(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) (1) T3 Int.Cl. C12N 1/8 (06.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 13/38 EP B1 (4) Tytuł wynalazku: Sposoby selekcji komórek eukariotycznych wykazujących ekspresję heterologicznego białka (30) Pierwszeństwo: EP (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 12/01 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 14/02 (73) Uprawniony z patentu: Novartis AG, Basel, CH (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 THOMAS JOSTOCK, Basel, CH HANS-PETER KNOPF, Schallstadt, DE (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Marek Łazewski LDS ŁAZEWSKI DEPO I WSPÓLNICY SP. K. ul. Okopowa 8/ Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 1 Z-1141 EP B1 Sposoby selekcji komórek eukariotycznych wykazujących ekspresję heterologicznego białka Opis DZIEDZINA WYNALAZKU [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy nowego sposobu selekcji eukariotycznych komórek gospodarza, w szczególności komórek ssaczych, wykazujących ekspresję produktu będącego przedmiotem zainteresowania. Ponadto, niniejszy wynalazek dotyczy sposobu efektywnego wytwarzania produktu będącego przedmiotem zainteresowania z wysoką wydajnością. 1 TŁO WYNALAZKU [0002] Coraz istotniejsza staje się zdolność do klonowania i ekspresji produktów będących przedmiotem zainteresowania, takich jak rekombinowane peptydy i białka w dużych ilościach. Zdolność do oczyszczania wysokich poziomów białek jest ważna w dziedzinie środków farmaceutycznych stosowanych u ludzi i biotechnologii, na przykład do wytwarzania środków farmaceutycznych na bazie białek, a także w badaniach podstawowych, na przykład w krystalizacji białek, aby umożliwić ustalenie ich struktury trójwymiarowej. Białka, które w inny sposób trudno otrzymać ilościowo można poddawać nadekspresji w komórkach gospodarza, a następnie wyodrębniać i oczyszczać. 2 [0003] Wybór systemu ekspresyjnego do wytwarzania białek rekombinowanych zależy od wielu czynników, włączając właściwości namnażania komórek, poziomy ekspresji, ekspresję wewnątrzkomórkową i zewnątrzkomórkową, modyfikacje potranslacyjne i aktywność biologiczną białka będącego przedmiotem zainteresowania, a także aspekty regulacji i kwestie

3 2 ekonomiczne produkcji białek terapeutycznych. Główne zalety komórek ssaczych w stosunku do innych systemów ekspresyjnych, takich jak bakterie lub drożdże, to zdolność przeprowadzania prawidłowego fałdowania białek, złożonej N-glikozylacji i autentycznej O- glikozylacji, jak również szeroki zakres innych modyfikacji potranslacyjnych. Z powodu opisanych zalet, komórki eukariotyczne, w szczególności komórki ssaków są obecnie systemem ekspresji z wyboru służącym do produkcji złożonych białek terapeutycznych, takich jak przeciwciała monoklonalne. [0004] W najpowszechniejszym podejściu w celu uzyskania komórek gospodarza wykazujących wysoki poziom ekspresji (określanych także jako wysokowydajni producenci) generuje się odpowiedni wektor ekspresyjny do ekspresji produktu będącego przedmiotem zainteresowania, jako pierwszy etap. Wektor ekspresyjny kieruje ekspresją polinukleotydu kodującego produkt będący przedmiotem zainteresowania w komórce gospodarza i zapewnia co najmniej jeden marker selekcyjny do generowania linii komórek rekombinowanych. Kluczowe elementy ssaczych wektorów ekspresyjnych obejmują zwykle konstytutywny lub 1 indukowany promotor o silnej aktywności transkrypcyjnej; zoptymalizowane procesowanie mrna i sygnały translacji, które zazwyczaj zawierają sekwencję Kozak, kodon terminacji translacji, sygnały cięcia mrna i poliadenylacji, terminator transkrypcji i markery selekcyjne do wytworzenia stabilnych linii komórkowych i do amplifikacji genu; ponadto wektor ekspresyjny może zapewniać prokariotyczne miejsce inicjacji replikacji i markery selekcyjne do propagacji wektora w bakteriach. [000] W ciągu ostatnich lat skupiono się na projektowaniu ulepszonych wektorów do ekspresji genów w komórkach gospodarza. Jednak pomimo różnorodności dostępnych wektorów, efektywne wytwarzanie polipeptydów/białek z dużą wydajnością w komórkach ssaków jest nadal wyzwaniem. 2 [0006] Jedną z ustalonych procedur otrzymywania wysokowydajnych linii komórkowych wykazujących ekspresję produktu będącego przedmiotem zainteresowania z wysoką wydajnością jest stabilna transfekcja komórek gospodarza. Jednakże, stabilna

4 3 integracja z genomem jest rzadka i tylko mała część stabilnie transfekowanych komórek to wysokowydajni producenci. Ich wybór stanowi zatem wyzwanie. [0007] Markery selekcyjne i systemy selekcji są szeroko stosowane w inżynierii genetycznej, rekombinacji DNA i wytwarzaniu rekombinowanych produktów, w celu uzyskania komórek gospodarza wykazujących ekspresję produktu będącego przedmiotem zainteresowania z wysoką wydajnością. Odpowiednie układy są również przydatne do wytwarzania i identyfikacji stabilnie transfekowanych klonów. Głównym celem zastosowania odpowiednich markerów selekcyjnych i systemów selekcji jest wprowadzenie genu selekcyjnego, który po wystawieniu na działanie selektywnych warunków wzrostu pozwala na identyfikację komórek zdolnych do produkcji na wysokim poziomie wprowadzonego markera selekcyjnego i odpowiednio, rekombinowanego produktu będącego przedmiotem zainteresowania. Zwiększenie wydajności ekspresji produktu można, np. uzyskać poprzez amplifikację genów z zastosowaniem linii komórkowych, np. z niedoborem enzymu, takiego jak reduktaza dihydrofolianowa (DHFR) lub syntetaza glutaminowa (GS) w połączeniu z 1 wektorami ekspresyjnymi zawierającymi geny kodujące te enzymy markerów selekcyjnych oraz środki, takie jak metotreksat (MTX), który hamuje DHFR, i sulfoksamina metioniny (MSX), która hamuje GS. [0008] W EP opisano sposób otrzymywania transformanta komórki zwierzęcej, w którym ten transformant otrzymuje się przez wprowadzenie do komórki zwierzęcej typu dzikiego genu DHFR typu dzikiego i genu strukturalnego, który koduje białko będące przedmiotem zainteresowania. Komórki hoduje się w selektywnej pożywce hodowlanej zawierającej metotreksat (MTX). [0009] Zhou i wsp. (06, Progress Biotechnology 22, ) opisali system selekcji DHFR, w którym komórki CHO ko-transfekowano przy użyciu plazmidów, jednego 2 zawierającego geny łańcucha ciężkiego IgG i reduktazy dihydrofolianowej oraz drugiego zawierającego geny łańcucha lekkiego IgG i fosforotransferazy neomycyny (neo). Komórki hoduje się poprzez stopniowe wzrosty stężenia metotreksatu (MTX) i podano (niezweryf.) wydajności.

