Prof. dr hab. E. K. Jagusztyn-Krynicka UNIWERSYTET WARSZAWSKI

Transkrypt

1 1 d Prof. dr hab. E. K. Jagusztyn-Krynicka UNIWERSYTET WARSZAWSKI WYDZIAŁ BIOLOGII INSTYTUT MIKROBIOLOGII ZAKŁAD GENETYKI BAKTERII ul. MIECZNIKOWA 1, WARSZAWA TEL: (+48 22) , FAX: (+48 22) kjkryn@biol.uw.edu.pl Recenzja rozprawy doktorskiej mgr Anny Stachyry Opracowanie szczepionki DNA przeciwko wirusowi grypy ptaków H5N1 Promotor prof. dr hab. Agnieszka Sirko Promotor pomocniczy dr Anna Góra-Sochacka Rozprawa doktorska mgr Anny Stachyry została wykonana w Instytucie Biochemii i Biofizyki Polskiej Akademii Nauk w grupie badawczej kierowanej przez prof. dr hab. Agnieszkę Sirko. Badania były finansowane ze środków Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego w ramach Programu Operacyjnego Innowacyjna Gospodarka. Przeprowadzone eksperymenty dotyczyły opracowania i wstępnego przetestowania skuteczności działania prototypu szczepionki DNA przeciwko grypie ptaków H5N1. Grypa jest wirusową chorobą zakaźną znaną od wieków, a pierwsze szczepienia przeciwko grypie wprowadzono w połowie XX wieku. Tym niemniej nadal nie posiadamy skutecznej uniwersalnej szczepionki ani dla ludzi ani dla ptaków. Główne przyczyny to:1) zjawisko przesunięcia antygenowego (antigenic drift) doprowadzające poprzez nagromadzanie mutacji punktowych do zmian w sekwencji aminokwasowej istotnych antygenów; 2) zjawisko tzw. skoku antygenowego (antigenic shift) polegające na wymianie segmentów materiału genetycznego pomiędzy dwoma cząsteczkami wirusa i 3) zdolność do transmisji niektórych typów wirusa ze zwierząt na ludzi zmiana gospodarza. Główne typy szczepionek stosowanych do immunizacji ludzi (szczepionki trój lub czterowalentne) to: inaktywowane szczepy, atentowane szczepy, rozbite cząstki wirusa lub rekombinowane szczepionki. Skuteczność wielu typów jest podwyższana przez zastosowanie odpowiednich adiuwantów. W wypadku szczepionek przeciwko grypie sezonowej z mniejszą lub większą dokładnością jesteśmy w stanie ocenić zmienność genetyczną i z odpowiednim wyprzedzeniem przygotować preparaty szczepionkowe. W wypadku grypy pandemicznej, gdy pojawiają się nowe typy wirusa jako konsekwencja zjawiska genetycznej reasortacji, głównym czynnikiem decydującym o skuteczności naszych działań jest czas., konieczność wyprodukowania szczepionki skutecznej przeciwko

