(57) Sposób wytwarzania peptydów za pomocą syntezy w fazie stałej, o ogólnym wzorze 1, w którym X oznacza (12) OPIS PATENTOWY (19)PL (11)167504

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19)PL (11) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (21) IntCl6: C07K1/04 Opis patentowy przedrukowano ze względu na zauważone błędy (54) Sposób wytwarzania peptydów za pomocą syntezy w fazie stałej (30) Pierwszeństwo: ,DE,P (73) Uprawniony z patentu: Hoechst Aktiengesellschaft, Frankfurt nad Menem, DE (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 14/92 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 09/95 (72) Twórcy wynalazku: Gerhard Breipohl, Frankfurt nad Menem, DE Jochen Knolle, Kriftel, DE Wolfgang König, Hofheim am Taunus, DE (74) Pełnomocnik: Durka Mieczysław, PATPOL Spółka z o.o. PL B1 (57) Sposób wytwarzania peptydów za pomocą syntezy w fazie stałej, o ogólnym wzorze 1, w którym X oznacza α-aminokwas z szeregu Ac-Nal(2), Ac-D-Nal(2), p-cl- Phe, p-cl-d-phe- Trp, D-Trp, Ser, D-Ser, Tyr, D-Tyr, Ser(α-L-Rha), D-Ser(α-L-Rha), Leu, D-Leu, Arg, D- Arg, Pro, D-Pro, P-Glu, His, D-ser (tbu), n oznacza liczbę całkowitą od 3 do 10, i A oznacza azaglicynę, oraz ich fizjologicznie tolerowanych soli octanów i chlorowodorków, znamienny tym, że związek o wzorze 2, w którym Y1, Y2, Y3, Y4 i Y oznaczają wodór, grupę C1-C4- alkoksy albo -(CH2)n-COOH, przy czym rodniki mogą być jednakowe albo różne, przynajmniej jeden rodnik oznacza jednak -(C H2)n-CO O H, n oznacza liczbę całkowitą od 1 do 3, i R oznacza wodór albo 4-metoksyfenyl, poddaje się reakcji z odczynnikiem sililującym z szeregu chlorek tert.-butylodimetylosililu, chlorek tert.-butylofenylosililu, trimetylochlorosilan albo bistrimetylosililoacetamid w rozpuszczalniku i następnie sililowany związek przeprowadza się za pomocą pochodnej kwasu chloromrówkowego w związki o wzorze 3, w którym R1. Y1, Y2, Y3, Y4 i Y mają wyżej podane znaczenie i R oznacza fenyl, który jest podstawiony przez grupę nitrową i chlorowiec, tak otrzymane związki o wzorze 3 poddaje się reakcji z hydrazydem aminokwasu o wzorze 4, w którym X oznacza wyżej podany α-aminokwas i R3 oznacza grupę ochronną Fmoc, Bpoc albo Boc, w rozpuszczalniku z utworzeniem związków o wzorze 5, w którym R1, R3 i Y1, Y2, Y3, Y4 i Y5 mają wyżej podane znaczenie;... WZÓR 1 WZÓR 2 WZÓR 3 W zó r 4 Wzór 5

2 Sposób wytwarzania peptydów za pomocą syntezy w fazie stałej Zastrzeżenie patentowe Sposób wytwarzania peptydów za pomocą syntezy w fazie stałej, o ogólnym wzorze 1, w którym X oznacza α-aminokwas z szeregu Ac-Nal(2), Ac-D-Nal(2), p-cl-phe, p-cl-d-phe- Trp, D-Trp, Ser, D-Ser, Tyr, D-Tyr, Ser(α-L-Rha), D-Ser(α-L-Rha), Leu, D-Leu, Arg, D-Arg, Pro, D-Pro, P-Glu, His, D-ser (tbu), n oznacza liczbę całkowitą od 3 do 10, i A oznacza azaglicynę, oraz ich fizjologicznie tolerowanych soli octanów i chlorowodorków, znamienny tym, że związek o wzorze 2, w którym Y1, Y2, Y3, Y4 i Y5 oznaczają wodór, grupę C1-C4-alkoksy albo -(CH2)n- COOH, przy czym rodniki mogą być jednakowe albo różne, przynajmniej jeden rodnik oznacza jednak -(CH2)n-COOH, n oznacza liczbę całkowitą od 1 do 3, i R1 oznacza wodór albo 4- metoksyfenyl, poddaje się reakcji z odczynnikiem sililującym z szeregu chlorek tert.-butylodimetylosililu, chlorek tert.