5 4 [00] Mayer-Kuckuk i wsp. (PNAS, 19 marca, 02, t. 99 nr 6; ) opisuje, że ludzkie komórki w przeciwieństwie do antyfolianów wykazują szybki wzrost poziomu enzymu reduktazy dihydrofolianowej. [0011] Zhu i wsp. (Journal of Experimental Therapeutics and Oncology, 2: , 02) wykazali, że poważne ograniczenia folianów powodują wyczerpanie i zmiany w składzie wewnątrzkomórkowej puli folianów, umiarkowane uwrażliwianie na metotreksat i trimetryksat oraz pozytywną regulację endogennej aktywności DHFR. [0012] Santos i wsp. (Bioorganic and Medicinal Chemistry 1 (07), 1266/74) opisują serię nowych aminopteroilowych pochodnych hydroksaminianowych nacelowanych na dwie rodziny enzymów, a mianowicie metaloproteinazy matrycowe i reduktazę dihydrofolianową. Ich działanie badano w modelach hodowli komórkowych in vitro. [0013] Etienne i wsp. (Biochemical Pharmacology, t. 46, nr, str , 1993) analizują wpływ in vitro różnych stężeń zredukowanych folianów z MTX na różne typy komórek rakowych. 1 [0014] Backus i wsp. (Int. J. Cancer: 87, (00)), analizują wpływ zubożenia folianów na wrażliwość linii komórkowych guzów litych na różne inhibitory TS lub DHFR. [001] Jeden z ważnych systemów selekcji, który jest powszechnie stosowany w stanie techniki to system selekcji reduktaza dihydrofolianowa/mtx. Reduktaza dihydrofolianowa (DHFR) katalizuje zależną od NADP redukcję kwasu dihydrofoliowego do kwasu tetrahydrofoliowego (THF). THF jest następnie wewnętrznie przekształcany do - formylo-dhf i,-metyleno-dhf, które są stosowane w biosyntezie de novo, odpowiednio, puryn i tymidylanu. DHF jest produktem ubocznym aktywności katalitycznej syntazy tymidylanowej (TS), która katalizuje konwersję dump do dtmp w reakcji zależnej od,- 2 metyleno-thf. Tak więc, reduktaza DHFR jest kluczowa dla recyklingu kofaktorów THF, które są niezbędne do biosyntezy nukleotydów pirymidynowych i purynowych, niezbędnych dla replikacji DNA. Zatem, komórki (na przykład komórki CHO), którym brakuje genu DHFR (t.j. przez ukierunkowaną delecję genomu) można stosować jako biorców transfekcji genu DHFR w

6 podłożu, które jest wolne od nukleotydów. Po transfekcji, komórki mogą być poddane stopniowemu wzrostowi stężeń antyfolianu MTX, najsilniejszego inhibitora DHFR (Kd = 1 pm), zmuszając w ten sposób komórki do wytwarzania zwiększonych stężeń DHFR. Po wielu rundach selekcji, marker selekcyjny DHFR często ulega istotnej amplifikacji. Również bardziej wrażliwe zmutowane postacie odpowiednich markerów selekcyjnych mogą być stosowane w połączeniu z komórkami gospodarza typu dzikiego. Alternatywnie, zmutowana mysia reduktaza DHFR o dużej oporności, tj. mniejszej czułości, na MTX lub inne zmutowane postaci DHFR również były szeroko stosowane jako dominujący marker selekcyjny, który istotnie zwiększał nabywanie wysokiego poziomu oporności na MTX w transfekowanych komórkach. Jednakże główną wadą systemu selekcji DHFR/MTX stosowanego w stanie techniki jest to, że w technice tej wykorzystuje się mutagenny cytotoksyczny środek, MTX, który, zwłaszcza w wyższych stężeniach, może modyfikować genotyp biorców komórek. Prowadzi to często do populacji komórek opornych na MTX, w których nie zachodzi ekspresja genu będącego przedmiotem zainteresowania z powodu mutacji typu utraty funkcji, na przykład, w nośniku 1 zredukowanych folianów (RFC)/lub utraty ekspresji genu RFC, z których oba hamują pobór MTX. Jednakże, wzrastające/wysokie stężenia MTX są konieczne dla osiągnięcia wystarczająco restrykcyjnych warunków selekcji w celu wyizolowania komórek gospodarza wytwarzających produkt będący przedmiotem zainteresowania z wystarczającą wydajnością. [0016] Staje się oczywiste, że w celu wzbogacenia wysokowydajnych komórek z transfekowanej populacji kluczowy jest restrykcyjny system selekcji. Im większa restrykcyjność systemu selekcji, tym mniejsza liczba niskowydajnych producentów po procesie selekcji i większa szansa, aby znaleźć bardzo rzadkie ultra-wysokowydajne klony w populacji transfekowanych komórek. [0017] W związku z tym, przedmiotem niniejszego wynalazku jest dostarczenie 2 restrykcyjnego systemu selekcji do selekcji komórek gospodarza produkujących produkt będący przedmiotem zainteresowania z wysoką wydajnością, jak również sposobów wytwarzania produktu będącego przedmiotem zainteresowania z wystarczającą wydajnością. W szczególności, celem niniejszego wynalazku jest zapewnienie restrykcyjnego systemu

7 6 selekcji, który wymaga mniejszej ilości środków toksycznych, w szczególności MTX. Ponadto, przedmiotem niniejszego wynalazku jest dostarczenie sposobu wytwarzania produktu będącego przedmiotem zainteresowania z wysoką wydajnością. STRESZCZENIE WYNALAZKU [0018] Niniejszy wynalazek odnosi się do systemu selekcji komórek gospodarza wykazujących ekspresję produktu będącego przedmiotem zainteresowania z wysoką wydajnością i wytwarzania odpowiednich produktów, w szczególności polipeptydów, takich jak przeciwciała. [0019] Zgodnie z jednym z aspektów, niniejszy wynalazek dotyczy sposobu selekcji co najmniej jednej eukariotycznej komórki gospodarza eksprymującej produkt będącego przedmiotem zainteresowania, przy czym sposób obejmuje co najmniej następujące etapy: (a) dostarczania wielu transfekowanych eukariotycznych komórek gospodarza, przy czym żywotność wymienionych komórek gospodarza zależy od poboru folianu, przy czym 1 wymienione eukariotyczne komórki gospodarza zawierają co najmniej (i) wprowadzony polinukleotyd kodujący produkt będący przedmiotem zainteresowania i (ii) wprowadzony polinukleotyd kodujący enzym DHFR; (b) hodowania tych wielu eukariotycznych komórek gospodarza w selektywnej pożywce hodowlanej zawierającej co najmniej inhibitor DHFR i folian w ograniczającym stężeniu; (c) selekcji co najmniej jednej eukariotycznej komórki gospodarza eksprymującej produkt będącego przedmiotem zainteresowania. [00] Wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania produktu będącego 2 przedmiotem zainteresowania, obejmującego hodowanie komórki gospodarza wyselekcjonowanej według niniejszego wynalazku, w warunkach pozwalających na ekspresję produktu będącego przedmiotem zainteresowania.

