(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP02/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP02/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO03/ (13) B1 (51) Int.Cl. C12N 7/02 ( ) A61K 35/76 ( ) A61K 39/285 ( ) A61P 31/12 ( ) (54) Sposób namnażania wirusa (30) Pierwszeństwo: , DK, PA (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 03/05 (73) Uprawniony z patentu: BAVARIAN NORDIC A/S, Kvistgaard, DK (72) Twórca(y) wynalazku: PAUL HOWLEY, Martinsried, DE KARL HELLER, Unterföhring, DE INGMAR RÄTHE, Monachium, DE (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 06/10 (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Witek Rafał KANCELARIA RZECZNIKÓW PATENTOWYCH Spółka Partnerska PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Niniejszy wynalazek dotyczy procesu otrzymywania wirusa ospy, w szczególności wirusa ospy kręgowców - Chordopoxvirinae, przy czym wspomniany wirus ospy hodowany jest w temperaturze niższej niż 37 C. Proces prowadzi do wzrostu poziomu namnażania wirusa w obniżonej temperaturze. Stan techniki Grupa wirusów należących do Poxviridae obejmuje liczną rodzinę złożonych wirusów DNA, replikujących w cytoplazmie komórek kręgowców i bezkręgowców. Rodzinę Poxviridae można podzielić na dwie podrodziny - Chordopoxvirinae (wirusy ospy kręgowców) i - Entomopoxvirinae (owadzie wirusy ospy) (Fields Virology/wyd.: Fields, B.N., Knipe, D.M., Howley, PM; wyd.3/isbn / patrz w szczególności rozdział 83). Podrodzina Chordopoxvirinae obejmuje liczne zwierzęce wirusy ospy (podzielone na odmienne rodzaje), takie jak wielbłądzie wirusy ospy, wirus ospy owiec, wirus ospy kóz lub wirusy ospy ptaków, w szczególności wirus ospy drobiu, jak również wirusy ospy dotyczące ludzi, tak jak wirus ospy (variola) i wirus krowianki. Wirusy ospy, w szczególności Chordopoxvirinae, są istotnymi patogenami ludzi i zwierząt. Historia szczepień przeciwko infekcjom wirusami ospy jest długa. Niemal dwa wieki temu, rozpoczęto profilaktycznie szczepienia ludzi ospą krowią mające na celu nadanie odporności przeciwko tej chorobie. W późniejszym okresie do immunizacji wykorzystywano wirusa krowianki. Jednakże, szczepienia tym wirusem powodowały czasami poważne komplikacje, takie jak poszczepienne zapalenie mózgu, uogólnioną krowiankę lub zakażenie kontaktowe. W późniejszych latach, Anton Mayr wprowadził nową szczepionkę niepowodującą takich komplikacji. Szczepionka na ospę zawierała wirus ospy - zmodyfikowany wirus krowianki Ankara (MVA) i została zastosowana do szczepień przeciwko ospie w około przypadkach szczepień bez wywołania jakichkolwiek powikłań związanych ze szczepieniem. Nawet dzieci wykazujące niedobór odporności nie przejawiały poważnych efektów ubocznych. MVA uzyskano w wyniku mutacji i selekcji oryginalnego wirusa Ankara po 575 pasażach w hodowli fibroblastów embrionów kurcząt. Bezpieczeństwo tak otrzymanego MVA odzwierciedla jego charakterystyka biologiczna, chemiczna i fizyczna. MVA posiada zredukowaną masę cząsteczkową sześć delecji w genomie i jest silnie atenuowany wobec komórek ssaczych, tj., syntetyzuje DNA i białka, ale nie są produkowane z nich żadne cząsteczki wirusa. Szczepienia przeciwko ospie zostały zakończone sukcesem. W 1979, Światowa Organizacja Zdrowia ogłosiła wyeliminowanie ospy. Zgodnie z tą deklaracją zaniechano masowych szczepień dzieci a szczepieniami objęto jedynie pracowników laboratoriów i sił zbrojnych w określonych krajach. Wraz z wyeliminowaniem ospy, usunięto główną przyczynę infekcji wirusami ospy u ludzi. Jednakże, pewne, inne niż ludzkie, wirusy ospy obniżyły swoją specyficzność wobec gospodarza, tj., mogą wywoływać infekcję nie tylko u typowego dla nich gospodarza (np., u krowy dla wirusa ospy krowiej), ale również u innych zwierząt (np., u szczurów i kotów). Tą drogą mogą zostać zainfekowani również ludzie. Ponieważ pewna część populacji nie posiada już odporności przeciwko ospie, mogą okazać się niebezpiecznymi dla nich infekcje wirusami ospy różnych gatunków zwierząt. Zwierzęta domowe są głównym źródłem infekcji u ludzi. Zgodnie z powyższym, rośnie znaczenie szczepienia zwierząt domowych przeciwko wirusom ospy. Ponadto, wirusy ospy są istotnymi wektorami ekspresji obcych genów, np., do zastosowania, jako szczepionka lub do wykorzystania w terapii genowej, tj., do przeniesienia sekwencji kwasu nukleinowego do docelowej komórki, w której ulega ekspresji. Z przytoczonych tu informacji wynika jasno potrzeba wynalezienia wydajnego i efektywnego pod względem kosztów sposobu produkcji wirusów ospy. Wirusy ospy mogą być amplifikowane w różnych typach komórek. Na przykład, Chordopoxvirinae, szczególnie MVA ulegają powieleniu w kulturach komórkowych pierwotnych lub drugorzędowych płodowych fibroblastów kurcząt (CEF). Komórki uzyskiwane są z jaja zawierającego embrion kurczęcia, inkubowanego przez 10 do 12 dni. Następnie, komórki embrionalne są oddzielane i oczyszczane. Tego typu komórki pierwotne mogą zostać użyte bezpośrednio lub, po jeszcze jednym pasażu komórkowym, jako drugorzędowe komórki. Następnie, pierwotne lub drugorzędowe komórki CEF infekowane są MV A. W celu uzyskania amplifikacji MV A, zainfekowane komórki inkubowane są przez 2-3 dni w 37 C (patrz, np., Meyer, H. i wsp., 1991; J. of General Virology 72, ; Sutter i wsp. 1994, Vaccine, Vol.l2, nr 11, ). Mimo że inne wirusy kręgowców - Chordopoxvirinae amplifikowane są w różnych typach komórek, we wspomnianych przypadkach wybrano taką samą temperaturę 37 C.

