzienkowych płytkach. Wyniki (dane nieprzedstawione) można podsumować następująco: Infekcyjność związana z komórkami obu wirusów HAgM zmniejszyła się do czynnika wynoszącego pomiędzy 1,6 (4 godziny po infekcji) a 45 (20 godzin po infekcji) na komórkach Rkl3, jeśli porównać z mianami komórek zainfekowanych RacH (infekcyjność wewnątrzkomórkowa). Zewnątrzkomórkowe miana wirusa dla obu wirusów HΔgM zmniejszyły się maksymalnie o 186 (HΔgM-w) lub 650 (HΔgM-GFP) razy (12 godzin po infekcji) z porównaniu z RacH (infekcyjność zewnątrzkomórkowa), potwierdzając również rolę gm w wychodzeniu wirusa RacH. P r z y k ł a d 2 Izolaty EHV-4 z delecją gm Równolegle do konstruowania gm-negatywnych EHV-1, wybrano selekcję lacz do selekcjonowania EHV-4. W celu umożliwienia izolacji gm-negatywnych EHV-4 skonstruowano linię komórek Vero, w których konstytutywnie zachodzi ekspresja gm EHV-4. Klon C1008 komórek Vero (numer ATCC: CRL1586) utrzymywano w minimalnym podłożu podstawowym uzupełnionym 5-10% płodową surowicą cielęcą (Biochrom, naświetlana promieniowaniem γ). Rekombinowaną linię komórkową VerogM otrzymano przez transfekcję do komórek Vero, przeprowadzaną za pośrednictwem Effectene (Qiagen), 1 µg plazmidu pcgm4 (Fig. 3B) i 0,1 µg plazmidu psv2neo (nadającego oporność na G418; Neubauer i in., 1997). Klony komórek najpierw selekcjonowano pod względem oporności na G418 (Calbiochem) a następnie transkomplementację gm-negatywnych EHV-4. G418 dodawano do podłoża każdego piątego pasażu rekombinowanych linii komórkowych (500 µg/ml). Wszystkie komórki analizowano regularnie pod względem Mycoplasma za pomocą PCR i pod względem bydlęcego wirusa biegunki wirusowej (BVDV) za pomocą analizy FACS. Wyselekcjonowane klony komórek nazwano Vero-gM i stosowano do następnych doświadczeń. Komórki Vero-gM poddano kotransfekcji DNA EHV-4 i plazmidu pgm4β+ (fig. 3B). Wynikiem rekombinacji jest kilka łysinek lacz-pozytywnych, które izolowano i ponownie wysiewano. Następne oczyszczanie mutantów delecyjnych EHV-4 okazało się trudniejsze i wolniejsze niż EHV-1 ponieważ: (i) łysinki lacz-pozytywne generalnie wybarwiają się mniej intensywnie na komórkach Vero niż na komórkach Rkl3 i dlatego były trudniejsze do identyfikacji i ponieważ (ii) układ EHV-4 replikował wolniej niż EHV-1 i dawał mniej czasu pomiędzy identyfikacją a izolacją zdolnego do życia potomstwa wirusa. Wszystkie lacz-pozytywne łysinki, które wyizolowano zostały zgubione podczas pierwszej rundy oczyszczania, co narzuciło konieczność poszukiwań innego rozwiązania. Dlatego też próbowano stosować marker GFP również dla EHV-4. W pierwszym etapie skonstruowano plazmid pgm4gf+ (fig. 3B) i stosowano do rekombinacji do DNA EHV-4. Otrzymane pozytywne pod względem GFP łysinki oczyszczano przez trzy rundy izolowania pojedynczych łysinek na linii komórkowej Vero-gM. Wybrano homogenną, pozytywną pod względem GFP populację wirusa i wirusowy DNA poddawano analizie przez blotting Southern (fig. 4). DNA otrzymanego wirusa, E4ΔgM-GFP (fig. 3C), poddawano następnie kotransfekcji z albo plazmidem pgm4r albo pgm4w (fig. 3B). Plazmid pgm4r stosowano do konstruowania EHV-4 naprawionego pod względem gm, nazwanego E4RgM (fig. 3A). Plazmid pgm4w był podstawą do tworzenia jednocześnie negatywnego pod względem gm oraz genu markera EHV-4, E4AgM-w (fig. 3D). Populacje wirusa E4RgM i E4ΔgM-w izolowano ze względu na ich negatywny pod względem GFP fenotyp, oczyszczano na komórkach Vero lub Vero-gM i wreszcie analizowano przez blotting Southern (fig. 4). W celu ekspresji gm EHV-4 w komórkach eukariotycznych utworzono plazmid pcgm4 (fig. 3B). Kompletną otwartą ramkę odczytu gm EHV-4 zamplifikowano przez PCR stosując startery podane na fig. 8 i polimerazę Taq (MBI-Fermentas). Otrzymany produkt PCR wstawiono do wektora pcdnai/amp (Invitrogene). Plazmid pgm4r powstał w wyniku amplifikacji przez PCR nukleotydów do (Telford i in.,1998) EHV-4 i wstawienia produktu amplifikacji do wektora pgem3zf+ (Promega) (fig. 3B, fig. 8). Plazmid ten stosowano do konstruowania naprawionego pod względem gm EHV-4, E4RgM (fig. 3A).