-butylofenylosililu, trimetylochlorosilan albo bistrimetylosililoacetamid w rozpuszczalniku i następnie sililowany związek przeprowadza się za pomocą pochodnej kwasu chloromrówkowego w związki o wzorze 3, w którym R1, Y1, Y2, Y3, Y4 i Y5 mają wyżej podane znaczenie i R2 oznacza fenyl, który jest podstawiony przez grupę nitrową i chlorowiec, tak otrzymane związki o wzorze 3 poddaje się reakcji z hydrazydem aminokwasu o wzorze 4, w którym X oznacza wyżej podany α-aminokwas i R3 oznacza grupę ochronną Fmoc, Bpoc albo Boc, w rozpuszczalniku z utworzeniem związków o wzorze 5, w którym R1, R3 i Y1, Y2, Y3, Y4 i Y5 mają wyżej podane znaczenie; jeżeli R3 oznacza Boc, tę grupę ochronną usuwa się przez uwodornienie nad katalizatorem Pd i przed dalszą reakcją przeprowadza się w ochronną grupę Fmoc- albo Bpoc-uretanową, następnie związek o wzorze 5, w którym R1, Y1, Y2, Y3, Y4 i Y5 mają wyżej podane znaczenie i R3 oznacza grupę ochronną Fmoc- albo Bpoc-uretanową, za pomocą odczynników sprzęgających, stosowanych w chemii peptydów, przez ugrupowanie -(CH2)n-COOH łączy się z żywicą, odszczepia się grupę ochronną R3, stopniowo przyłącza się chronione czasowo przez grupy ochronne Fmoc albo Bpoc α-aminokwasy, ewentualnie w postaci ich aktywowanych pochodnych, i po zakończonej budowie peptydy o wzorze 1 przez traktowanie kwasem o średniej mocy uwalnia się od żywicy, przy czym jednocześnie albo bezpośrednio potem odszczepia się znowu czasowo wprowadzone grupy ochronne łańcuchów bocznych. * * * Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania peptydów z C-końcowym amidem azaaminokwasu za pomocą syntezy w fazie stałej. Synteza w fazie stałej - również synteza Merrifield'a - w której zostają utworzone aminokwasy, w syntezie w fazie stałej stopniowo od końca C-terminalnego, jest już od dawna znana, jednakże nie można tym sposobem wytwarzać z ubogą racemizacją peptydów, które przy C-terminalnym końcu zawierają azaaminokwas. Zadaniem wynalazku jest opracowanie ubogiego w racemizację sposobu wytwarzania peptydów z C-końcowymi amidami azaaminokwasu za pomocą syntezy w fazie stałej. Zadanie to rozwiązano według wynalazku przez sposób wytwarzania peptydów o ogólnym wzorze 1, w którym X oznacza α-aminokwas z szeregu Ac-Nal(2), Ac-D-Nal(2), p-cl-phe, p-cl-d-phe,trp, D-Trp, Ser, D-Ser, Tyr, D-Tyr, Ser(α-L-Rha), D-Ser(α-L-Rha), Leu, D-Leu, Arg, D-Arg, Pro, D-Pro, P-Glu, His, D-ser (tbu), n oznacza liczbę całkowitą od 3 do 10, i A oznacza azaglicynę, oraz ich fizjologicznie tolerowanych soli octanów i chlorowodorków, polegający na tym, że związek o wzorze 2, w którym Y1, Y2, Y3, Y4 i Y5 oznaczają wodór, grupę C1-C4-alkoksy albo -(CH2)n- COOH, przy czym rodniki mogą być jednakowe albo różne, przynajmniej jeden rodnik oznacza jednak -(CH2)n-COOH, n oznacza liczbę całkowitą od 1 do 3, i R1 oznacza wodór albo 4- metoksyfenyl, poddaje się reakcji z odczynnikiem sililującym z szeregu chlorek tert.-butylodimetylo-