3 PL B1 3 Na przykład, wirus krowianki możliwy do uzyskania z ATCC (Nr VR1354), hodowany w komórkach HeLa S3 (ludzkie komórki raka szyjki macicy) jest również inkubowany przez 3 dni w 37 C (Current protocols in molecular biology 1998, rozdz. 16, podrozdz , John Wiley & Sons, Inc.). Ponadto, wirusy MVA przystosowane do wzrostu w komórkach Vero (komórki nerki małpy) również ulegają powieleniu w 37 C (PCT/EPO1/02703). Zgodnie z powyższym, niezależnie od komórek zastosowanych do amplifikacji i od postaci gatunku czy szczepu wirusa Chordopoxvirinae, amplifikacja wirusów zachodzi w 37 C. Tak wybrana temperatura odpowiada całkowicie ogólnej wiedzy specjalistów w dziedzinie: wirusy ospy, obecnie niemal wyłącznie namnażane w laboratoriach, uzyskiwane są ze zwierząt ciepłokrwistych o temperaturze ciała w przybliżeniu 37 C. Ze względu na takie przystosowanie Chordopoxvirinae do wzrostu w organizmie tych zwierząt, wirusy te uległy adaptacji do wzrastania w 37 C, tj., powinny amplifikować wydajniej w 37 C. Z podobnych powodów wirusy owadzie - Entomopoxvirinae hodowane są w temperaturach niższych niż 37 C: temperatura ciała owadów jest znacznie niższa niż 37 C i zależy od szerokiego zakresu temperatury środowiska. Zatem, inaczej niż w przypadku Chordopoxvirinae, Entomopoxvirinae przystosowane są do wzrostu w niższych temperaturach. W US 5,721,352 i US 5,174,993 ujawniono temperaturę optymalną dla wzrostu w warunkach laboratoryjnych Entomopoxvirinae gatunku Amsacta moorei Entomopoxvirus (AmEPV), wynosiła ona 28 C. Jednakże, wspomniane zgłoszenia patentowe nie ujawniają zasad hodowli Chordopoxvirinae w takich warunkach temperaturowych. Ponadto, produkcja szczepionek przeciwko innym infekcjom wirusowym przebiega ogólnie w 37 C. Jedynie kilka szczepionek na odrę otrzymywanych jest w niższej temperaturze. W tym przypadku, szczepionka na odrę, która początkowo była produkowana w 37 C, powodowała często poważne efekty uboczne, została, zatem, poddana atenuacji poprzez ciągłe pasażowanie wirusa w 32 C. Atenuację, tj., znaczne obniżenie zdolności wywoływania choroby przez wirusa, osiągnięto po 85 pasażach w 32 C (Plotkin, Orenstain:Vaccines, wyd. 3, ). Podsumowując, oczekuje się, że wirusy zwierząt ciepłokrwistych, a szczególnie wirusy krowianki, będą ulegać amplifikacji wydajniej w 37 C, ponieważ pochodzą one ze zwierząt o wspomnianej temperaturze ciała i przystosowanie do niższej temperatury osiągane jest jedynie po szeregu pasaży we wspomnianej niższej temperaturze. Ponadto, przystosowanie do niższej temperatury związane jest z atenuacją a zatem często z obniżeniem zdolności do reprodukcji wirusa. W US 5,616,487 ujawniono proces otrzymywania stabilizowanego wirusa, w szczególności stabilizowanego retro wirusa, poprzez hodowlę komórek produkujących wirusa wraz z czynnikiem stabilizującym, w temperaturze poniżej 37 C. Czynnikami stabilizującymi są lipidy lub surfaktanty. W patencie ujawniono specyficznie zastosowanie, jako czynnika stabilizującego Pluronic F-68 i koncentratu lipidowego. Nadmieniono, że koncentrat lipidowy zawierał cholesterol, olej wątroby dorsza, Pluronic F-68, octan d-alfa-tokoferolu i Tween 80. W alternatywnym rozwiązaniu, US 5,616,487 ujawniono proces hodowli komórek produkujących specyficzne retrowirusy w temperaturze niższej niż 37 C, przy czym otrzymywany wirus był stabilizowany przy użyciu zdefiniowanego wyżej stabilizatora. Istota wynalazku. Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania wirusa ospy kręgowców - Chordopoxvirinae, charakteryzujący się tym, że wirus namnażany jest w podłożu wzrostowym w hodowli o temperaturze około 35 C lub poniżej 35 C, przy czym wirus ospy kręgowców - Chordopoxvirus wybrany jest zmodyfikowanym wirusem krowianki Ankara (MVA), korzystnie MVA-BN, zdeponowanym w ECACC pod numerem V lub jego pochodnej. Korzystnie, wirus ospy namnażany jest w komórkach fibroblastów embrionów kurcząt. Równie korzystnie, wirus ospy kręgowców - Chordopoxvirus namnażany jest w hodowli o temperaturze od około 26 C do około 35 C. Równie korzystnie, wirus namnażany jest w fibroblastach embrionów kurcząt w temperaturze hodowli wynoszącej od około 26 C do około 32 C. Korzystnie, wirus ospy kręgowców - Chordopoxvirus wybrany jest z grupy obejmującej Avipoxvirus i Orthopoxvirus, przy czym korzystnie Orthopoxvirus