15 PL B1 15 Dla skonstruowania plazmidu pgm4β+ (fig. 3B), który był przeznaczony do początkowej delecji 1110 bp gm EHV-4 o długości 1352 bp, wybrano wieloetapową strategię. W pierwszym etapie obie sekwencje flankujące konieczne do rekombinacji DNA zamplifikowano niezależnie przez PCR stosując polimerazę PFU (Stratagene). Miejsca restrykcyjne konieczne dla stopniowego klonowania dodawano poprzez sekwencje startera (fig. 8). Produkty PCR wstawiano do wektora ptz18r (Pharmacia), otrzymując plazmidy pgm4dell i pgm4 Del2 (fig. 8). W następnym etapie kasetkę ekspresyjną lacz E.coli o wielkości 3,9 kbp uwolniono z plazmidu ptt264a+ (Osterrieder i in., 1996) przez trawienie Sali i BamHI i wstawiono do plazmidu pgm4dell, otrzymując plazmid pgm4del1β+. Następnie, sekwencje specyficzne dla EHV-4 pobrane z pgm4del2, wprowadzono do pgm4del1β+ stosując Pstl i Sali tak, że w powstałym plazmidzie pgm4β+ (fig. 3B) kasetka genu markerowego była flankowana przez sekwencje specyficzne dla EHV-4. Plazmid pgm4β+ trawiono następnie Sali i BamHI, znów uwalniano kasetkę lacz a otrzymane lepkie końce 5' wypełniano stosując polimerazę Klenowa i konstrukt otrzymany w wyniku ponownej ligacji nazwano pgm4w (fig. 3B). Znów zaprojektowano przesunięcie ramki odczytu pomiędzy 208 N-końcowymi nukleotydami i pozostałymi C-końcowymi 33 nukleotydami sekwencji gm. W celu utworzenia plazmidu pgm4gfp+ (fig. 3B), kasetkę lacz usunięto z pgm4β+ (fig. 3B) wykorzystując miejsca Sali i BamHI i zastąpiono kasetką GFP (Obejmującą promotor CMV i polia SV40), którą usunięto z wektora pegfp-cl (Clontech) przez trawienie AsnI i Mlul. Lepkie końce utworzone przez enzymy restrykcyjne przeprowadzono w tępe końce uzupełniając z zastosowaniem polimerazy Klenowa. Właściwą amplifikację wszystkich produktów PCR potwierdzano przez cykle sekwencjonowania (MWG Biotech) i porównanie z opublikowaną sekwencją szczepu NS80567 EHV-4 (Telford i in., 1998). Rekombinację do EHV-4 wykonywano stosując linię komórkową Vero-gM i przeprowadzano kotransfekcję albo plazmidu pgm4β+, albo pgm4gfp+ (fig. 3B) z DNA EHV-4 w celu utworzenia pierwszej generacji gm-negatywnych EHV-4 (fig. 3C). Plazmid pgm4w (fig. 3B) w połączeniu z DNA gm- -negatywnego EHV-4 dawał w wyniku E4ΔgM-w (fig. 3D). Wreszcie naprawione