3 sililu, chlorek tert.-butylofenylosililu, trimetylochlorosilan albo bistrimetylosililoacetamid w rozpuszczalniku i następnie sililowany związek przeprowadza się za pomocą pochodnej kwasu chloromrówkowego w związki o wzorze 3, w którym R1, Y1, Y2, Y3, Y4 i Y5 mają wyżej podane znaczenie i R2 oznacza feny, który jest podstawiony przez grupę nitrową i chlorowiec, tak otrzymane związki o wzorze 3 poddaje się reakcji z hydrazydem aminokwasu o wzorze 4, w którym X oznacza wyżej podany α-aminokwas i R3 oznacza grupę ochronną Fmoc, Bpoc albo Boc, w rozpuszczalniku z utworzeniem związków o wzorze 5, w którym R1, R3 i Y1, Y2, Y3, Y4 i Y5 mają wyżej podane znaczenie i jeżeli R3 oznacza Boc, tę grupę ochronną usuwa się przez uwodornienie nad katalizatorem Pd i przed dalszą reakcją przeprowadza w ochronną grupę Fmoc- albo Bpocuretanową, następnie związek o wzorze 5, w którym R1, Y1, Y2, Y3, Y4 i Y mają wyżej podane znaczenie i R3 oznacza grupę ochronną Fmoc-albo Bpoc-uretanową, za pomocą odczynników sprzęgających, stosowanych w chemii peptydów, przez ugrupowanie -(CH2)n-COOH łączy się z żywicą, odszczepia się grupę ochronną R3, stopniowo przyłącza się chronione czasowo przez grupy ochronne Fmoc albo Bpoc α-aminokwasy, ewentualnie w postaci ich aktywowanych pochodnych, i po zakończonej budowie peptydy o wzorze 1 przez traktowanie kwasem o średniej mocy uwalnia się od żywicy, przy czym jednocześnie albo bezpośrednio potem odszczepia się znowu czasowo wprowadzone grupy ochronne łańcuchów bocznych. Jako sole związków o wzorze 1 rozumie się zwłaszcza odpowiednie do stosowania farmaceutycznego albo nietoksyczne sole z nieorganicznymi albo organicznymi kwasami jak np. HCl i kwas octowy. Związki o wzorze 4 wytwarza się przez α-aminokwasów z odpowiednimi hydrazydami według stosowanych w chemii peptydów metod sprzęgania. Grupa alkoksylowa może być w łańcuchu prostym albo rozgałęziona. Chlorowiec oznacza fluor, chlor, brom albo jod, szczególnie fluor albo chlor. Jeżeli dla zapobieżenia reakcjom ubocznym albo dla syntezy specjalnych peptydów jest to potrzebne, funkcyjne grupy w łańcuchu bocznym α-aminokwasów są dodatkowo chronione przez odpowiednie grupy ochronne (patrz np. T.W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, Nowy Jork, John Wihley & Sons, 1981; Hubbuch, Kontakte (Merck) 1979, nr 3, strony 14-23; Biillsbach, Kontakte (Merck) 1980, nr 1, strony 23-35), przy czym w pierwszym rzędzie stosuje się Arg(Tos), Arg(Mts), Arg(Mtr), Arg(Pmc), Glu(OBzl), Glu(OtBu), Ser(Bzl), Ser(tBu). Poza tym funkcyjne grupy w łańcuchu bocznym mogą być również glikozylowane, jak np. opisano w europejskim opisie patentowym nr EP-A (HOE 86/F 253). Stosowane jako nośnik żywice dostępne są w handlu albo są wytwarzane, jak np. żywica na bazie alkoholu alkoksysbenzylowego, żywice aminometylowe albo żywice benzhydryloaminowe. Wyróżniają się żywice aminometylowe, benzhydryloaminowe (BHA) i żywice metylobenzhydryloaminowe (MBHA). Nasycenie oznacza się przez analizę aminokwasową i/albo analizę elementarną. Jako odpowiednie związki o wzorze 5 rozumie się na przykład opisane w Atherton, Sheppard in Perspectives in Peptice Chemistry, strony (Karger, Basel 1981); w europejskim opisie patentowym nr EP-A (HOE 86/F 259), europejskim opisie patentowym nr EP-A 287,882 (HOE 87/F 101) oraz w europejskim opisie patentowym nr EP-A (HOE 87/F 386K) spacer'y oraz pochodzące od nich pochodne, jak na przykład takie, których grupa ochronna jest odszczepiona. Wyróżniają się 4-karboksylanopropoksy-4'-metoksybenzhydryloamina i 5-etoksykarbonylo-2,4-dimetoksy-4'-metoksybenzhydryloamina. Jako odczynniki sprzęgające dla związków o wzorze 5 oraz dalszych pochodnych aminokwasów można stosować wszystkie możliwe stosowane w syntezie peptydów odczynniki aktywujące, patrz np. Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, tom XV/2, Stuttgart 1974, zwłaszcza karbodiimidy, jak np. N.N'-dicykloheksylokarbodiimid, N,N'-diizopropylokarbodiimid albo N- etylo-n'-(3-dimetyloaminopropylo)-karbodiimid. Sprzęganie z żywicą można przy tym przeprowadzać wprost przez dodanie pochodnej aminokwasu przy użyciu odczynnika aktywującego i ewentualnie dodatku tłumiącego racemizacją, jak np. 4-dimetyloaminopirydyny, 1-dydroksybenzotriazolu (HOBt) (W.König, R. Geiger, Chem. Ber. 103 (1970) ) albo 3-hydroksy-4- okso-3,4-dihydrobenzotriazyny (HOObt) (W. Konig, R. Geiger, Chem. Ber, 103 (1970) ), albo aktywowanie wstępne pochodnej aminokwasu jako symetrycznego bezwodnika albo estru

4 HOBt lub HOObt może następować oddzielnie i roztwór aktywowanego czynnika w odpowiednim rozpuszczalniku dodaje się do zdolnej do sprzęgania peptydożywicy. Sprzęganie lub aktywowanie związku o wzorze 5 i pochodnej aminokwasu jednym z wymienionych wyżej odczynników aktywujących można przeprowadzać w dimetyloformamidzie albo chlorku metylenu, albo w mieszaninie obydwu. Aktywowaną pochodną aminokwasu stosuje się zwykle w 1,5- do 4-krotnym nadmiarze. W przypadku, w których następuje niecałkowite sprzęgnięcie, powtarza się reakcję sprzęgania, bez uprzedniego przeprowadzenia potrzebnego dla sprzęgnięcia następnego aminokwasu odblokowania grupy α-aminowej peptydożywicy. Skuteczny przebieg reakcji sprzęgania można badać za pomocą reakcji ninhydrynowej, jaka opisana jest np. przez E.Kaiser'a i współpracowników [Anal. Biochem. 34 (1970) 595]. Syntezę można przeprowadzić również w sposób zautomatyzowany, np. za pomocą syntezatora peptydów model 430A firmy Applied Biosystems, przy czym można stosować albo program syntezy przewidziany przez wytwórcę urządzenia, albo również ustalony przez samego użytkownika. Te ostatnie są używane zwłaszcza w przypadku stosowania pochodnych aminokwasów chronionych grupą Fmoc. Jakie rozpuszczalniki przy syntezie związków o wzorze 3 wchodzą w rachubę korzystnie tetrahydrofuran, acetonitryl, chlorek metylenu, dimetyloformamid albo ich mieszaniny. Odszczepienie peptydoamidów od żywicy prowadzi się przez traktowanie stosowanymi zwykle w syntezie peptydów kwasami o średniej mocy, np. kwasem trifluorooctowym, przy czym jako wychwytywacze kationów dodaje się substancje takie jak fenol,krezol, tiokrezol, anizol, tioanizol, etanoditiol, siarczek dimetylowy, siarczek etylowometylowy albo podobne stosowane w syntezie w fazie stałej wychwytywacze kationów pojedynczo albo mieszanię dwu albo więcej tych środków pomocniczych. Przy tym kwas trifluorooctowy można stosować rozcieńczony również przez odpowiednie rozpuszczalniki, jak np. chlorek metylenu. Przy odszczepianiu związku o wzorze 5 od żywicy następuje jednocześnie odszczepienie grup ochronnych łańcuchów bocznych. Oczyszczanie tak otrzymanych surowych peptydów następuje za pomocą chromatografii na RSephadex'ie, żywicach jonowymiennych albo przez HPLC. Sposób według wynalazku odznacza się tym, że za pomocą syntezy w fazie stałej - syntezy Merrifield'a można wytwarzać peptydy, które zawierają C-końcowo amid azaaminokwasu. Synteza Merrifield jest wprawdzie znana już od dawna, jednak dotychczas nie było możliwe otrzymanie z ubogą racemizacją wyżej wymienionych peptydów z C-końcowym