jest wirusem krowianki, szczególnie korzystnie wirus krowianki wybrany jest ze szczepu Elstree i zmodyfikowanego wirusa krowianki Ankara (MVA), korzystnie MVA-BN, zdeponowanego w ECACC pod numerem V lub jego pochodnej. Równie korzystnie, wirus ospy kręgowców - Chordopoxvirus namnażany jest w hodowli o temperaturze od około 28 C do około 35 C. Równie korzystnie, wirus ospy kręgowców- Chordopoxvirus namnażany jest w hodowli o temperaturze około 30 C. Równie korzystnie, że namnażanie wirusa przebiega przez okres, co najmniej 24 godzin, przy czym szczególnie korzystnie namnażanie wirusa przebiega, przez co najmniej 2 do 3 dni. Równie korzystnie, wirus ospy kręgowców -Chordopoxvirus jest wirusem użytecznym, jako szczepionka lub terapeutyczny wektor genowy. Równie korzystnie, przebiega

4 4 PL B1 w nieruchomych kolbach. Równie korzystnie, wirus ospy jest niewrażliwym na temperaturę mutantem wirusa. Równie korzystnie, wirus ospy jest nieatenuowanym temperaturowo wirusem. Równie korzystnie, do podłoża hodowlanego nie dodaje się żadnych dodatkowych lipidów ani surfaktantów. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie wirusa otrzymywanego sposobem według wynalazku określonym powyżej do wytwarzania kompozycji. Korzystnie, wytwarzana kompozycja jest szczepionką. Równie korzystnie, wytwarzana kompozycja jest szczepionką przeznaczoną do stosowania w terapii genowej. Celem niniejszego wynalazku było zapewnienie sposobu otrzymywania wirusów ospy, w szczególności wirusa podrodziny Chordopoxvirus, przy założeniu, że hodowla komórek produkujących wirus przebiega w temperaturze poniżej 37 C. Zaskakującym okazało się, że sposób według wynalazku prowadzi do znacznie wydajniejszej amplifikacji wirusa w niższej temperaturze (poniżej 37 C), co z kolei pozwala na osiągnięcie wyższej wydajności wirusa w stosunku do liczby zainfekowanych komórek. Zgodnie z powyższym, mniejsza liczba komórek wymagana jest do otrzymania tej samej ilości wirusa. Jest to szczególnie korzystne w przypadku zmodyfikowanego wirusa krowianki Ankara (MVA), ponieważ produkcja komórek CEF wymaganych do amplifikacji MVA jest pracochłonna i kosztowna. Ponadto, obniżenie temperatury inkubacji pozwala na oszczędność energii podczas procesu powielania (amplifikacji) wirusa ospy, a zatem wpływa na obniżenie kosztów produkcji wirusów. Termin wirus ospy, stosowany w niniejszym opisie dotyczy korzystnie wirusów ospy podrodziny Chordopoxvirinae (wirusy ospy kręgowców) (Fields Virology/wyd.: Fields, B.N., Knipe, D.M., Howley, P.M.; wyd.3/isbn / w szczególności rozdział 83). Określenie Chordopoxvirus, Chordopoxvirinae i wirusy ospy kręgowców stosowane są zamiennie w niniejszym opisie. Korzystnymi wirusami Chordopoxvirinae są wirusy ospy rodzaju Orthopoxvirus, Parapoxvirus, Avipoxvirus, Capripoxvirus, Lepripoxvirus, Suipopoxvirus, Molluscipoxvirus i Yatapoxvirus. Bardziej korzystnymi są wirusy ospy rodzaju Orthopoxvirus i Avipoxvirus. W korzystnej realizacji, wirus ospy, otrzymywany ujawnionym sposobem, jest wirusem ospy, w szczególności podrodziny Chordopoxvirinae, użytecznym, jako szczepionka lub znajdującym zastosowanie, jako wektor w terapii genowej, wprowadzający odpowiednie geny do komórki gospodarza. Specjalistom w dziedzinie znane są odpowiednie szczepy wirusowe. Tego typu odpowiednie szczepy mogą być uzyskane z np., Amerykańskiej Kolekcji Kultur Komórkowych - American Type Culture Collection (ATCC) lub Europejskiej Kolekcji Zwierzęcych Kultur Komórkowych - European Collection of Animal Cell Cultures(ECACC). Jak już wspomniano wyżej, szczególnie korzystnymi wirusami ospy, otrzymywanymi ujawnionym sposobem są wirusy Avipoxvirus i Orthopoxvirus. Przykładami wirusów Orthopoxvirus są wirusy krowianki, takie jak szczepy Elstree wirusa krowianki, Western Reserve, Wyeth, NYVAC, NYCBOH, Paris, Copenhagen, korzystniej różne szczepy MVA i najkorzystniej MVA-BN, zdeponowany w ECACC pod nr V lub jego pochodne. MVA-BN lub jego pochodne zostały szczegółowo opisane w zgłoszeniu PCT PCT/EPO1/13628, zatytułowanym Wariant zmodyfikowanego wirusa krowianki Ankara. Pochodna zdeponowanego wirusa jest wirusem, wykazującym istotnie taką samą charakterystykę wzrostu, w szczególności taką samą zależność od temperatury, jak zdeponowany szczep, lecz może różnić się przynajmniej jedną częścią swojego genomu. Opisany