pod względem gm EHV-4, E4RgM (fig. 3A) wyizolowano po kotransfekcji plazmidu pgm4r (fig. 3B) z DNA E4ΔgM-GFP do komórek Vero. DNA EHV-4, E4RgM, E4ΔgM-w i E4ΔgM-GFP trawiono Pstl, EcoRV lub Hindlll i fragmenty DNA przenoszono techniką blottingu na membrany nylonowe. Równoległe membrany poddawano następnie hybrydyzacji albo z sekwencjami specyficznymi wobec GFP (identycznie jak przedstawiono na fig. 2) albo z sondą, nazwaną gm3.1, zawierającą sekwencje specyficzne wobec EHV-4 pobrane z plazmidu pgm4r (fig. 3B). Uzyskane wyniki trawienia (fig. 4) były następujące: (i) Na DNA E4ΔgM-GFP sonda GFP rozpoznała fragment przy bp, po trawieniu Pstl, przy bp, po trawieniu EcoRV i przy bp po trawieniu Hindlll. Identyczne fragmenty plus fragmenty przy bp (Pstl), bp (EcoRV) i 826 plus bp (Hindlll) reagowały z sondą gm3.1. (ii) Ani rodzicielski EHV-4 ani naprawiony wirus E4RgM czy E4ΔgM-w nie zawierały żadnych sekwencji specyficznych dla GFP. (iii) Fragmenty DNA reaktywne wobec gm3.1 w EHV-4 i E4RgM wykryto przy, odpowiednio, bp (Pstl), bp plus bp (EcoRV) i plus bp (Hindlll). (iv) Wirus E4ΔgM-w, negatywny pod względem kasetki gm i GFP nie hybrydyzował z sekwencjami GFP ale z odpowiadającymi sekwencjami specyficznymi dla EHV-4 (gm3.1). Te ostatnie fragmenty wykryte przez sondę były pozbawione 1110 bp sekwencji gm kiedy porównywano je do wirusa typu dzikiego, tj., odpowiednio, przy bp (Pstl), przy bp plus bp (EcoRV) i przy bp plus bp (Hindlll). Na DNA trawionym Hindlll wszystkich tych wirusów obecny był inny specyficzny wobec sondy gm3.1 fragment przy 126 bp (fig. 2C) ale był on za mały do wykazania na tym biocie Southern. Wirusy E4ΔgM-GFP i E4ΔgM-w straciły swoją zdolność do ekspresji gm i ponadto E4ΔgM-w stracił sekwencję genu markerowego. a) Wzrost wirusa na hodowlach komórkowych. Charakterystyki wzrostu wirusa różnych mutantów wirusa- jak szczegółowo opisano powyżej- porównywano na komórkach Vero i Vero-gM. Komórki wysiane w 24-studzienkowych płytkach infekowano przy MOI wynoszącym 1-2 i określano zewnątrzkomórkowe (infekcyjność zewnątrzkomórkowa) i wewnątrzkomórkowe (infekcyjność wewnątrzkomórkowa) miana wirusa w różnych punktach czasowych po infekcji (fig. 5). Podczas gdy charakterystyka wzrostu naprawionego wirusa E4RgM odpowiadała dobrze