azaaminokwasem. Udaje się to nieoczekiwanie tylko za pomocą sposobu według wynalazku, w którym najpierw związek o wzorze 2 przeprowadza się w postać zdolną do acylowania, tę ostatnią poddaje się reakcji z pochodną kwasu mrówkowego i następnie hydrazydem aminokwasu a potem przyłącza do żywicy; dopiero po tych etapach wstępnych zaczyna się właściwa synteza w fazie stałej, jednak nie tak jak to jest powszechnie stosowane, zaczynając przy C-skrajnym końcu z pierwszym aminokwasem, lecz z drugi aminokwasem. Sposób syntezy w fazie stałej wyróżnia się przy wytwarzaniu Ac-D-Nal(2)-p-Cl-D-Phe-D-Trp- Ser-Tyr-D-Ser(α-L-Rha)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2 oraz pglu-his-trp-ser-tyr-d-ser(tbu)-leu- Arg-Pro-Azagly-NH2 (Zoladex). Oznaczenie stosowanych skrótów: BSA bistrimetylosililoacetamid; Cha cykloheksyloalanina; Chg cykloheksyloglicyna; DCC dicykloheksylokarbodiimid; DIS diizopropylokarbodiimid; DMAP dimetyloaminopirydyna; Fmoc 9-fluorenylometoksykarbonyl; HOBt 1-hydroksybenzotriazol; HOObt 3-hydroksy-4-okso-3,4-dihydro-1,2,3-benzotriazyna; Nal naftyloalanina; Npg neopentyloglicyna; Pmc 2,2,5,7,8-pentametylochromano-6-sulfonyl; Tbg tert-butyloglicyna; THF tetrahydrofuran; Thia 2-tienyloalanina. Poniższe przykłady objaśniają wynalazek, nie ograniczając go. Przykład I. Ia) 5-etoksykarbonylo-2,4-dimetoksy-4'-metoksybenzhydryloamina. 17,5 g 5-etoksykarabonylo-2,4-dimetoksy-4'-metoksybenzofenonooksymu rozpuszczono w 450 ml mieszaniny 1:1 etanolu i DMF, i dodano 2 ml stężonego NH3. Po dodaniu katalizatora Pt/C uwodorniano przy normalnym ciśnieniu przez 5 dni. Po zakończeniu reakcji odsączono katalizator pod zmniejszonym ciśnieniem, przesącz zatężono i produkt wytrącono eterem. Produkt ten stosowano jako taki bez dalszego oczyszczania.

5 Ib) N-(p-nitrofenoksykarbonylo)-5-etoksykarbonylo-3,4-dimetoksy-4'-metoksybenzhydryloamina. 10 g tytułowego związku Ia) umieszczono w mieszaninie 4:1 THF/DMF i w temperaturze pokojowej dodano 2,1 równoważnika bistrimetylosililoacetamidu (BSA). Zawiesina wyklarowała się całkowicie po krótkim czasie i klarowany roztwór mieszano dalej przez 2 godziny. Następnie dodano 3 g chloromrówczanu nitrofenylu i mieszano przez dalszą godzinę. Po zakończeniu reakcji usunięto rozpuszczalnik w wysokiej próżni. Pozostałość zadano 300 ml wody i powstały olej ekstrahowano octanem etylu. Fazę octanu etylu przemyto 1N roztworem KHSO4 i wodą. Fazę organiczną wysuszono nad MgSO4 i odparowano do sucha. Pozostałość (12 g) scharakteryzowano za pomocą NMR, IR oraz MS. N-(p-nitrofenoksykarbonylo)-5-etoksykarbonylo-2,4-dimetoksy-4'-metoksybenzhydryloaminę poddano następnie reakcji z hydrazydami aminokwasów w celu otrzymania odpowiednich podstawionych grup funkcyjnych. Ic)Benzyloksykarbonylo-4-prolilo-azaglicylo-(5-etoksykarbonylo-2,4-dimetoksy-4'-metoksybenzhydrylo)-amid. 3,27 g chlorowodorku benzyloksykarbonylo-prolilohydrazydu i 6,94 g tytułowego związku z przykładu Ib) rozpuszczono w 40 ml dimetyloformamidu (DMF) i dodano 3 równoważniki N- etylomorfoliny i katalityczną ilość dimetyloaminopirydyny (DMAP). Pozostawiono na 16 godzin do przereagowania. Po zakończeniu reakcji odparowano do sucha. Pozostałość przeniesiono do układu octan etylu/butanol i fazę organiczną przemyto nasyconym roztworem NaHCO3, 1N roztworem KHSO4 i wodą. Fazę organiczną wysuszono nad MgSO4 i po przesączeniu odparowano do sucha. Pozostałość przekrystalizowano z czystego octanu etylu. Otrzymano 6,6 g tytułowego związku. FAB-MS: 641 (M + Li+). IR: CO 1695 cm-1. 