sposób może być przeprowadzony, odpowiednio, z wirusami typu dzikiego, wirusami atenuowanymi i wirusami rekombinowanymi. Wirus atenuowany jest wirusem pochodzącym od wirusa patogennego, lecz wywołana nim infekcja w organizmie gospodarza prowadzi do niższej śmiertelności i/lub lżejszego stanu chorobowego, w porównaniu z nieatenuowanym, rodzicielskim wirusem. Specjalistom w dziedzinie znane są przykłady atenuowanych wirusów ospy. Przykładem atenuowanego wirusa krowianki jest szczep MV A, w szczególności szczep zdeponowany w ECACC pod nr V (zobacz wyżej). Termin wirus rekombinowany odnosi się do jakiegokolwiek wirusa posiadającego wstawiony do genomu wirusowego heterologiczny gen, niebędący jego naturalną częścią. Heterologiczny gen może być genem terapeutycznym, genem kodującym peptyd obejmujący przynajmniej jeden epitop do indukcji odpowiedzi immunologicznej, antysensowną kasetą ekspresyjną lub genem rybozymu. Specjalistom w dziedzinie znane są sposoby otrzymywania rekombinowanych wirusów. Najkorzystniejszym wektorem wirusa ospy jest MVA, w szczególności MVA 575 i MVA-BN (patrz wyżej). Przeciwnie do wszystkich wcześniejszych, znanych w dziedzinie zaleceń, Autorzy niniejszego wynalazku odkryli, że spośród sześciu temperatur, zawartych między 26 C a 37 C, wirusy ospy,

5 PL B1 5 w szczególności Chordopowirinae, ulegają mniej wydajniej amplifikacji podczas inkubacji (hodowli) w temperaturze 37 C. Zaskakującym odkryciem okazało się, że sposób amplifikacji wirusa ospy, w szczególności Chordopoxvirinae, prowadzi do wyższej wydajności wirusa, jeżeli komórki produkujące wirusa hodowane są w temperaturze niższej niż 37 C, zwłaszcza między 36,5 C a 26 C lub pomiędzy 26 C a około 36 C, w szczególności między 28 C a 33 C, a zwłaszcza między 28 C a 32 C, w szczególności w 30 C. Innym pożądanym zakresem temperatury jest przedział od 30 C do 36,5 C. Szczególnie dobre wyniki uzyskano w podzakresach 30 C do 35 C, 30 C do 33 C i 30 C do 32 C. Szczególnie korzystną temperaturą była temperatura 30 C. Określenie około stosowane w odniesieniu do wartości temperatury dotyczy korzystnie specyficznie wspomnianych temperatur i temperatur 0,5 C wyższych lub niższych od nich. Przykładowo, temperatura około 30 C interpretowana jest, jako temperatura w zakresie 29.5 C do 30.5 C. Ogólnie, w ujawnionym procesie odpowiedni wirus ospy produkowany jest w hodowli zainfekowanych komórek w temperaturze niższej od temperatury ciała zwierzęcia, włączając ludzi, które jest naturalnym gospodarzem danego wirusa ospy. W przypadku wirusa krowianki za naturalnego ich gospodarza uważa się bawoły (Baxby, D.: Jenner's smallpox vaccine: the riddle of vaccinia virus and its origin. London: Heinemann Educational; 1981: 1-214). Hodowla komórek produkujących wirus prowadzona jest zwłaszcza przez przynajmniej 24 godziny, w szczególności przez przynajmniej 2 dni lub przez przynajmniej 3 dni. Zazwyczaj, komórki nieposiadające wirusów wzrastają w 37 C, aż do uzyskania odpowiedniej ilości takich komórek. Następnie, hodowla komórkowa zaszczepiana jest wirusem, po czym następuje obniżenie temperatury do wyżej wspomnianej wartości. W alternatywnej realizacji, hodowla komórkowa jest poddawana działaniu powyższej temperatury jeszcze przed inokulacją wirusem. Podłoża stosowane do hodowli komórek przed infekcją i do produkcji wirusów sposobem według niniejszego wynalazku mogą być takie same lub różne. Wszystkie podłoża są standardowymi podłożami, znanymi specjalistom w dziedzinie. W razie konieczności, możliwe jest dodanie dodatkowych składników, takich jak antybiotyki, dodatkowe aminokwasy i/lub płodowa surowica cielęca. Zgodnie ze szczególną realizacją, podłoża stosowane w procesie według wynalazku nie zawierają lipidów ani surfaktantów do stabilizowania wirusowej otoczki lipidowej. W szczególności, podłoża stosowane w ujawnionym procesie nie zawierają żadnego z następujących czynników stabilizujących: Pluronic F-68, połączenia Pluronic F-68 i Tween lub koncentratu lipidowego (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD, nr kat.: ), który zawiera cholesterol, olej wątroby dorsza, Pluronic F-68, octan d-alfa-tokoferolu i Tween 80. Specjalistom w dziedzinie znane są komórki dla wirusów Chordopoxvirinae, które mogą być zastosowane w opisywanym procesie. Typ i natura komórek nie