16 16 PL B1 tej EHV-4, wystąpiło zaskakujące hamowanie wytwarzania zewnątrzkomórkowych mian wirusa E4ΔgM-w i E4ΔgM-GFP na niekomplementujących komórkach. W tej serii doświadczeń (średnia z dwóch niezależnych doświadczeń) infekcyjność zewnątrzkomórkowa mogła nigdy nie zostać wykryta przed 24 godzinami po infekcji. Nawet w 30 godzinie po infekcji obserwowano zewnątrzkomórkowo tylko bardzo niskie miana (maksymalnie 1,5 łysinki/ml przy najniższym rozcieńczeniu 10-1 ), chociaż w komórkach widoczne były poważne efekty cytopatyczne. Różnice w infekcyjności wewnątrzkomórkowej jednakże, nigdy nie osiągały 100-krotności i jej pik miał miejsce 24 godziny po infekcji (84-razy pomiędzy EHV-4 i E4ΔgM-w). Opóźnienie w wykrywaniu infekcyjności wewnątrzkomórkowej wystąpiło tylko w jednym punkcie (12 godzin wobec 15 godzin po infekcji). Podsumowując, niespodziewanie wykazano, że delecją sekwencji gm EHV-4 znacząco wpływa na replikację wirusa in vitro, ale ekspresja gm nie jest zasadnicza dla replikacji. Szczególnie zmniejszała się zewnątrzkomórkowa infekcyjność wirusa i zdolność do bezpośredniego infekowania sąsiadujących komórek była osłabiona - co odzwierciedlały wielkości łysinek. b) Wielkość łysinek. Mierzono średnice 150 łysinek po infekcji komórek Vero lub Vero-gM EHV-4, E4RgM, E4ΔgM-w lub E4ΔgM-GFP i określano średnią wielkość łysinek w stosunku do wielkości łysinek typu dzikiego, którą przyjmowano jako 100%. Wyraźnie wykazano, że gm-negatywne wirusy były zdolne do infekowania i replikacji w komórkach Vero ale maksymalne średnice łysinek były znacząco zmniejszone, do mniej niż 20% średnicy łysinek typu dzikiego (fig. 6). Infekcja wirusami rodzicielskimi lub naprawionymi dawała wygląd łysinek podobny do wyglądu łysinek typu dzikiego, wskazując, że obserwowany fenotyp był naprawdę indukowany przez delecję gm. Dodatkowo potwierdzał to fakt, że tworzenie łysinek E4ΔgM-w i E4ΔgM-GFP było w pełni przywrócone na linii komórek Vero-gM (wyniki nieprzedstawione). c) Doświadczenia dotyczące penetracji. W tym doświadczeniu oceniano wpływ gm EHV-4 na parametry kinetyczne wejścia EHV PFU różnych wirusów, rodzicielskiego EHV-4, naprawionego pod względem gm wirusa E4RgM, jak również mutantów z delecją gm oraz E4ΔgM-GFP (fig. 3), umożliwiono adsorbcję w temperaturze 4 C na komórkach Vero w 6-studzienkowych płytkach. Po 90 minutach, odpowiednie innokula zastąpiono świeżym podłożem i penetrację zainicjowano przez zmianę temperatury inkubacji na 37 C. W różnych czasach po zmianie temperatury - rozpoczynając natychmiast (= 0 minut) - infekcyjność zewnątrzkomórkowa inaktywowano ph przez traktowanie komórek buforem cytrynianowym (ph 3,0). Równoległe próbki przemywano, ale bufor cytrynianowy zastępowano PBS tak, że w każdym punkcie czasowym można było porównywać infekcyjność adsorbowaną z infekcyjnością, która uległa penetracji. Liczbę łysinek określano po inkubacji komórek w ciągu czterech dni. c) Przeprowadzono kilka zestawów doświadczeń: Na fig. 7A przedstawiono wyniki dla genotypowo i fenotypowo gm-negatywnych wirusów po namnażaniu na niekomplementujących komórkach Vero, podczas gdy fig. 7B przedstawia kinetyki komplementowanych fenotypowo E4ΔgM-w i E4ΔgM- -GFP, jako wirusów hodowanych na komórkach Vero-gM, w których zachodzi ekspresja gm. Średnio 52,8% (56,7%) infekcyjności rodzicielskiego EHV-4 (E4RgM) uniknęło zewnątrzkomórkowego traktowania kwasem w 40 minucie po rozpoczęciu penetracji (fig. 7A, puste kółka) podczas gdy tylko 33,7% (E4ΔgM-w - pełne prostokąty) i 38,5% (E4AgM-GFP - pełne trójkąty) gm-negatywnych wirusów. W późniejszych punktach czasowych kinetyki wejścia różne wykresy zaczynają różnie na siebie nachodzić i maksymalną wydajność penetracji, wynoszącą pomiędzy 61,7% a 78,9%, osiąga się po 150 minutach czasu penetracji wskazując, że pewną zmienność oznaczeń można tłumaczyć obserwowanymi niewielkimi różnicami. (Fig. 7A) Jeśli gm-negatywne wirusy przygotowywano na komplementujących komórkach Vero- -gm nie obserwowano żadnych różnic w ich wydajności penetracji (7B). W przeciwieństwie do opóźnienia parametrów kinetycznych wejścia gm-negatywnych EHV-1 o około od 20% (szczep RacLll, Osterrieder i in., 1996) do 40% (szczep KyA, Seyboldt i in., 2000), na wpływ delecji gm EHV-4 trzeba spojrzeć z rezerwą. Niemniej jednak można wyciągnąć następujące wnioski: (i) Obserwowano różnice w parametrach kinetycznych komplementowanych i niekomplementowanych fenotypowo wirusach gm-negatywnych (fig. 7A-B) ale (ii) wpływ delecji gm na penetrację EHV-4 jest właściwie niewykrywalny. P r z y k ł a d 3 Analiza surowic końskich pod kątem przeciwciał skierowanych przeciw gm z zastosowaniem testów serologicznych specyficznych dla gm