1H-NMR (DMSO): δ = 3,7 s (6H,- OCH3)ppm. Id) 9-fluorenylometoksykarbonylo-L-prolilo-azaglicylo-(5-etoksykarbonylo-2,4-dimetoksy- 4'-metoksybenzhydrylo)-amid. 26,5 g tytułowego związku z przykładu Ic) rozpuszczono w 300 ml metanolu i dodano 2 g katalizatora Pd. Po godzinie uwodornienie było zakończone. Katalizator odsączono, przesącz zatężono do sucha. Pozostałość (17,5 g) bez dalszego oczyszczania przeniesiono do mieszaniny złożonej z 80 ml wody i 80 ml dioksanu, i dodano 8g wodorowęglanu sodu i 17 g 9-fluorenylometoksykarbonylo-N- hydroksy sukcynimidu (Fmoc-ONSu). Pozostawiono na 1 dzień w celu przereagowania. Po zakończeniu reakcji przesączono przez warstwowy filtr klarujący. Przesącz ustawiono na ph = 6 za pomocą 2 N H2SO4 i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem do objętości 80 ml. Rozcieńczono przy użyciu 100 ml wody i ekstrahowano mieszaniną 8,5:1,5 octan etylu/nbutanol. Fazę organiczną przemyto półnasyconym roztworem NaCl i potem odparowano do sucha. Pozostałość przesączono przez 500 g silikażelu przy użyciu octanu etylu. Otrzymano 20 g związku tytułowego. FAB-MS: 729 (M+ Li+). IR: CO 1695 cm-1. Ie) Sprzęgnięcie tytułowego związku z przykładu Id) z żywicą polistyrenową. 1,0 g żywicy aminometylopolistyrenowej (nasycenie 1,07 mmoli) i 1,2 g tytułowego związku z przykładu Id) przeprowadzono w stan zawiesiny w 10 ml dimetyloformamidu i dodano 216 mg 1-hydroksybenzotriazolu (HOBt) i 0,75 ml diizopropylokarbodiimidu (DIC). Pozostawiono przez noc w celu przereagowania aż test ninhydrynowy wykazał całkowitą reakcję. Żywicę odsączono, przemyto dimetyloformamidem oraz chlorkiem metylenu i wysuszono dokładnie pod zmniejszonym ciśnieniem. Nasycenie żywicy proliną wynosiło 0,51 mmola/g. If) Ac-D-Nal(2)-p-Cl-D-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(α-L-Rha)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2. Grupę 9-fluorenylometoksykarbonylo jako grupę ochroną grupy N-α-aminowej związku z przykładu Ie) odszczepiono przy użyciu 20% roztworu piperydyny w dimetyloformamidzie (2X3 min, 2X8 ml). Następnie żywicę przemyto N-metylopirolidonem (5 X 10 mi) i budowano peptyd na żywicy (785 mg żywicy z przykładu Ic)), przy czym przeprowadzano cyklicznie następujące etapy: - odszczepienie grupy ochronnej Fmoc za pomocą 20% roztworu piperydyny w DMF - przemycie żywicy układem DMF/N-metylopirolidynon - przyłączenie Fmoc-aminokwasu przy aktywowaniu in situ jako HOBt-ester przy zastosowaniu diizopropylokarbodiimidu jako odczynnika aktywującego (1,5 mmoli aminokwasu, 2,25 mmoli HOBt, 1,6 mmoli diizopropylokarbodiimidu)

6 Jeżeli sprzęgnięcie było niecałkowite (test Kaiser'a) powtarzano etap sprzęgania. Jako ostatni aminokwas zastosowano Fmoc-D-Nał(2)-OH. N-końcową grupę acetylową wprowadzono przez reakcję z bezwodnikiem kwasu octowego. Po zakończeniu syntezy w fazie stałej żywicę przemyto (DMF, CH 2Cl2) i dokładnie wysuszono. Otrzymano 1,35 g podstawionej żywicy. Wysuszoną żywicę przeprowadzono w stan zawiesiny w 0,75 ml etanoditiolu w temperaturze pokojowej. Po 15 minutach dodano 7,5 ml kwasu trifluorooctowego i zawiesinę mieszano w ciągu 1,5 godziny. Po upływie