8 7 [0021] Ponadto dostarczana jest selektywna pożywka, zawierająca co najmniej inhibitor DHFR i folian w ograniczającym stężeniu do zastosowania w sposobie selekcji według niniejszego wynalazku. Selektywna pożywka jest podłożem do hodowli komórkowej przydatnym do selekcji komórek gospodarza. [0022] Inne cele, cechy, zalety i aspekty niniejszego zgłoszenia staną się oczywiste dla specjalistów w tej dziedzinie na podstawie poniższego opisu i załączonych zastrzeżeń. Należy jednak rozumieć, że poniższy opis, załączone zastrzeżenia i konkretne przykłady, wskazujące korzystne wykonania zgłoszenia, zamieszczono jedynie w celu ilustracji. Różne zmiany i modyfikacje w obrębie istoty i zakresu ujawnionego wynalazku będą oczywiste dla osób biegłych w dziedzinie na podstawie poniższej lektury. SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU [0023] Niniejszy wynalazek dotyczy systemu selekcji z zastosowaniem DHFR jako markera selekcyjnego, który wymaga niższego stężenia toksycznych środków, takich jak 1 antyfolian MTX, ale nadal zapewnia rygorystyczne warunki selekcji wystarczające do identyfikacji wysokowydajnych komórek gospodarza. [0024] Zgodnie z jednym aspektem niniejszego wynalazku, zapewniany jest sposób selekcji co najmniej jednej eukariotycznej komórki gospodarza wykazującej ekspresję produktu będącego przedmiotem zainteresowania, który to sposób obejmuje co najmniej następujące etapy: (a) dostarczania wielu transfekowanych eukariotycznych komórek gospodarza, przy czym żywotność wymienionych komórek gospodarza zależy od poboru folianu, przy czym wymienione eukariotyczne komórki gospodarza zawierają co najmniej (i) wprowadzony polinukleotyd kodujący produkt będący przedmiotem 2 zainteresowania i (ii) wprowadzony polinukleotyd kodujący enzym DHFR;

9 8 (b) hodowanie wymienionych wielu eukariotycznych komórek gospodarza w selektywnej pożywce hodowlanej zawierającej co najmniej inhibitor DHFR i folian w ograniczającym stężeniu; (c) selekcję co najmniej jednej eukariotycznej komórki gospodarza wykazującej ekspresję produktu będącego przedmiotem zainteresowania. [002] Polinukleotyd jest polimerem nukleotydów, które są zazwyczaj połączone od jednej deoksyrybozy lub rybozy do drugiej, i odnosi się do DNA, jak i RNA, w zależności od kontekstu. Termin polinukleotyd nie implikuje żadnych ograniczeń wielkości i obejmuje również polinukleotydy zawierające modyfikacje, w szczególności zmodyfikowane nukleotydy. [0026] Produkt będący przedmiotem zainteresowania odnosi się do produktu, który ma ulegać ekspresji z wymienionej komórki gospodarza. Produkt będący przedmiotem zainteresowania może być np. polipeptydem lub polinukleotydem, takim jak RNA. Korzystnie, produkt będący przedmiotem zainteresowania jest polipeptydem, w szczególności cząsteczką immunoglobuliny. Dalsze przykłady produktów będących przedmiotem zainteresowania 1 opisano szczegółowo poniżej. [0027] Wprowadzony polinukleotyd odnosi się do sekwencji polinukleotydowej, która została wprowadzona do komórki gospodarza np. techniką rekombinacji, taką jak transfekcja. Komórka gospodarza może, ale nie musi zawierać endogennego polinukleotydu odpowiadającego albo identycznego z wprowadzonym polinukleotydem. Wprowadzenie można osiągnąć np. poprzez transfekcję odpowiedniego wektora, który może integrować się z genomem komórki gospodarza (transfekcja stabilna). Odpowiednie wektory ekspresyjne, umożliwiające wprowadzenie polinukleotydu do komórki gospodarza, opisano szczegółowo poniżej. W przypadku gdy heterologiczny kwas nukleinowy nie jest wstawiany do genomu, heterologiczny kwas nukleinowy może być utracony w późniejszym etapie np. gdy komórki 2 ulegają mitozie (transfekcja przejściowa). Odpowiednie wektory mogą być również utrzymywane w komórce gospodarza bez integracji z genomem np. przez replikację episomalną. Jednakże, również inne techniki wprowadzania polinukleotydu do komórki gospodarza, które opisano bardziej szczegółowo poniżej, są znane w stanie techniki.

10 9 [0028] Inhibitor DHFR to związek, który hamuje aktywność reduktazy dihydrofolianowej (DHFR). Odpowiednie inhibitory mogą, na przykład, konkurować z substratem DHFR w wiązaniu się z DHFR. Odpowiednie inhibitory DHFR to, na przykład, antyfoliany, takie jak metotreksat (MTX). Dalsze przykłady obejmują, ale nie są ograniczone do, glukuronianu trimetreksatu (neutreksyny), trimetoprimu, pirymetaminy i pemetreksedu. [0029] Określenie selekcjonowanie lub selekcja, w znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie, w szczególności odnosi się do procesu stosowania markera selekcyjnego i selektywnych warunków hodowli w celu selekcji, a zatem uzyskania komórek gospodarza z wprowadzonym wektorem lub kombinacją wektorów według niniejszego wynalazku. W ten sposób, komórki gospodarza, które zostały transfekowane z powodzeniem można wyizolować i/lub wzbogacić z populacji transfekowanych komórek gospodarza. [0030] Komórki gospodarza, do których nie wprowadzono z powodzeniem wektora ani kombinacji wektorów według niniejszego wynalazku korzystnie umierają lub ich wzrost jest zaburzony w selektywnych warunkach hodowli w stosunku do komórek gospodarza, do 1 których z powodzeniem wprowadzono wektor lub kombinację wektorów według niniejszego wynalazku. Podczas selekcji, komórki gospodarza, do których z powodzeniem wprowadzono wektor lub kombinację wektorów według niniejszego wynalazku można wzbogacić jako pulę z populacji transfekowanych komórek gospodarza. Również poszczególne komórki gospodarza można wyizolować z populacji transfekowanych komórek gospodarza w czasie selekcji (np. poprzez selekcję klonów). Odpowiednie przykłady procedur selekcji w celu uzyskania pomyślnie transfekowanych komórek gospodarza (np. techniką sortowania FACS lub ograniczonych rozcieńczeń) są dobrze znane w stanie techniki, a w związku z tym nie wymagają szczegółowego omawiania. [0031] Ograniczające stężenie folianu odnosi się do stężenia folianów w pożywce 2 selektywnej, które zapewnia presję selekcyjną na komórki gospodarza. W związku z powyższym, foliany nie są obecne w selektywnej pożywce dopływającej, wywierając w ten sposób presję selekcyjną na komórki gospodarza. Folian obecny w selektywnej pożywce w stężeniu ograniczającym może być pobierany do i przetwarzany przez komórki gospodarza.