jest ściśle określony, pod warunkiem, że komórki mogą zostać zainfekowane odpowiednim wirusem, i że wirus potomny jest produkowany przez zainfekowane komórki. W szczególności, wartość multiplikacji infekcji powinna być niższa niż 1. Szczególnie pożądanymi komórkami są komórki kręgowców, np., komórki ssacze lub ptasie. Zgodnie ze szczególną realizacją, komórkami kręgowców znajdującymi zastosowanie w ujawnionym sposobie z wirusami krowianki, w szczególności ze szczepami Elstree i MVA wirusa krowianki, są Fibroblasty Embrionów Kurczaków (CEF). Okazało się, że ujawniony proces może znaleźć zastosowanie dla komórek CEF, całkowicie nieoczekiwanie, ponieważ normalna średnia temperatura ciała kurcząt wynosi 41 C. Zatem, zastosowana w ujawnionym sposobie temperatura poniżej 37 C, korzystnie między 36,5 C a 26 C, korzystniej między 28 C a 33 C, jeszcze korzystniej między 28 C a 32 C, najkorzystniej 30 C różni się znacznie od normalnej temperatury ciała kurcząt. Pierwotnie można by było przypuszczać, że takie warunki temperaturowe nie będą mogły znaleźć zastosowania w namnażaniu wirusów krowianki. Tego samego typu uwagi związane są z temperaturami w zakresie 30 C do 36,5 C, 30 C do 33 C, 30 C do 32 C, a w szczególności z temperaturą 30 C. Ponadto, ujawniony proces prowadzony jest korzystnie w nieruchomych kolbach. Kolejną zaletą jest to, że proces prowadzi do wzrostu wydajności przy zastosowaniu normalnych szczepów wirusa. W celu obniżenia temperatury nie jest wymagane wprowadzenie temperaturowrażliwych mutacji lub długich i skomplikowanych procedur atenuacji. Innymi słowy, do uzyskania wyższej wydajności dla cząsteczek wirusa w niższej, w stosunku do 37 C, temperaturze, niewymagane jest wykorzystanie atenuowanych temperaturowo lub temperaturo-wrażliwych mutantów. Wiadomo, że temperaturowo atenuowany wirus lub temperaturo-wrażliwe mutanty ulegają amplifikacji lepiej w niższej temperaturze; jednakże, takie szczepy zazwyczaj wykazują mniejszą reproduktywność niż nieatenuowane lub niezmutowane pod kątem wrażliwości temperaturowej wirusy.

6 6 PL B1 Zatem, dużą korzyścią płynącą ze sposobu według wynalazku jest fakt, że może on być zastosowany wobec jakiegokolwiek rodzaju normalnego, silnie reprodukcyjnego szczepu wirusa. Wirus otrzymany ujawnionym sposobem jest wykorzystany zwłaszcza, jako szczepionka lub do uzyskania kompozycji znajdującej zastosowanie w terapii genowej. Tego typu zastosowania wirusów ospy są dobrze znane w dziedzinie. Krótki opis figur Fig. 1: Na fig. 1 zamieszczono pojedyncze wartości uzyskane z eksperymentu 1, wykonanego w dwóch powtórzeniach (przedstawione punktowo). Słupki obrazują wartości średnie. Dla pojedynczych wartości, porównaj tabela 1. Fig. 2: Na fig. 2 zamieszczono pojedyncze wartości otrzymane z eksperymentu 2, wykonanego w dwóch powtórzeniach (przedstawione punktowo). Słupki obrazują wartości średnie. Dla pojedynczych wartości, porównaj tabela 2. Fig. 3: Przedstawione na fig. 3 punkty są pojedynczymi wartościami uzyskanymi z eksperymentów w czterech różnych temperaturach (eksperyment 3), wykonanych w dwóch powtórzeniach. Słupki obrazują wartości średnie. Dla pojedynczych wartości, porównaj tabela 3. Fig.4: Przedstawione na fig. 4 punkty są pojedynczymi wartościami uzyskanymi z eksperymentów w czterech różnych temperaturach (eksperyment 4), wykonanych w dwóch powtórzeniach. Słupki obrazują wartości średnie. Dla pojedynczych wartości, porównaj tabela 4. Fig. 5: Zamieszczone na fig. 5 słupki prezentują średnie wartości dla eksperymentów wykonanych w trzech powtórzeniach w 30 C i 37 C. Poszczególne wartości zamieszczono w tabeli 5. Szczegółowy opis wynalazku Niniejszy wynalazek dotyczy następujących realizacji: procesu otrzymywania wirusa ospy, w szczególności wirusa ospy kręgowców Chordopoxvirinae, charakteryzującego się tym, że wirus namnażany jest w hodowli o temperaturze poniżej 37 C; powyższego procesu, znamiennego tym, że wirus jest namnażany w hodowli o temperaturze około 26 C do około 36 C; powyższego procesu, charakteryzującego się tym, że wirus jest namnażany w hodowli o temperaturze około 28 C do około 33 C; powyższego procesu, charakteryzującego się tym, że wirus jest namnażany w hodowli o temperaturze około 30 C do około 33 C; powyższego procesu, znamiennego tym, że wirus jest namnażany w hodowli o