tego czasu żywicę odsączono i przemyto dokładnie 80% kwasem trifluorooctowym. Przesącz zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość przeniesiono do 30 ml wody. Przez dodanie NaHCO3 ustawiono ph na 6-7 i peptyd wytrząśnięto z n-pentanolem (4 X 30 ml). Fazę n-pentanolową zatężono i pozostałość przeniesiono do 10 ml układu metanol/ /woda (9:1) i dodano 0,5 g K2CO3. Mieszano przez 30 minut, przesączono i przesącz zatężono. Pozostałość przeniesiono do 100 ml n-pentanolu i fazę organiczną przemyto wodą. Po wysuszeniu za pomocą MgSO4 i przesączeniu fazę organiczną zatężono. Otrzymano 740 mg surowego produktu. Po chromatografii na RSephadex'ie G25 (1M kwasu octowego) i na silikażelu otrzymano 185 g czystego związku tytułowego. FAB-MS: 1531 (M+ H*). Związki według następujących przykładów II-XI otrzymano analogicznie jak w przykładzie I. Przykład II. Ac-Nal(2V-p-Cl-D-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(α-L-Rha)-Leu-Arg-Pro-Azagly- NH2. FAB-MS: 1531 (M +H +). Przykład III. Ac-D-Nal(2)-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(α-L-Rha)-Leu-Arg-Pro- Przykład IV. Ac-D-Nal(2)-p-Cl-D-Phe-Trp-Sα -Tyr-D-Ser(α-L-Rha)-Leu-Arg-Pro- Azagly-NHa. FAB-MS: 1531 (M + H+). Przykład V. Ac-D-Nal(2)-p-Cl-D-Phe-D-Trp-Sα -Tyr-D-Ser(α-L-Rha)-Leu-Arg-Pro- P r z y k ł a d VI. Ac-D-Nal(2)-p-Cl-D-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(α-L-Rha)-Leu-Arg-Pro- Przykład VII. Ac-D-Nal(2)-p-Cl-D-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(α-L-Rha)-Leu-Arg-Pro- Azagly-NH2. FAB-MS: 1531 (M + H ). Przykład VIII. Ac-D-Nal(2)-p-Cl-D-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(α-L-Rha)-D-Leu-Arg-Pro- Przykład IX. Ac-D-Nal(2)-p-Cł-D-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(α-L-Rha)-Leu-D-Arg-Pro- PrzykładX. Ac-D-Nal(2)-p-Cl-D-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(α-L-Rha)-Leu-Arg-D-Pro- Azagly-NH2. a) Benzyloksykarbonylo-4-D-prolilo-azaglicylo-(5-karboksylanoetylo-2,4-dimetoksy-4'- metoksybenzylohydrylo)amid. 1,19 g chlorowodorku benzyloksykarabonylo-d-prolilohydrazydu rozpuszczono w 15 ml dimetyloformamidu (DMF) i dodano 1,84 g związku tytułowego z przykładu Ib), 1,5 ml N- etylomorfoliny oraz katalityczną ilość dimetyloaminopirydyny (DMAP). Mieszano w ciągu nocy w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu reakcji oddestylowano DMF pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość rozpuszczono w chlorku metylenu. Fazę organiczną przemyto za pomocą 15% roztworu KHSO4/K2SO4, wysuszono nad MgSO4 i wirowano. Otrzymano 3,4 g oleju. Następnie chromatografowano na żelu krzemionkowym (gradient z octanu etylu pur (500 ml) do octanu etylu/metanolu 50:2 (1000 ml)). Wydajność: 2,1 g. FAB-MS: 635 (M + H+). b) H-D-prolilo-azaglicylo(5-karboksylanoetylo-2,4-dimetoksy-4'-metoksy-benzhydrylo)- amid. 800 g związku tytułowego z przykładu X a) rozpuszczono w 20 ml metanolu i dodano mały czubek łopatki laboratoryjnej Pd na węglu (10%) w atmosferze azotu. Potem przeprowadza się wodór. Po 45 minutach uwodornianie było zakończone. Mieszaninę reakcyjną filtrowano przez warstwowy filtr klarujący i przesącz wirowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymano 600 mg związku tytułowego. c) 9-fluorenylometoksykarbonylo-D-prolilo-azaglicylo(5-karboksylanoetylo-2,4-dimetoksy- 4'-metoksy-benzhydrylo)amid.