11 Foliany, a w szczególności pochodne folianu, które nie byłyby przetwarzane przez komórkę gospodarza nie przyczyniają się do presji selekcyjnej, a zatem nie wnoszą wkładu do presji selekcyjnej. Odpowiednie zakresy stężeń opisano poniżej. [0032] Polipeptyd odnosi się do cząsteczki stanowiącej polimer aminokwasów połączonych ze sobą wiązaniem(ami) peptydowym(ymi). Polipeptydy obejmują polipeptydy o dowolnej długości, w tym białka (na przykład zawierające więcej niż 0 aminokwasów) i peptydy (na przykład zawierające 2-49 aminokwasów). Polipeptydy obejmują białka i/lub peptydy o dowolnej aktywności lub aktywności biologicznej. Odpowiednie przykłady przedstawiono poniżej. [0033] Nieoczekiwanie stwierdzono, że system selekcji dostarczający rekombinowanych komórek eukariotycznych zdolnych do wytwarzania produktu będącego przedmiotem zainteresowania, może być oparty na ograniczonej dostępności folianów w selektywnej pożywce w połączeniu z zastosowaniem DHFR jako markera selekcyjnego. System ma szerokie zastosowanie, tj. do eukariotycznych komórek gospodarza, których żywotność 1 zależy od poboru folianu. Jak opisano powyżej, w stanie techniki konieczne było zastosowanie raczej wysokich stężeń antyfolianu/mtx w celu osiągnięcia wystarczającej presji selekcyjnej na amplifikację genu, a zatem, w celu uzyskania wzrostu wytwarzania produktu będącego przedmiotem zainteresowania. Jest to niekorzystne, ponieważ antyfoliany, takie jak metotreksat, są toksyczne i mogą zmieniać genetycznie komórki gospodarza. Podejście według wynalazku, które opiera się na łącznym zastosowaniu markera selekcyjnego DHFR z ograniczającym stężeniem folianów w selektywnej pożywce hodowlanej ma tę zaletę, że znacznie zwiększa restrykcyjność selekcji, nawet przy niskich stężeniach inhibitora DHFR. W ten sposób, przy użyciu systemu selekcji według niniejszego wynalazku, uzyskuje się wysokowydajnych producentów nawet w przypadku niskich stężeń inhibitora DHFR (na 2 przykład metotreksatu) w selektywnej pożywce. Zatem, dla zapewnienia rygorystycznych warunków selekcji, które pozwalają na identyfikację wysokowydajnych klonów komórek, potrzebne są niższe stężenia inhibitora DHFR i odpowiednio niższe stężenia środka toksycznego, gdy stosuje się wiedzę według niniejszego wynalazku w porównaniu do podejść

12 11 znanych ze stanu techniki. Dzięki swojej unikalnej konstrukcji, dostarczany jest bardzo rygorystyczny system selekcji umożliwiający wzbogacenie wysokowydajnych komórek z populacji transfekowanych komórek gospodarza. Ta wysoka restrykcyjność systemu selekcji według niniejszego wynalazku powoduje zmniejszenie liczby niskowydajnych producentów w populacji po selekcji i zwiększa szansę znalezienia bardzo rzadkich ultra-wysokowydajnych klonów. [0034] Selektywna pożywka może zawierać jeden lub więcej rodzajów folianów. Folian według niniejszego wynalazku może być np. utlenionym folianem (tj. kwasem foliowym) lub zredukowanym folianem lub jego pochodną. Na ogół, folian może być przydatny w niniejszym wynalazku, dopóki będzie mógł być pobierany do komórki eukariotycznej, korzystnie poprzez funkcjonalny związany z błoną receptor folianowy. Utleniony folian, tj. kwas foliowy, jak również zredukowane pochodne kwasu foliowego, znane jako zredukowane foliany lub tetrahydrofoliany (THF), to grupa witamin B-9, będących kofaktorami i/lub koenzymami niezbędnymi do biosyntezy puryn, tymidylanu i pewnych aminokwasów w 1 komórkach eukariotycznych, w szczególności komórkach ssaczych. Kofaktory THF są szczególnie istotne dla replikacji DNA, a tym samym proliferacji. W szczególności, kofaktory THF działają jako donory jednowęglowych jednostek w szeregu połączonych szlaków metabolicznych obejmujących biosyntezę de novo puryn i tymidylanu, aminokwasów, a także metabolizmie grupy metylowej, włączając metylowanie wysepek CpG DNA. W szczególności, kofaktory THF w tym -formylo-thf (-CHO-THF), dają wkład w postaci jednostek jednowęglowych w dwóch kluczowych reakcjach de novo formylotransferazy zaangażowanych w biosyntezę puryn de novo. Korzystnym przykładem utlenionego folianu jest kwas foliowy. Korzystne przykłady zredukowanych folianów to kwas -metylo-tetrahydrofoliowy, kwas - formylo-tetrahydrofoliowy, kwas -formylo-tetrahydrofoliowy i kwas,-metyleno- 2 tetrahydrofoliowy. [003] Stężenie folianu w selektywnej pożywce zależy w szczególności od zastosowanej komórki gospodarza eukariotycznego. Odpowiednie jest stężenie folianu 00 nm lub niższe, nm lub niższe, nm lub niższe, 0 nm lub niższe, 7 nm lub niższe, 0 nm

13 12 lub niższe, lub 2 nm lub niższe, 1 nm lub niższe lub nawet nm lub niższe, takie jak 7, nm lub niższe. Odpowiednie zakresy obejmują 0,1 nm - 00 nm, 0,1 nm - nm, lub nm - nm, korzystnie 1 nm - nm, lub nm - nm, 1 nm - 0 nm, lub nm - 0 nm, a korzystniej 1 nm - 0 nm, 2, nm - 0 nm, nm - 0 nm lub 12, nm - 0 nm. Stężenia te są szczególnie przydatne, gdy jako folian stosuje się kwas foliowy. [0036] Odpowiednie stężenia są ograniczające w sensie tego wynalazku, a tym samym nadające się do zapewnienia presji selekcyjnej na komórki gospodarza. Im niższe stężenie tym silniejsza presja selekcyjna dopóki komórki zachowują żywotność. Opisane zakresy stężeń są szczególnie odpowiednie do zastosowania komórek CHO jako komórek gospodarza. [0037] Stężenie inhibitora DHFR stosowanego w selektywnej pożywce zależy także od zastosowanej komórki gospodarza eukariotycznego. Stężenie inhibitora DHFR 00 nm lub niższe, 400 nm lub niższe, 300 nm lub niższe, nm lub niższe, 0 nm lub niższe, nm lub niższe, jest korzystne w przypadku gdy powinno się obniżyć stężenie inhibitora DHFR w 1 pożywce selektywnej. Jednakże, korzystnie, selektywne podłoże zawiera co najmniej nm inhibitora DHFR. Korzystne stężenie antyfolianu, korzystnie MTX, mieści się w zakresie 1 nm - 00 nm, korzystnie nm - 0 nm, nm - nm, a najkorzystniej nm - 0 nm. Odpowiednie stężenia w selektywnej pożywce są szczególnie odpowiednie dla komórek CHO. [0038] Korzystne opisane powyżej stężenia i zakresy stężenia folianu i antyfolianu można łączyć ze sobą. Zgodnie z jednym wykonaniem, stosuje się selektywną pożywkę hodowlaną, która zawiera stężenie inhibitora DHFR, korzystnie MTX, 0 nm lub niższe, korzystnie nm lub niższe, korzystnie 0 nm lub niższe i stężenie folianu, korzystnie kwasu foliowego, niższe niż 0 nm, korzystnie niższe niż 7 nm. W jednym wykonaniu, stężenie folianu w zakresie 12, nm - 0 nm stosuje się w połączeniu ze stężeniem antyfolianu nm nm. Korzystnie, kwas foliowy i MTX stosuje się jako folian i antyfolian. [0039] Możliwe do realizacji stężenia kwasu foliowego i MTX mogą być zależne od siebie, korzystne jest stężenia kwasu foliowego 2, nm 7 nm, 2, nm - 0 nm albo 12, nm