temperaturze około 30 C; powyższego procesu, znamiennego tym, że namnażanie wirusa przebiega w okresie, co najmniej 24 godzin; powyższego procesu, charakteryzującego się tym, że namnażanie wirusa przebiega, podczas co najmniej 2 do 3 dni; powyższego procesu, znamiennego tym, że wirus ospy jest wirusem użytecznym, jako szczepionka lub terapeutyczny wektor genowy; powyższego procesu, znamiennego tym, że wirus ospy wybrany jest z grupy obejmującej wirusy Avipoxvirus i Orthopoxvirus; powyższego procesu, charakteryzującego się tym, że wirus jest wirusem krowianki; powyższego procesu, znamiennego tym, że wirus jest zmodyfikowanym wirusem krowianki Ankara (MVA), korzystnie MVA-BN, zdeponowanym w ECACC pod numerem V lub jego pochodną; powyższego procesu, charakteryzującego się tym, że proces ten przebiega w nieruchomych kolbach; powyższego procesu, charakteryzującego się tym, że wirus ospy nie jest temperaturowrażliwym mutantem wirusa; powyższego procesu, charakteryzującego się tym, że wirus ospy nie jest atenuowanym temperaturowo wirusem; powyższego procesu, znamiennego tym, że wirus namnażany jest w komórkach fibroblastów embrionów kurcząt; wirusa otrzymanego zgodnie z powyższymi procesami; kompozycji zawierającej wspomniany wirus; szczepionki zawierającej wspomniany wirus; kompozycji do zastosowania w terapii genowej obejmującej genom wirusa otrzymanego według któregokolwiek z powyższych procesów; zastosowania wirusa otrzymanego według któregokolwiek z powyższych procesów, jako szczepionki;

7 PL B1 7 zastosowania wirusa otrzymanego według któregokolwiek z powyższych procesów w terapii genowej. P r z y k ł a d y Poniższe przykłady stanowią dalszą ilustrację wynalazku. P r z y k ł a d 1: Wpływ temperatury na powielanie MVA Warunki hodowli komórek Pierwotne komórki CEF zaszczepiano w nieruchomych kolbach, na poziomie gęstości komórek inokulum 2 x 10 7 CEF kom/185 cm 2. Komórki zaszczepiano w VP-SFM + 4mM L-Glutaminy i 1% antybiotyki/ środki przeciwgrzybiczne. W 4 dniu po zaszczepieniu gęstość komórkowa osiągnęła 5 x 10 7 CEF kom./185 cm 2. Komórki infekowano 0,1 TCID 50 /kom. MVA-BN (zdeponowanym w ECACC po numerem V ) stosując RPMI w/o FCS. Infekcja, po której następowała 72 h inkubacja, przebiegała w 30 C i 37 C (w eksperymencie 1 i 2 z dwoma różnymi preparatami CEF), w 30, 33, 35 i 37 C (eksperyment 3) i w 26, 28, 30 i 33 C (eksperyment 4). Eksperyment przeprowadzono w dwóch powtórzeniach dla każdej temperatury. Replikację wirusa zatrzymywano poprzez zdrapanie komórek do podłoża i zamrożenie podłoża wraz z komórkami w -20 C. Mieszaninę poddawano zamrażaniu/rozmrażaniu kolejne dwa razy, aż do mechanicznego uwolnienia wirusa z komórek. W eksperymentach z 4 różnymi temperaturami infekcji replikację wirusa zatrzymywano poprzez zamrażanie unieruchomionych kolb w -20 C. Mieszanina ta poddawana była zamrażaniu/rozmrażaniu kolejne trzy razy, aż do mechanicznego uwolnienia wirusa z komórek. Miana wirusów z każdej unieruchomionej kolby określano stosując analizę immunohistochemiczną. Zainfekowane komórki wybarwiano swoistym dla wirusa krowianki przeciwciałem. Następnie, dodawano sprzężone z HRP przeciwciało skierowane przeciwko przeciwciału wirusa krowianki. Po dodaniu substratu zainfekowane komórki przybierały niebieski lub brązowy kolor. Oceny tego testu dokonywano stosując wzór Spearman'a i Kaerber'a, określający TCID 50 /ml (dawka infekcyjna dla kultury tkankowej). Eksperymenty przeprowadzano w dwóch powtórzeniach. Za kryterium wobec danych z miareczkowania przyjęto wyniki dla standardowego MVA-BN o znanych mianach, które zastosowano, jako kontrolę wewnętrzną każdego eksperymentu miareczkowania. Wyniki z eksperymentów brano pod uwagę jedynie wtedy, gdy wartości standardu MVA-BN nie odbiegały więcej niż ± 0,5 log od uzyskanej całkowitej średniej. Wyniki Biorąc pod uwagę możliwość wariantów wzrostowych komórek pierwotnych CEF, badania porównawcze temperatury infekcji 30 C i 37 C wykonano stosując dwa różne preparaty komórkowe. Wyniki z dwóch niezależnych eksperymentów infekcji zawarto w tabeli 1-2 i na fig Wyniki z doświadczenia 1 i 2 jasno wskazują na wyższą wydajność wirusa w 30 C niż w 37 C. W doświadczeniu 1 uzyskano wzrost 0,5 log a w doświadczeniu 2 - około 0,7 log. T a b e l a 1: W tabeli 1 przedstawiono wyniki uzyskane w 1 doświadczeniu [TCID 50 /ml] w 30 C [TCID 50 /ml] w 7 C kolba a 7,50E+07 3,20E+07 kolba b 1,30E+08 3,20E+07 wartość średnia 1,00E+08 3,20E+07 T a b e l a 2: W tabeli 2 przedstawiono wyniki uzyskane w 2 doświadczeniu [TCID 50 /ml] w 30 C [TCID 50 /ml] w 37 C kolba a 1,30E+08 3,20E+07 kolba b 1,30E+08 2,40E+07 wartość średnia 1.30E+08 2,70E+07 Dane otrzymane z dwóch pierwszych eksperymentów są bardzo obiecujące i wskazują, że wzrost wydajności MVA można uzyskać poprzez obniżenie temperatury inkubacji po infekcji. Zatem, idąc tym tokiem myślenia, w celu znalezienia optymalnej temperatury infekcji, zdecydowano się zastosować również inne wartości temperatury. Zastosowano temperaturę 30, 33, 35 i 37 C. Wyniki z tego eksperymentu przedstawiono w tabeli 3 i na fig. 3.

8 8 PL B1 Porównując wydajności uzyskane dla 37 C i niższych temperatur infekcji (35, 33 i 30 C) w sposób oczywisty wykazano wzrost w niższych temperaturach. Najlepszy wynik miana wirusowego [TCID 50 /ml] osiągnięto w eksperymencie o temperaturze infekcji 30 C. Rezultat ten był o 0,8 log wyższy od odnotowanego dla 37 C. T a b e l a 3: W tabeli 3 przedstawiono miana wirusowe [TCID 50 /ml] uzyskane w 30, 33, 35 i 37 C [TCID 50 /ml] w 30 C [TCID 50 /ml] w 33 C [TCID 50 /ml] w 35 C [TCID 50 /ml] w 37 C kolba a 1,30E+08 5,60E+07 3,20E+07 3,20E+07 kolba b 1,30E+08 1,00E+08 7,50E+07 1,30E+07 wartość średnia 1,30E+08 7,50E+07 4,90E+07 2,10E+07 W kolejnym eksperymencie, w celu zbadania czy 30 C jest rzeczywiście temperaturą optymalną do powielania MVA w komórkach CEF, w hodowli w nieruchomych kolbach zastosowano temperatury niższe nawet niż 30 C. Zgodnie z powyższym, wprowadzono 26, 28, 30 i 33 C. Wyniki uzyskane w tym doświadczeniu zamieszczono w tabeli 4 i na fig. 4. T a b e l a 4: W tabeli 4 przedstawiono miana wirusowe [TCID 50 /ml] uzyskane w 26, 28, 30 i 33 C [TCID 50 /ml] w 26 C [TCID 50 /ml] w 28 C [TCID 50 /ml] w 30 C [TCID 50 /ml] w 33 C kolba a 3,20E+07 1,00E+08 4,20E+08 1,80E+08 kolba b 1,00E+08 1,80E+O8 2,40E+08 1,00E+08 wartość średnia 5,60E+07 1,30E+08 3,20E+08 1,30E+08 Najwyższą wydajność w tym eksperymencie stwierdzono w przypadku temperatury inkubacji po infekcji wynoszącej 30 C. Porównując powyższe dane z rezultatami wcześniejszego eksperymentu (4 temperatury pomiędzy 30 a 37 C), wykazano, że temperaturą po infekcji, optymalną do powielania MVA w komórkach CEF w nieruchomych kolbach, jest temperatura 30 C. Analiza pochodzących z omówionych dwóch eksperymentów mian wirusowych dla poszczególnych temperatur, pozwala na stwierdzenie, że inkubacja w 37 C może wiązać się nawet z najniższym, spośród ustalonych dla 6 stosowanych temperatur, poziomem uzyskanych wirusów. Zaobserwowana kolejność, według uzyskanych wydajności w stosowanych temperaturach, jest następująca: 30 C > 33 C/28 C > 35 C/26 C > 37 C. P r z y k ł a d 2 Wpływ temperatury na powielanie wirusa krowianki szczepu Elstree W innej realizacji, oprócz MVA-BN, również wirus krowianki szczepu Elstree testowany był pod kątem zależności od temperatury. MVA-BN i Elstree powielano stosując komórki CEF. W ramach eksperymentu, pierwotne komórki CEF zaszczepiano w nieruchomych kolbach na poziomie gęstości komórek inokulum 2E+07 CEF kom./175 cm 2. Komórki zaszczepiano w podłożu hodowlanym + 4mM L-Glutaminy i 1% antybiotyki/środki przeciwgrzybiczne. W 4 dniu po zaszczepieniu gęstość komórkowa osiągnęła 5E+07 CEF kom./175 cm 2. Komórki infekowano 0,1 TCID 50 /kom. MVA-BN stosując odpowiednio, RPMI w/o FCS i Elstree. Infekcja, po której następowała 72 h inkubacja, przebiegała w 30 C i 37 C. Eksperyment przeprowadzono w trzech powtórzeniach dla każdej temperatury. Replikację wirusa zatrzymywano poprzez zamrożenie unieruchomionej kolby w -20 C. Mieszaninę poddawano zamrażaniu/rozmrażaniu kolejne trzy razy, aż do mechanicznego uwolnienia wirusa z komórek. Miana wirusa z każdej unieruchomionej kolbki określano stosując miareczkowanie według SOP/MVA/04. Za kryterium miareczkowania przyjęto wyniki dla standardowy MVA F6 o znanych mianach, które zastosowano, jako kontrolę wewnętrzną każdego eksperymentu miareczkowania. Wyniki z eksperymentu brano pod uwagę tylko, gdy standardowe wartości MVA F6 S nie odbiegały więcej niż ± 0,5 log od uzyskanych. Wyniki uzyskane w doświadczeniu obejmującym infekcję przedstawiono w tabeli 5 i na figurze 5.