7 g związku tytułowego z przykładu Xb) rozpuszczono w 15 ml dioksanu/wody (1:1) i dodano 336 mg wodorowęglanu sodu oraz porcjami 674 mg 9-fłuorenylometoksy-karbonyio-N-hydroksysukcynimidu (Fmoc-ONSu) i mieszano przez noc w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu reakcji oddestylowano wszvstko aż do wodv pod zmnijszonym ciśnieniem i pozostającą fazę wodną zakwaszono za pomocą 1N H2SO4. Produkt ekstrahowano 2 razy za pomocą octanu etylu, fazę organiczną przemyto jeden raz za pomocą nasyconego roztworu NaHCO3, wysuszono nad MgSO4 i rozpuszczalnik oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymano 1,4 g surowego produktu, który chromatograf o wano na żelu krzemionkowym (eluent chlorek metylenu:metanol:woda:kwas octowy 95:5:0,5:0,5). Wydajność: 870 mg FAB-MS: 745 (M+ Na+ ). d) Sprzęganie związku tytułowego z przykładu Xc)) z żywicą polistyrenową. 1,0 g żywicy aminometylopolistyrenowej (naładowanie 1,07 mmoli) i 1,2 związku tytułowego z przykładu Xc) zawieszono w 15 ml dimetyloformamidu i dodano 216 mg 1-hydroksy-benzotriazolu (HOBt) i 0,75 ml diizopropylokarbodiimidu (DIC). Pozostawiono przez noc do przereagowania w temperaturze pokojowej dotąd, aż test ninhydryny wykazał reakcję całkowitą. Żywicę odsączono i przemyto za pomocą dimetyloformamidu, chlorku metylenu i metylo-tert.butyloeteru. Wydajność żywicy wynosiła: 1,5 g. Naładowanie żywicy D-proliną wynosiło 0,256 mmol/g. Przykład XI. p-glu-his-trp-sα-tyr-d-ser(tbu)-leu-arg-pro-azagly-nh2. Ten związek otrzymano analogicznie do przykładu I. FAB-MS: 1398(M+H+). Przykład XII. Ogólny przepis wytwarzania soli. 100 mg związku z przykładów I-XI (postać trifluorooctanu) rozpuszcza się w 5-10 ml wody (ph 1,5-2) i dodaje czubek łopatki laboratoryjnej wymieniacza jonowego Amberlite IRA 45 (postać octanu lub postać chlorku). Wymieniacz jonowy miesza się i mierzy wartość ph. Jeśli zakres ph 3,5-4 kwasu octowego lub kwasu solnego ph 1-2 nie został jeszcze osiągnięty, dodaje się jeszcze dalszy wymieniacz jonowy. Następnie osącza się wymieniacz jonowy i przemywa dodatkowo za pomocą niewielkiej ilości wody. Roztwór peptydu oddestylowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem albo poddaje liofilizacji.

8 WZÓR 1 WZÓR 2 WZÓR 3 W zó r 4 Wzór 5 Departament Wydawnictw UP RP Nakład 90 egz. Cena 1,50 zł