14 13-0 nm w połączeniu ze stężeniem MTX nm - 00 nm, korzystnie nm - 0 nm. Te stężenia są szczególnie korzystne, gdy stosuje się komórkę DHFR + (dodatnią). [0040] Stężenia opisane powyżej są szczególnie korzystne dla szybko rosnących komórek zawiesinowych, które stanowią korzystny fenotyp linii komórek do komercyjnego wytwarzania. Jednak różne linie komórkowe mogą mieć różne właściwości konsumpcji kwasu foliowego. Ponadto ograniczające/selektywne stężenia mogą się różnić w zależności od zastosowanego folianu albo antyfolianu. W związku z tym, ograniczające stężenia folianu, w szczególności folianu i antyfolianu, w szczególności MTX, a także odpowiedni stosunek kwasu foliowego do MTX mogą się różnić dla różnych linii komórkowych. Odpowiednie stężenia jednak może łatwo określić doświadczalnie osoba biegła w dziedzinie. [0041] Zgodnie z jednym wykonaniem, komórki gospodarza wstępnie hoduje się w pożywce bez folianów lub w pożywce hodowlanej zawierającej ograniczające stężenie folianów przed transfekcją i/lub selekcją. Odpowiednie ograniczające stężenia folianów opisano powyżej. Korzystnie, ta pożywka do wstępnej hodowli komórek gospodarza zawiera folian, w 1 szczególności kwas foliowy, w stężeniu 0 nm lub niższym. [0042] Ekspresja wprowadzonego markera selekcyjnego DHFR zapewnia korzyści selekcji w selektywnych warunkach hodowli komórek gospodarza. Np. komórki gospodarza (np. komórki CHO), którym brakuje genu DHFR (np. przez ukierunkowaną delecję genomu, określane także jako komórki gospodarza DHFR -) mogą być stosowane jako biorcy dla transfekcji genu DHFR jako markera selekcyjnego w pożywce, która jest wolna od nukleotydów. Jednakże, możliwe jest także zastosowanie komórek gospodarza, które eksprymują DHFR endogennie (komórki gospodarza DHFR + (dodatnie)) podczas przeprowadzania selekcji DHFR, jeśli stosuje się odpowiednie warunki selekcji. Po transfekcji polinukleotydami według niniejszego wynalazku, komórki mogą być poddane stopniowemu 2 wzrostowi stężenia inhibitorów DHFR. Jednym z przykładów inhibitorów DHFR są antyfoliany, takie jak MTX, który jest silnym inhibitorem DHFR (Kd=1 pm). Obecność antyfolianu, takiego jak MTX w pożywce zmusza komórki do wytwarzania podwyższonego poziomu DHFR w celu

15 14 przetrwania. Po wielu rundach selekcji, aby to osiągnąć, marker DHFR często ulega istotnej amplifikacji genu. [0043] Kilka odpowiednich genów DHFR, które mogą być stosowane w połączeniu z niniejszym wynalazkiem, są znane w stanie techniki. DHFR może być DHFR typu dzikiego lub jego wariantem funkcjonalnym lub pochodną. Termin wariant lub pochodna obejmuje enzymy DHFR mające jeden lub większą liczbę zamienionych sekwencji aminokwasowych (np. delecji, substytucji lub addycji) względem sekwencji aminokwasowej danego enzymu DHFR, białek fuzyjnych zawierających enzym DHFR lub jego funkcjonalny fragment i enzymów DHFR, które zostały zmodyfikowane w celu zapewnienia dodatkowej struktury i/lub funkcji, a także funkcjonalnych fragmentów powyższych, które nadal wykazują co najmniej jedną funkcję enzymu DHFR. Enzymy/warianty DHFR mogą być stosowane jako markery selekcyjne, które są bardziej lub mniej podatne na MTX niż enzym DHFR typu dzikiego. Zgodnie z jednym z wykonań, stosowany enzym DHFR jest bardziej wrażliwy na antyfoliany, takie jak metotreksat, niż odpowiedni enzym DHFR typu dzikiego i/lub enzym DHFR eksprymowany endogennie 1 przez komórkę gospodarza, jeśli jest eksprymowany. Enzym DHFR może pochodzić z dowolnego gatunku, dopóki będzie to funkcjonalne w zakresie niniejszego wynalazku, tj. kompatybilne ze stosowaną komórką gospodarza. Np. zmutowaną mysią DHFR o dużej oporności na MTX powszechnie stosuje się jako dominujący marker selekcyjny, który znacznie zwiększa nabywanie wysokiej oporności na MTX w transfekowanych komórkach. Korzystnie, enzym DHFR jest stosowany jako mniej podatny, a tym samym mniej wrażliwy na inhibitor DHFR, taki jak metotreksat, niż enzym DHFR eksprymowany endogennie w komórce gospodarza DHFR + (dodatniej). [0044] Zgodnie z jednym wykonaniem, intron lub jego fragment umieszcza się na końcu 3' otwartej ramki odczytu genu DHFR. Ma to korzystny wpływ na szybkość 2 ekspresji/amplifikacji konstruktu. Intron stosowany w kasecie ekspresyjnej DHFR prowadzi do mniejszego, niefunkcjonalnego wariantu genu DHFR (Grillari i wsp., 01, J. Biotechnol. 87, 9-6). W ten sposób poziom ekspresji genu DHFR jest obniżony, a zatem można dodatkowo zwiększyć restrykcyjność systemu selekcji. Odpowiednio, komórki gospodarza mogą zawierać

16 1 wprowadzony polinukleotyd kodujący enzym DHFR, polinukleotyd zawierający intron, który jest zlokalizowany po stronie 3' sekwencji kodującej DHFR. Alternatywne metody wykorzystujące intron w celu obniżenia poziomu ekspresji genu DHFR opisano w EP i również mogą być stosowane. [004] W przeciwieństwie do większości organizmów prokariotycznych, roślin i grzybów, które syntetyzują własne foliany, ssaki i inne gatunki eukariotyczne są pozbawione możliwości biosyntezy kofaktora THF i dlatego muszą je otrzymywać ze źródeł zewnętrznych, zwykle pożywki hodowlanej. Obecnie wiadomo, że w poborze folianów i antyfolianów w komórkach ssaków pośredniczą trzy niezależne systemy transportu, a mianowicie nośnik zredukowanych folianów (RFC); sprzężony z protonami transporter folianów (PCFT, określany również jako SLC46A) i receptory folianów (FR). [0046] Eukariotyczną komórkę gospodarza korzystnie wybiera się z grupy składającej się z komórki ssaka, komórki owada, komórki roślinnej i komórki grzybowej. Komórki grzybów i roślin mogą być prototroficzne dla folianów (tj. takie komórki mogą 1 samodzielnie syntetyzować własne foliany niezbędne dla ich żywotności komórkowej, tj. wzrostu i proliferacji komórek). Niniejszy wynalazek obejmuje w szczególności takie komórki grzybów i roślin, które są lub staną się auksotroficzne dla folianów. Może to być spowodowane, na przykład, manipulacją genetyczną, tj. komórki nie są teraz w stanie syntetyzować wystarczających ilości folianów niezbędnych dla ich żywotności komórkowej. Na przykład, zdolność takich komórek grzybów lub roślin do endogennej biosyntezy folianów, np. poprzez odpowiedni szlak metaboliczny, może być inaktywowana, np. przez przerwanie lub wyciszenie odpowiednich genów docelowych lub hamowanie kluczowych enzymów itp. Korzystnie, komórka gospodarza jest komórką ssaka. Taką komórkę ssaczą można wybrać z grupy składającej się z komórki gryzonia, komórki ludzkiej i komórki małpy. Szczególnie 2 korzystna jest komórka gryzonia, którą korzystnie wybiera się z grupy składającej się z komórki CHO, komórki BHK, komórki NSO, mysiej komórki fibroblastów 3T3 i komórki SP2/0. Szczególnie korzystną komórką gryzonia jest komórka CHO. Także korzystna jest komórka ludzkie, którą, korzystnie, wybiera się z grupy składającej się z komórki HEK293, komórki