17 PL B1 17 W celu ustalenia czy gm można stosować, jako marker serologiczny do rozróżniania infekcji typu dzikiego od szczepienia szczepionką gm-negatywną, trzeba było sprawdzić kilka założeń. Najpierw, trzeba było sprawdzić czy surowice koni zainfekowanych wirusem typu dzikiego zawierają przeciwciała specyficzne wobec gm. Do wstępnej analizy wybrano test przez blotting Western, ponieważ ten układ umożliwia identyfikację specyficznej reakcji wobec reaktywności tła. Stosując wysoce neutralizujące surowice (miana neutralizujące EHV-1 i/lub -4 pomiędzy 1:128 i 256), ustalono (wyniki nieprzedstawione), że lizaty linii komórkowej ccgm, w której zachodzi ekspresja gm EHV-1 umożliwiają detekcję specyficznego sygnału przez surowice końskie i, że rozcieńczenie surowic do 1:3000 wydaje się pracować najlepiej. Konsekwentnie, surowice wszystkich 12 źrebiąt (6 szczepionych i 6 kontrolnych), które uczestniczyły w próbie szczepionki gm EHV-1, analizowano pod względem reaktywności gm przez blotting Western. W przypadku każdego indywidualnego konia testowano trzy różne surowice: pobrane przed wejściem do próby (Pre), 4 tygodnie po drugim szczepieniu (V2) i dwa tygodnie po prowokacji przez infekcję (C), odpowiednio. Podsumowując blotty analiz Western (fig. 9) wykazano, że (i) surowice koni wykazujących aktywność neutralizującą EHV-1, wszystkie okazały się pozytywne dla gm, (ii) reaktywności wobec gm nigdy nie wykrywano w żadnej analizowanej próbce przed znanym kontaktem z EHV-1 lub po szczepieniu gm-negatywnym EHV-1, oraz (iii) po infekcji prowokacyjnej wirusem gm-pozytywnym koni biorących udział w próbie szczepionki, gm było wyraźnie wykrywalne w 10 na 12 przypadków. Wreszcie (iv) zaobserwowano, że miana przeciwciał skierowanych przeciw EHV-1 i intensywność reaktywności gm wydają się nie być bezpośrednio skorelowane. Z powodu wysokiej reaktywności tła surowic końskich, opracowanie testów serologicznych jest trudne. W oparciu o wyniki immunofluorescencji pośredniej (HF) dla surowic końskich potwierdzono, że trzeba opracować albo pośrednie albo blokujące układy testowe lub w teście ELISA trzeba stosować wysoce oczyszczone polipeptydy gm. W tym celu opracowano ELISA. Oczyszczone polipeptydy gm lub kompletne gm immobilizowano na nośniku stałym, 96-studzienkowej płytce, którą poleczono dla zapewnienia dobrego przyłączania wychwytywanego białka. Dla oznaczenia miejsca niespecyficznego wiązania blokowano albo mlekiem w proszku albo podobnymi substancjami, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu. Następnie, powierzchnie plastykowe przemywano odpowiednim buforem przemywającym (np. PBS-Tween) w celu usunięcia nadmiaru czynnika blokującego. Następnie do wybranych studzienek dodawano badane próbki i płytki do ELISA inkubowano w temperaturze 37 C zgodnie z wystandaryzowanymi metodami, umożliwiając przeciwciałom w badanej próbce wiązanie się z immobilizowanym białkiem wychwytującym. W następnym etapie studzienki płytki do ELISA przemywano dokładnie buforem przemywającym a następnie dodawano odpowiednie przeciwciało skierowane przeciw przeciwciałom końskim sprzężone z enzymem takim jak HRP (peroksydaza chrzanowa). Wykrywanie związanego koniugatu przeciwciało/hrp przeprowadzano ostatecznie przez dodawanie odpowiedniego substratu a następnie fotometryczny odczyt gęstości optycznej pojedynczych studzienek. Otrzymane wartości porównywano z kontrolami pozytywnymi i negatywnymi wykonywanymi w tym samym oznaczeniu. P r z y k ł a d 4 Identyfikacja gm EHV-4 Chociaż obliczono, że przewidywana sekwencja aminokwasowa gm EHV-4 jest w 86,7% identyczna z sekwencją gm EHV-1 (Telford i in., 1998), skierowane przeciw gm EHV-1 przeciwciało monoklonalne 13B2 (Allen i Yeargan, 1987) specyficznie reaguje w blottingu Western tylko z białkiem specyficznym wobec typu (Crabb i in., 1991). Aby mimo to zidentyfikować w tym badaniu homolog EHV-4, testowano inne przeciwciała skierowane przeciw gm EHV-1 (Seyboldt i in., 2000; Day, 1999) na oczyszczonych wirionach EHV-4, na lizatach komórek zainfekowanych EHV-4 lub na lizatach komórek Vero-gM. Te ostatnie są rekombinowaną linią komórkową opracowaną do syntetyzowania gm EHV-4 pod kontrolą promotora IE-HCMV. Reaktywność wszystkich przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciw gm EHV-1 przeciw gm EHV-4 była poniżej granicy wykrywalności przez Western blotting, podczas gdy równoległe próbki EHV-1 były zawsze bez trudu reaktywne (wyniki nieprzedstawione). Jedynie poliklonalna surowica odpornościowa, którą wytworzono w królikach, skierowana przeciw wyznakowanemu His polipeptydowi pochodzącemu od gm EHV-1 (aminokwasy ; Seyboldt i in., 2000), reagowała z heterologicznym gm wystarczająco silnie tak aby umożliwić identyfikację gm EHV-4 (fig. 10A). Stosując to przeciwciało obserwowano w oczyszczonych wirionach EHV-4 specyficzną reaktywność przy Mr około do Zgodnie z jego przewidywanymi właściwościami