2 2 konkretnemu typowi wirusa (przykład w roku 2009 wyprodukowanie szczepionki przeciwko wirusowi H1N1 zajęło tylko trzy miesiące, a i tak było to za późno). Wyniki ostatnio opublikowanych badań wskazują, że syntetyczna biologia pozwoli przezwyciężyć ten problem. Obiecujące są badania nad uniwersalną szczepionką potencjalnie ochronną przeciwko kilku podtypom wirusa grypy (mieszanka cząstek VLP prezentujących różne podtypy antygenu H) (artykuł w czasopiśmie MBio; 2015). Grypa jest też chorobą zwierząt, głównie ptaków. Wysoce patogenne (HPAI) dla ptaków szczepy należą przeważnie do podtypów H5 oraz H7. Niektóre podtypy mogą zagrażać ludziom ; jak np. H5N1 w roku 2003 lub H7N9 opisany w roku Ostatnio w Europie opisano ogniska ptasiej grypy H5N8. Jak dotąd dysponujemy nielicznymi prototypami szczepionek dla ptaków np. chyba najnowsza szczepionka Vectormun zarejestrowana w USA i Meksyku przeciwko podtypom H5 lub inne starsze szczepionki stosowane w niektórych regionach świata. Wprowadzenie tych szczepionek do powszechnego użycia budzi też liczne kontrowersje. Chciałabym aby doktorantka podczas dyskusji krótko je przedstawiła. Recenzowana rozprawa doktorska mgr Anny Stachyry przedstawia eksperymenty oceniające skuteczność szczepionki DNA dla ptaków przeciwko wirusowi grypy H5N1. Rozprawa obejmuje cztery prace oryginalne oraz jedną pracę przeglądową. Artykuły oryginalne zostały opublikowane w następujących czasopismach: Trials in Vaccinology, Acta Biochimica Pol. IF=1.534; Virology Journal IF=2.249; Annal Bioannal. Chem. IF= Praca przeglądowa ukazała się w Acta Bioch. Pol. Zestaw publikacji poprzedzony został krótkim wstępem wprowadzającym w tematykę badań, a konkretnie prezentującym mechanizm działania i historię szczepionek DNA oraz podstawowe informacje dotyczące grypy ludzi i ptaków. Doktorantka dołączyła także do rozprawy krótkie omówienie poszczególnych publikacji wraz z opisem własnego wkładu w powstanie danego artykułu. Prace są wieloautorskie (od 5 do12 autorów) co nie budzi mojego zdziwienia. Oszacowanie skuteczności oraz zrozumienie mechanizmu działania prototypu szczepionki wymaga współdziałania specjalistów z kilku dziedzin biologii biologii molekularnej, wirusologii, immunologii i weterynarii. Wkład doktorantki w powstanie publikacji dotyczył głównie uczestniczenia w pracach inżynierii genetycznej (przygotowanie niektórych wyjściowych konstruktów), oczyszczaniu plazmidowego DNA koniecznego do immunizacji, udziału w eksperymentach szczepionkowych, ocenie poziomu odpowiedzi immunologicznej (testy ELISA) oraz udziale w redagowaniu publikacji. W trzech publikacjach dotyczących oszacowania skuteczności szczepionek doktoranta jest pierwszym autorem (w jednej wspólnie z drugim

3 3 autorem). Przedstawiony przez doktorantkę udział w powstanie publikacji jest zgodny z oświadczeniami autorów dołączonymi do rozprawy doktorskiej. Cel prowadzonych badań został jasno i precyzyjnie sformułowany. Doktorantka podkreśliła znaczenie aplikacyjne prowadzonych badań pomijając jednak ich aspekt badawczy. Analiza typu odpowiedzi immunologicznej pozwala nam także zrozumieć mechanizm działania prototypu szczepionki. Trzy publikacje dotyczą analizy skuteczności działania skonstruowanych prototypów szczepionek DNA przeciwko wirusowi grypy ptasiej H5N1. W tych eksperymentach przeanalizowano wpływ sekwencji nukleotydowej antygenu (krótszy vs dłuższy, optymalizacja kodonów), dawki preparatu, nośnika, drogi podania oraz schematu immunizacji na skuteczność preparatu. Ustalono, że skuteczna immunizacja wymaga zastosowania genu pełnej długości, i co najmniej dwukrotnej immunizacji. Iniekcja domięśniowa z wykorzystaniem nośnika lipidowego podwyższała poziom odpowiedzi immunologicznej mierzony w testach ELISA oraz w teście zahamowania hemaglutynacji. Skuteczność immunizacji oceniano w eksperymencie ochronnym. Artykuł opublikowany w Virology Journal, 2016, rozszerza prowadzone uprzednio badania poprzez analizę odpowiedzi immunologicznej dodatkowo na modelu mysim oraz szczegółową analizę wpływu zwiększenia zawartości zasad GC w materiale genetycznym. Wykazano, że takie działanie podwyższa poziom ekspresji genu a za tym także ilość antygenu prawdopodobnie zwiększając stabilność mrna. Ostatnio przeprowadzone globalne analizy genomów i transkryptomów kurzych wykazały olbrzymią różnorodność genetyczną różnych ras kurcząt. Zjawisko to ma wpływ na różnice w odpowiedzi immunologicznej. W świetle tych faktów istotne były wyniki eksperymentów przeprowadzonych na dwu rasach kurcząt, co potwierdziło wcześniej publikowane dane dotyczące uzyskane w eksperymentach z innymi typami szczepionek. Przeprowadzono także wstępny eksperyment in vitro (reakcja otrzymanych surowic z wirusami H5N2 oraz H1N1) w celu oceny krzyżowej odporności indukowanej przez badany prototyp szczepionki. Czy badania te będą kontynuowane? Eksperymenty zostały przeprowadzone z dużą starannością co niewątpliwie zostało docenione przez recenzentów manuskryptów będących ekspertami w badaniach szczepionkowych. Podsumowanie dotychczasowych osiągnięć dotyczących opracowania szczepionek DNA przeciwko grypie kurzej zebrano w pracy przeglądowej ABP, 2014.Chciałabym więc prosić doktorantkę o krótkie podsumowanie własnych wyników w świetle publikowanych danych i przedstawienie wad i zalet opracowywanych prototypów. Zauważyłam, że w 2017 roku w czasopiśmie Virus Research ukazała się publikacja opisująca eksperymenty szczepień kurcząt