17 16 MCF-7, komórki PERC6, komórki HeLa. Ponadto, korzystna jest komórka małpy, którą, korzystnie, wybiera się z grupy składającej się z komórki COS-1, COS-7 i komórki Vero. Komórka gospodarza to korzystnie komórka DHFR + (dodatnia), w szczególności komórka CHO DHFR + (dodatnie). [0047] Zgodnie z jednym wykonaniem, polinukleotyd kodujący produkt będący przedmiotem zainteresowania i polinukleotyd kodujący enzym DHFR wprowadzono z użyciem co najmniej jednego wektora ekspresyjnego. Odpowiednie sposoby wprowadzania odpowiedniego wektora opisano poniżej i obejmują, np. transfekcję. [0048] Wektor ekspresyjny według niniejszego wynalazku jest polinukleotydem zdolnym do przenoszenia przynajmniej jednego obcego fragmentu kwasu nukleinowego. Wektor działa jako nośnik cząsteczkowy, który dostarcza fragmenty kwasów nukleinowych albo polinukleotydów do komórki gospodarza. Zawiera on co najmniej jedną kasetę ekspresyjną zawierającą sekwencje regulatorowe dla odpowiedniej ekspresji włączonego do niej polinukleotydu. Polinukleotydy (np. kodujące produkt będący przedmiotem 1 zainteresowania lub markery selekcyjne) mogą być wstawione do kasety(kaset) ekspresyjnej(ych) wektora ekspresyjnego w celu ekspresji z tej kasety. Wektor ekspresyjny według niniejszego wynalazku może występować w postaci kolistej lub zlinearyzowanej. Termin wektor ekspresyjny obejmuje również sztuczne chromosomy lub podobne odpowiednie polinukleotydy umożliwiające przenoszenie fragmentów obcych kwasów nukleinowych. [0049] Polinukleotyd kodujący produkt będący przedmiotem zainteresowania i polinukleotyd kodujący enzym DHFR mogą być umieszczone w tym samym lub w różnych wektorach ekspresyjnych. Stosowanie wektora ekspresyjnego przenoszącego oba polinukleotydy ma tę zaletę, że tylko jeden wektor ekspresyjny trzeba wprowadzić do komórki 2 gospodarza. Ponadto, w szczególności, gdy wyprowadza się linię wykazującą stabilną ekspresję, jest bardziej prawdopodobne, że polinukleotydy będą zintegrowane ze sobą w genomie, a zatem eksprymowane z podobną wydajnością. Jednakże, możliwe jest również, oraz mieści się w zakresie niniejszego wynalazku, stosowanie kombinacji co najmniej dwóch

18 17 wektorów ekspresyjnych do transfekcji, przy czym odpowiednie polinukleotydy znajdują się w różnych wektorach ekspresyjnych. Tę kombinację wektorów ekspresyjnych następnie transfekuje się do komórki gospodarza. [000] Eukariotyczne komórki gospodarza mogą zawierać co najmniej jeden dodatkowy wprowadzony polinukleotyd kodujący kolejny produkt będący przedmiotem zainteresowania. To wykonanie jest szczególnie odpowiednie dla ekspresji cząsteczek immunoglobuliny. Według korzystnego wykonania, komórka gospodarza obejmuje co najmniej dwa wprowadzane polinukleotydy, z których każdy koduje produkt będący przedmiotem zainteresowania, przy czym co najmniej jeden polinukleotyd koduje łańcuch ciężki cząsteczki immunoglobuliny lub jego funkcjonalny fragment, a drugi polinukleotyd koduje łańcuch lekki cząsteczki immunoglobuliny lub jego funkcjonalny fragment. Odpowiednie polinukleotydy można wprowadzać przy pomocy odpowiedniego wektora ekspresyjnego. Te polinukleotydy kodujące ciężki i lekki łańcuch cząsteczki immunoglobuliny (lub ich funkcjonalny fragment) można umieścić w tym samym lub w różnych wektorach ekspresyjnych w przypadku 1 kombinacji co najmniej dwóch wektorów ekspresyjnych. [001] Komórka gospodarza i odpowiednio wektor ekspresyjny do wprowadzania polinukleotydów do tej komórki gospodarza, może dodatkowo zawierać jeden lub większą liczbę kolejnych polinukleotydów kodujących jeden lub większą liczbę dodatkowych markerów selekcyjnych. Odpowiednio, w jednym wykonaniu niniejszego wynalazku, w celu dalszej poprawy wydajności można stosować ko-selekcję z wykorzystaniem systemu według niniejszego wynalazku razem z jednym lub większą liczbą innych systemów selekcji (np. systemów selekcji opartych na oporności na antybiotyki, takich jak neo/g418). Poza tym, można stosować dalsze eukariotyczne markery selekcyjne, umożliwiając selekcję w eukariotycznych komórkach gospodarza, również prokariotyczne markery selekcyjne, 2 umożliwiające selekcję w eukariotycznych komórkach gospodarza. Przykłady odpowiednich prokariotycznych markerów selekcyjnych to markery, które zapewniają oporność na antybiotyki, takie jak, np. ampicylina, kanamycyna, tetracyklina i/lub chloramfenikol.

19 18 [002] Wektory używane do wprowadzania polinukleotydów do komórek gospodarza zazwyczaj zawierają transkrypcyjne elementy kontrolne odpowiednie do kierowania transkrypcją, takie jak, np., promotory, enhancery, sygnały poliadenylacji, sygnały przerywania lub terminacji transkrypcji jako element kasety ekspresyjnej. Jeśli pożądanym produktem jest białko, odpowiednie translacyjne elementy kontrolne korzystnie włącza się do wektora i funkcjonalnie łączy z polinukleotydami, które mają być eksprymowane, takimi jak, np., nieulegające translacji regiony prowadzące do struktur czapeczki, odpowiednich do rekrutacji rybosomów i kodonów stop celem terminacji procesu translacji. W szczególności, polinukleotyd służący jako geny markerów selekcyjnych oraz polinukleotyd kodujący produkt będący przedmiotem zainteresowania mogą ulegać transkrypcji pod kontrolą elementów transkrypcyjnych obecnych w odpowiednich promotorach. Powstałe transkrypty genów markerów detekcyjnych i te produktu będącego przedmiotem zainteresowania zawierają funkcjonalne elementy translacyjne ułatwiające znaczne poziomy ekspresji białka (tj. translacji) i prawidłową terminację translacji. Funkcjonalna jednostka ekspresyjna, zdolna do 1 prawidłowego kierowania ekspresją wprowadzonego polinukleotydu jest również określana w niniejszym dokumencie jako kaseta ekspresyjna. [003] Wektor ekspresyjny lub kombinacja wektorów ekspresyjnych według niniejszego wynalazku stosowanych do wprowadzania polinukleotydów do eukariotycznych komórek gospodarza mogą zawierać co najmniej jeden promotor i/lub element promotora/enhancera jako element kasety ekspresyjnej. Chociaż fizyczne granice między tymi dwoma elementami kontroli nie zawsze są jasne, termin promotor odnosi się zwykle do miejsca w cząsteczce kwasu nukleinowego, z którym polimeraza RNA i/lub dowolny z powiązanych czynników wiążą się i w którym rozpoczynana jest transkrypcja. Enhancery nasilają aktywność promotora, czasowo, jak i przestrzennie. Wiele promotorów jest 2 transkrypcyjnie aktywnych w wielu typach komórek. Promotory można podzielić na dwie grupy, te, które funkcjonują konstytutywnie i te, które są regulowane przez indukcję lub derepresję. Obie klasy są odpowiednie dla nauki niniejszego wynalazku. Promotory stosowane