18 18 PL B1 hydrofobowymi, wykryte białko gm ulega agregacji po gotowaniu. W przeciwieństwie, postać gm ulegająca ekspresji w rekombinowanych komórkach Vero-gM głównie biegnie przy Mr około do 48000, wskazując, że białka gm EHV-4 są procesowane podobnie, jak przedstawiono dla EHV-1 (Osterrieder i in., 1997, Rudolph i Osterrieder, 2002). Przeprowadzono kilka doświadczeń, aby zanalizować fenotyp delecji gm w EHV-4. W celu porównania ekspresji innych glikoprotein, lizaty komórek Vero zainfekowanych EHV-4, E4RgM, E4AgM-w lub E4ΔgM-GFP poddawano analizie przez blotting Western. Wykazano, że delecją gm nie wpływa na wytwarzanie późnych białek gb lub gd, wskazując, że delecją nie wpływa zasadniczo na wczesne etapy replikacji wirusa. W innym doświadczeniu przez analizę preparatów wirionów typu dzikiego, naprawionych lub obu z delecją gm EHV-4 wykazano, że żadna reaktywność gm nie była wykrywalna w wirusach negatywnych pod względem gm, podczas gdy białko wykazywało bez trudu reaktywność w wirionach kontrolnych. Obecność wirionów w odpowiednich preparatach wykazano w równoległych blottach testowanych przeciw gb (fig. 10B).