4 4 z zastosowaniem szczepionki DNA w połączeniu z podawaniem rekombinowanego białka. Jakie były efekty tych badań? Czwarta publikacja włączona w skład rozprawy doktorskiej dotyczy raczej diagnostyki niż profilaktyki. Obejmowała eksperymenty oszacowania działania skonstruowanego bioczujnika do wykrywania przeciwciał przeciwko hemaglutyninie H5 obecnych w surowicach immunizowanych kurcząt. Pomimo jeszcze braku doskonałości wykazano wyższą specyficzność tej metody niż testów ELISA. Autorzy przewidują, że może on znaleźć zastosowanie do monitorowania ptaków zarówno hodowlanych jak i dzikich. Inne uwagi: 1. Czy szczepienie kurcząt przeciwko wirusowi H5N1 zapobiegnie pojawieniu się nowych grożnych dla ludzi szczepów wirusa, czy to szczepionka dla przemysłu drobiarskiego? 2. Jakie są szanse opracowania wielo-epitopowej szczepionki przeciwko grypie ptasiej czy ludzkiej? 3. Jaki był cel przeprowadzania eksperymentów tzw. ochronnych z wykorzystaniem zwierząt SPF, skoro wiadomo, że ze względu na brak właściwej flory mikrobiologicznej ich odpowiedź immunologiczna jest daleko odbiegająca od odpowiedzi kurcząt hodowlanych zarówno ras nośnych czy mięsnych? Podobna uwaga dotyczy użycia myszy SPF (publikacja w Virology Journal). 4. Rolą recenzenta nie jest raczej ocena wstępu do tego typu rozpraw doktorskich. Zwracam jednak uwagę na kilka niedociągnięć, które zauważyłam we wstępie, co może być użyteczne przy przygotowywaniu prac przeglądowych (słowo sekwencja znaczy kolejność, więc winne być użyte jako sekwencja nukleotydowa lub sekwencja aminokwasowa; DNA jako kwas jest rodzaju męskiego; nie należy mylić słowa ilość ze słowem liczba niepoliczalne vs. policzalne). 5. Drobne wątpliwości budzi włączanie pracy przeglądowej do rozprawy doktorskiej, ponieważ ustawa O stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki stanowi: Art Rozprawa doktorska, przygotowywana pod opieką promotora albo pod opieką promotora i promotora pomocniczego, o którym mowa w art. 20 ust. 7, powinna stanowić oryginalne rozwiązanie problemu naukowego lub oryginalne dokonanie artystyczne oraz wykazywać ogólną wiedzę

5 5 teoretyczną kandydata w danej dyscyplinie naukowej lub artystycznej oraz umiejętność samodzielnego prowadzenia pracy naukowej lub artystycznej. Zgodnie z moją wiedzą decyzje dotyczące włączania prac przeglądowych do rozpraw doktorskich podejmowane są przez Rady Wydziałów lub Rady Naukowe Instytutów. Podsumowując stwierdzam, że uznaję przedstawioną rozprawę doktorska za wartościową i spełniającą wszelkie wymogi stawiane rozprawom doktorskim. Wnoszę do Rady Naukowej Instytutu Biochemii i Biofizyki PAN o dopuszczenie mgr Anny Stachyry do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Wnioskuję o nagrodzenie rozprawy stosowną nagrodą. E. K. Jagusztyn-Krynicka Warszawa