20 19 w wysokowydajnej produkcji polipeptydów w komórkach ssaków powinny być silne i korzystnie aktywne w szerokim spektrum typów komórek. [004] Silne promotory konstytutywne, które kierują ekspresją w wielu typach komórek, obejmują, ale nie ograniczają się do, główny późny promotor adenowirusa, średnio wczesny promotor ludzkiego wirusa cytomegalii, promotor SV40 i promotor wirusa mięsaka Rousa oraz promotor mysiej kinazy 3-fosfoglicerynianowej, EF1a. Dobre wyniki uzyskuje się dla wektora ekspresyjnego według wynalazku, gdy promotor i/lub enhancer uzyskuje się z CMV i/lub SV40. Promotory transkrypcyjne można wybrać z grupy składającej się z promotora SV40, promotora CMV, promotora EF1alpha, promotora RSV, promotora BROAD3, promotora mysiego rosa 26, promotora pcefl i promotora β-aktyny. [00] Korzystnie, polinukleotyd kodujący produkt będący przedmiotem zainteresowania i polinukleotyd kodujący enzym DHFR znajdują się pod kontrolą różnych promotorów transkrypcyjnych. Zasadniczo, odpowiedni będzie promotor zdolny do promowania ekspresji, w szczególności transkrypcji, polinukleotydów istotnych w 1 eukariotycznej komórce gospodarza. Te różne promotory transkrypcyjne kierujące ekspresja polinukleotydu mogą być takie same lub różne. [006] Zgodnie z jednym wykonaniem, silniejszy promotor i/lub enhancer stosuje się do kierowania ekspresją polinukleotydu kodującego produkt będący przedmiotem zainteresowania niż do kierowania ekspresją polinukleotydu kodującego enzym DHFR i/lub dodatkowe markery selekcyjne, jeśli są obecne. Taki układ powoduje, że więcej transkryptów jest generowanych dla produktu będącego przedmiotem zainteresowania niż dla markerów selekcyjnych. Korzystne jest, że wytwarzanie produktu będącego przedmiotem zainteresowania przeważa nad wytwarzaniem tych markerów selekcyjnych, ponieważ zdolność komórek do wytwarzania heterologicznych produktów nie jest nieograniczona, a zatem 2 powinna być skoncentrowana na produkcie będącym przedmiotem zainteresowania. Ponadto, proces selekcji występuje tylko na początkowych etapach wyprowadzania linii komórek ekspresyjnych, które następnie w sposób ciągły wytwarzają produkt będący przedmiotem zainteresowania. Tak więc, korzystne jest, aby środki komórkowe były skupione na

21 ekspresji/wytwarzaniu produktu będącego przedmiotem zainteresowania. Ponadto, stosując słabszy promotor do ekspresji markera(ów) selekcyjnego(ych), w szczególności DHFR, zwiększa się dodatkowo presję selekcyjną, a tym samym umożliwia zastosowanie niższych stężeń inhibitorów DHFR w pożywce selekcyjnej. [007] Zgodnie z jednym wykonaniem, promotor kierujący ekspresją polinukleotydu kodującego produkt będący przedmiotem zainteresowania jest promotorem CMV, a promotor kierujący ekspresją polinukleotydu kodującego enzym DHFR jest promotorem SV40. Promotor CMV jest znany jako jeden z najsilniejszych dostępnych promotorów do ekspresji w systemach ssaczych i prowadzi do uzyskania bardzo dobrej wydajności ekspresji. Uważa się, że umożliwia otrzymanie znacznie większej ilości transkryptu niż promotor SV40. [008] Zgodnie z kolejnym wykonaniem, polinukleotyd kodujący produkt będący przedmiotem zainteresowania i polinukleotyd kodujący enzym DHFR znajdują się pod kontrolą tego samego promotora transkrypcji, a zatem są poddawane ekspresji z jednej kasety ekspresyjnej. Odpowiednie promotory opisano powyżej. W tym wykonaniu, jeden długi 1 transkrypt otrzymuje się z odpowiedniej kasety ekspresyjnej, która znajduje się pod kontrolą tego promotora transkrypcji. Zgodnie z jednym wykonaniem, co najmniej jeden z elementów IRES jest funkcjonalnie usytuowany pomiędzy polinukleotydem kodującym produkt będący przedmiotem zainteresowania i/lub polinukleotydem kodującym enzym DHFR. W ten sposób zapewnia się otrzymanie z tego transkryptu oddzielnych produktów translacji. [009] Kaseta ekspresyjna może zawierać odpowiednie miejsce terminacji transkrypcji. To, jako ciągła transkrypcja z promotora położnego wcześniej przez drugą jednostkę transkrypcji, może hamować funkcję dalszego promotora, co jest zjawiskiem znanym jako okluzja promotora lub interferencja transkrypcyjna. Zjawisko to opisano zarówno u prokariontów, jak i eukariontów. Prawidłowe rozmieszczenie sygnałów terminacji 2 transkrypcji między dwoma jednostkami transkrypcyjnymi może zapobiec okluzji promotora. Miejsca terminacji transkrypcji są dobrze scharakteryzowane i wykazano, że ich wprowadzenie do wektorów ekspresyjnych przynosi wiele korzystnych efektów dla ekspresji genów.