19 PL B1 19 Lista sekwencji <110> Boehringer Ingelheim Yetmedica GmbH <120> gm-negatywne mutanty EHV bez elementów heterologicznych <130> Case 1/1372-PCT <140> PCT7EP03/07730 <141> <150> DE <151> <160> 8 <170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> 5' starter <400> 1 28 gcctctagat taacggtaat ctctgcgc <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> 5'starter <400> 2 aatctgcagg tagctacggc ctatg 25 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> 5'starter <400> 3 ccggatccct accagagacc cataa 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> 5' starter <400> 4 25 aatctgcagg tagctacggc ctatg <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> 3'starter <400> 5 24 aaggatccat ggcacgacgt ggcg

20 20 PL B1 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> 3' starter <400> 6 25 aagaattccc gcaatacgtc cgtcc <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> 3'starter <400> 7 25 aagaattccc gcaatacgtc cgtcc <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> 3'starter <400> 8 27 ttaagtcgac atttgaatag aaactcg

21 PL B1 21 Zastrzeżenia patentowe 1. Koński herpeswirus (EHV), w którym nieobecne jest białko gm, znamienny tym, że EHV jest wolny od elementów heterologicznych. 2. EHV według zastrz. 1, znamienny tym, że usunięto gen kodujący dla białka gm. 3. EHV według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że otrzymuje się go sposobem obejmującym etapy a) izolowania EHV typu dzikiego; b) przygotowywania plazmidu kodującego gen gm EHV, ewentualnie z sekwencjami flankującymi; c) wytwarzania komplementującej linii komórkowej, w której zachodzi ekspresja gm lub jego części; d) przygotowywania wirusa EH zawierającego wstawkę kasetki kodującej GFP w jego sekwencji kodującej gm przez ko-transfekcję komplementującej linii komórkowej z etapu b) kwasem nukleinowym EHV i plazmidem kodującym gm, który jest przerwany wstawką kasetki kodującej GFP; e) delecji kasetki kodującej GFP; i f) selekcji pod względem klonów EHV, z których z powodzeniem usunięto kasetkę kodującą GFP. 4. EHV według któregokolwiek z zastrz. 1 do 3, znamienny tym, że jest to EHV EHV-1 według zastrz. 4, znamienny tym, że usunięto bp otwartej ramki odczytu gm. 6. EHV-1 według zastrz. 4 albo 5, znamienny tym, że usunięto całą sekwencję kodującą gm, za wyjątkiem bp sekwencji kodującej część C-końcową i za wyjątkiem bp sekwencji kodującej część N-końcową. 7. EHV-1 według któregokolwiek z zastrz. 4 do 6, znamienny tym, że usunięto nukleotydy do sekwencji kodującej gm, przy czym pozycje nukleotydów odpowiadają pozycjom nukleotydów sekwencji EHV według Telforda (1992). 8. EHV-1 według któregokolwiek z zastrz. 5 do 7, znamienny tym, że usunięto nukleotydy do sekwencji kodującej gm, przy czym pozycje nukleotydów odpowiadają pozycjom nukleotydów sekwencji EHV według Telforda (1992). 9. EHV-1 według któregokolwiek z zastrz. 5 do 8, znamienny tym, że usunięto całą sekwencję kodującą gm, za wyjątkiem 184 bp sekwencji kodującej część C-końcową i za wyjątkiem 209 bp sekwencji kodującej część N-końcową. 10. EHV-1 według któregokolwiek z zastrz. 5 do 9, znamienny tym, że usunięto nukleotydy do sekwencji kodującej gm, przy czym pozycje nukleotydów odpowiadają pozycjom nukleotydów sekwencji EHV według Telforda (1992). 11. EHV-1 według któregokolwiek z zastrz. 5 do 10, znamienny tym, że jest wariantem rekombinacyjnym opartym na szczepie RacH EHV EHV-1, znamienny tym, że jest to izolat HAgM-w, zdeponowanym w ECACC/CAMR 16 października 2002 roku pod numerem dostępu EHV według któregokolwiek z zastrz. 1 do 3, znamienny tym, że jest to EHV EHV-4 według któregokolwiek z zastrz. 1 do 3 albo 13, znamienny tym, że usunięto bp otwartej ramki odczytu gm. 15. EHV-4 według zastrz. 13 albo 14, znamienny tym, że usunięto całą sekwencję kodującą gm, za wyjątkiem 0-50 bp sekwencji kodującej część C-końcową i za wyjątkiem bp sekwencji kodującej część N-końcową. 16. EHV-4 według któregokolwiek z zastrz. 13 do 15, znamienny tym, że usunięto nukleotydy do sekwencji kodującej gm, przy czym pozycje nukleotydów odpowiadają pozycjom nukleotydów sekwencji EHV według Telforda (1998). 17. EHV-4 według któregokolwiek z zastrz. 13 do 16, znamienny tym, że usunięto nukleotydy do sekwencji kodującej gm, przy czym pozycje nukleotydów odpowiadają pozycjom nukleotydów sekwencji EHV według Telforda (1998). 18. EHV-4 według któregokolwiek z zastrz. 13 do 17, znamienny tym, że usunięto całą sekwencję kodującą gm, za wyjątkiem 34 bp sekwencji kodującej część C-końcową i za wyjątkiem 209 bp sekwencji kodującej część N-końcową. 19. EHV-4 według któregokolwiek z zastrz. 13 do 18, znamienny tym, że usunięto nukleotydy do sekwencji kodującej gm, przy czym pozycje nukleotydów odpowiadają pozycjom nukleotydów sekwencji EHV według Telforda (1998).