9 PL B1 9 Dane z eksperymentu, w którym zastosowano MVA-BN wskazują jasno na wzrost wydajności wirusa w 30 C, w porównaniu z 37 C (0,667 log). W doświadczeniu z Elstree odnotowano wzrost 1,125 log w 30 C - w porównaniu z 37 C. T a b e l a 5: W tabeli 5 przedstawiono miana wirusów [log 10 TCID 50 /ml] uzyskane w 30 i 37 C dla MVA-BN i wirusa krowianki szczepu Elstree. MVA 30 C MVA 37 C Elstree 30 C komórki CEF Elstree 37 C komórki CEF kolba a 9,0 7,88 7,25 6,375 kolba b 8,0 8,0 8 6,5 kolba c 8,25 7,38 7,5 6,5 wartość średnia 8,42 7,75 7,583 6,458 Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób otrzymywania wirusa ospy kręgowców - Chordopoxvirinae, znamienny tym, że wirus namnażany jest w podłożu wzrostowym w hodowli o temperaturze około 35 C lub poniżej 35 C, przy czym wirus ospy kręgowców - Chordopoxvirus wybrany jest zmodyfikowanym wirusem krowianki Ankara (MVA), korzystnie MVA-BN, zdeponowanym w ECACC pod numerem V lub jego pochodnej. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wirus ospy namnażany jest w komórkach fibroblastów embrionów kurcząt. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że wirus ospy kręgowców - Chordopoxvirus namnażany jest w hodowli o temperaturze od około 26 C do około 35 C. 4. Sposób otrzymywania wirusa ospy kręgowców - Chordopoxvirinae, znamienny tym, że wirus namnażany jest w fibroblastach embrionów kurcząt w temperaturze hodowli wynoszącej od około 26 C do około 32 C. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że wirus ospy kręgowców - Chordopoxvirus wybrany jest z grupy obejmującej Avipoxvirus i Orthopoxvirus. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że Orthopoxvirus jest wirusem krowianki. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że wirus krowianki wybrany jest ze szczepu Elstree i zmodyfikowanego wirusa krowianki Ankara (MVA), korzystnie MVA-BN, zdeponowanego w ECACC pod numerem V lub jego pochodnej. 8. Sposób według jednego z zastrz. od 1 do 3, znamienny tym, że wirus ospy kręgowców - Chordopoxvirus namnażany jest w hodowli o temperaturze od około 28 C do około 35 C. 9. Sposób według jednego z zastrz. od 1 do 8, znamienny tym, że wirus ospy kręgowców - Chordopoxvirus namnażany jest w hodowli o temperaturze około 30 C. 10. Sposób według jednego z zastrz. od 1 do 9, znamienny tym, że namnażanie wirusa przebiega przez okres co najmniej 24 godzin. 11. Sposób według jednego z zastrz. od 1 do 10, znamienny tym, że namnażanie wirusa przebiega, przez co najmniej 2 do 3 dni. 12. Sposób według jednego z zastrz. od 1 do 11, znamienny tym, że wirus ospy kręgowców -Chordopoxvirus jest wirusem użytecznym jako szczepionka lub terapeutyczny wektor genowy. 13. Sposób według jednego z zastrz. od 1 do 12, znamienny tym, że przebiega w nieruchomych kolbach. 14. Sposób według jednego z zastrz. od 1 do 13, znamienny tym, że wirus ospy jest niewrażliwym na temperaturę mutantem wirusa. 15. Sposób według jednego z zastrz. od 1 do 14, znamienny tym, że wirus ospy jest nieatenuowanym temperaturowo wirusem. 16. Sposób według jednego z zastrz. od 1 do 15, znamienny tym, że do podłoża hodowlanego nie dodaje się żadnych dodatkowych lipidów ani surfaktantów. 17. Zastosowanie wirusa otrzymywanego sposobem określonym w zastrz. od 1 do 16 do wytwarzania kompozycji.

10 10 PL B1 18. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że wytwarzana kompozycja jest szczepionką. 19. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że wytwarzana kompozycja jest szczepionką przeznaczoną do stosowania w terapii genowej. Rysunki

11 PL B1 11

12 12 PL B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 4,00 zł.