22 21 [0060] Stosowana komórka gospodarza jest komórką eukariotyczną, zwłaszcza ssaczą komórką gospodarza. Większość powstających eukariotycznych mrna posiada ogon poli-a na ich końcu 3, który jest dodawany w trakcie złożonego procesu obejmującego cięcie pierwotnego transkryptu i złożoną reakcję poliadenylacji. Ogon polia jest korzystny dla stabilności i zdolności do przenoszenia mrna. W związku z tym, kasety ekspresyjne do ekspresji polinukleotydów kodujących produkt będący przedmiotem zainteresowania i enzym DHFR zwykle zawierają miejsce poliadenylacji odpowiednie dla terminacji transkrypcji i poliadenylacji. Istnieje kilka skutecznych sygnałów polia, które mogą być stosowane w ssaczych wektorach ekspresyjnych, włączając te pochodzące z bydlęcego hormonu wzrostu (bgh), mysiej beta-globiny, wczesnej jednostki transkrypcyjnej SV40 i genu kinazy tymidynowej wirusa opryszczki. Jednakże, znane są również syntetyczne miejsca poliadenylacji (patrz np. wektor ekspresyjny pci-neo Promega, który jest oparty na Levitt wsp., 1989, Genes Dev 3, (7). 19/2). Miejsce poliadenylacji można wybrać z grupy składającej się z miejsca SV40poliA, takiego jak późne miejsce SV40 i wczesne miejsce poli-a (patrz np. plazmid psv2-1 DHFR, jak opisano w Subramani i wsp., 1981, Mol.Cell. Biol ), syntetycznego miejsca polia (patrz np. wektor ekspresyjny PCI-neo Promega, na podstawie Levitt i wsp., 1989, Genes Dev. 3, (7): 19-2) oraz miejsca polia bgh (bydlęcy hormon wzrostu). [0061] Ponadto, kaseta ekspresyjna zawierająca polinukleotyd kodujący produkt będący przedmiotem zainteresowania i polinukleotyd kodujący enzym DHFR może zawierać co najmniej jeden intron. To wykonanie jest szczególnie przydatne, gdy do ekspresji stosuje się ssaczą komórkę gospodarza. Większość genów pochodzących z wyższych eukariontów zawiera introny, które są usuwane podczas przetwarzania RNA. Odpowiednie konstrukty są eksprymowane bardziej efektywnie w systemach transgenicznych niż identyczne konstrukty pozbawione intronów. Zazwyczaj, introny są umieszczone na końcu otwartej ramki odczytu, 2 ale mogą także być umieszczone na końcu 3'. W związku z powyższym, intron może wchodzić w skład kasety(kaset) ekspresyjnej(ych) w celu zwiększenia wydajności ekspresji. Wspomniany intron może być umieszczony pomiędzy promotorem i/lub elementem(ami) promotora/enhancera a -końcem otwartej ramki odczytu polinukleotydu, który ma być

23 22 eksprymowany. W stanie techniki znanych jest wiele odpowiednich intronów, które mogą być stosowane w połączeniu z niniejszym wynalazkiem. [0062] Zgodnie z jednym wykonaniem, intron stosowany w kasetach ekspresyjnych do ekspresji produktu będącego przedmiotem zainteresowania, jest syntetycznym intronem, takim jak intron SIS lub RK. Intron RK jest silnym syntetycznym intronem, który jest korzystnie umieszczony przed kodonem start ATG genu będącego przedmiotem zainteresowania. Intron RK składa się z donorowego miejsca splicingowego intronu promotora CMV i akceptorowego miejsca splicingowego mysiego regionu zmiennego łańcucha ciężkiego IgG (zob., na przykład, Eaton i wsp., 1986, Biochemistry 2, , Neuberger i wsp., 1983, EMBO J. 2(8), ; można go otrzymać z wektora prk- (BD PharMingen)). [0063] Wektor ekspresyjny zawierający polinukleotydy i/lub kasety ekspresyjne, jak opisano powyżej, można transfekować do komórki gospodarza w jego kolistej postaci. Superzwinięte koliste cząsteczki wektora zazwyczaj będą przekształcane do cząsteczek liniowych w jądrze w wyniku aktywności endo i egzonukleaz. Jednakże, linearyzacja wektora 1 ekspresyjnego przed transfekcją często poprawia wydajność stabilnej transfekcji. To, jak również miejsce linearyzacji, można kontrolować, jeśli wektor ekspresyjny jest linearyzowany przed transfekcją. Zatem, zgodnie z jednym wykonaniem niniejszego wynalazku, wektor ekspresyjny lub kombinacja co najmniej dwóch wektorów ekspresyjnych zawiera co najmniej jedno zdefiniowane miejsce restrykcyjne, które może być stosowane do linearyzacji wektora(ów) przed transfekcją. Zgodnie z jednym wykonaniem, miejsce linearyzacji jest umieszczone tak, że po linearyzacji polinukleotyd kodujący enzym DHFR jest położony na końcu polinukleotydu kodującego produkt będący przedmiotem zainteresowania. Ten układ jest korzystny dla amplifikacji genu. W przypadku gdy dodatkowo stosuje się prokariotyczny marker selekcyjny, polinukleotyd kodujący prokariotyczny marker znajduje się na końcu 3 2 polinukleotydu kodującego produkt będący przedmiotem zainteresowania. Powoduje to, że gen prokariotycznego markera selekcyjnego znajduje się 3, a zatem na zewnątrz ssaczej części linearyzowanego kwasu nukleinowego wektora. Takie rozwiązanie jest korzystne, ponieważ geny prokariotyczne nie są zapewne korzystne dla ekspresji w systemach ssaczych,

24 23 ponieważ sekwencje prokariotyczne mogą prowadzić do zwiększonej metylacji lub innych efektów wyciszania w komórkach ssaczych. [0064] Polinukleotyd kodujący produkt będący przedmiotem zainteresowania i polinukleotyd kodujący enzym DHFR są korzystnie stabilnie wprowadzane do wymienionej komórki gospodarza. Stabilne wprowadzenie lub transfekcja są korzystne dla wyprowadzania linii komórek ekspresyjnych, w szczególności na dużą skalę i w związku z tym do przemysłowego wytwarzania produktu będącego przedmiotem zainteresowania. [006] Istnieje wiele odpowiednich metod znanych w stanie techniki wprowadzania polinukleotydów i wektorów ekspresyjnych do eukariotycznych komórek gospodarza, włączając ssacze komórki gospodarza. Odpowiednie sposoby obejmują, ale nie ograniczają się do, transfekcję z użyciem fosforanu wapnia, elektroporację, lipofekcję, transfer genów techniką za pośrednictwem mikrowstrzeliwania i polimeru. Poza tradycyjnymi metodami bazującymi na losowej integracji, również podejścia opierające się na rekombinacji mogą być wykorzystane do przenoszenia polinukleotydu kodującego produkt będący przedmiotem 1 zainteresowania i polinukleotydów kodujących enzym DHFR do genomu komórki gospodarza. Takie metody rekombinacji mogą obejmować stosowanie specyficznych dla miejsca rekombinaz, takich jak Cre, Flp lub ΦC31 (patrz, np., Oumard i wsp., Cytotechnology (06) 0: 93-8), które mogą pośredniczyć w kierowanym wprowadzaniu transgenów. Alternatywnie, do wprowadzania wymienionych polinukleotydów można wykorzystać mechanizm rekombinacji homologicznej (przeglądu dokonano w Sorrell i wsp., Biotechnology Advances 23 (0) ). Insercja genów na bazie rekombinacji pozwala zminimalizować liczbę elementów, które mają być włączone do heterologicznego kwasu nukleinowego, który jest przenoszony/wprowadzany do komórki gospodarza. Na przykład, można stosować locus insercji, które już zapewnia promotor i miejsce poli-a (egzogenne lub endogenne) tak, że tylko 2 pozostałe elementy (np. polinukleotyd kodujący produkt będący przedmiotem zainteresowania i polinukleotyd kodujący enzym DHFR) należy przenieść/transfekować do komórki gospodarza. Wykonania odpowiedniego wektora ekspresyjnego lub kombinacji wektorów ekspresyjnych