22 22 PL B1 20. EHV-4, znamienny tym, że jest to izolat E4AgM-w, zdeponowanym w ECACC/CAMR 14 stycznia 2003 roku pod numerem dostępu Kwas nukleinowy, znamienny tym, że koduje EHV z któregokolwiek z zastrz. 1 do Preparat szczepionki, znamienny tym, że zawiera EHV z któregokolwiek z zastrz. 1 do 20 lub zawiera, co najmniej jednego EHV-1 z zastrz. 1 do 12 i jednego EHV-4 z zastrz. 13 do Preparat szczepionki, znamienny tym, że zawiera kwas nukleinowy określony w zastrz Zastosowanie EHV z któregokolwiek z zastrz. 1 do 20, do wytwarzania leku do profilaktyki i/lub leczenia infekcji związanych z EHV lub co najmniej jednego EHV-1 z zastrz. 1 do 12 i jednego EHV-4 z zastrz. 13 do 20, do wytwarzania leku do profilaktyki i/lub leczenia infekcji związanych z EHV. 25. Zastosowanie kwasu nukleinowego opisanego w zastrz. 21, do wytwarzania leku do profilaktyki i/lub leczenia infekcji związanych z EHV. 26. Sposób otrzymywania rekombinowanego EHV określonego w zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje etapy a) izolowania EHV typu dzikiego; b) przygotowywania plazmidu kodującego gen gm EHV, ewentualnie z sekwencjami flankującymi; c) wytwarzania komplementującej linii komórkowej, w której zachodzi ekspresja gm lub jego części; d) przygotowywania wirusa EH zawierającego wstawkę kasetki kodującej GFP w jego sekwencji kodującej gm przez kotransfekcję komplementującej linii komórkowej z etapu b) kwasem nukleinowym EHV i plazmidem kodującym gm, który jest przerwany wstawką kasetki kodującej GFP; e) delecji kasetki kodującej GFP; i f) selekcji pod względem klonów EHV, z których z powodzeniem usunięto kasetkę kodującą GFP. 27. Linia komórkowa komplementująca gm, znamienna tym, że jest to linia VERO GM, zdeponowana w ECACC/CAMR 28 stycznia 2003 roku pod numerem dostępu

23 PL B1 23 Rysunki

24 24 PL B1

25 PL B1 25

26 26 PL B1

27 PL B1 27

28 28 PL B1

29 PL B1 29

30 30 PL B1

31 PL B1 31